实时荧光PCR技术

1、2021/3/111 实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的原理及应用技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 2021/3/112 讲讲 座座 提提 纲纲 q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍 q q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍 q 实时荧光定量技术的应用实时荧光定量技术的应用 2021/3/113 实时荧光定量实时荧光定量PCR定义定义 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧

2、光基团，利用荧，利用荧 光信号累积光信号累积实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，最后通进程，最后通 过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 2021/3/114 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 实时原实时原 理理 常常 规规 PCRPCR技术：技术： 对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物进行定量和定性分析进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时 检测检测 实时定量实时定量PCRPCR技术：技术： 利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCR

3、PCR扩增反应扩增反应 中中每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化，通过，通过CtCt值值和标和标 准曲线的分析对准曲线的分析对起始模板起始模板进行进行定量分析定量分析 2021/3/115 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理定量原理原理定量原理 介绍三个概念：介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt 值值 如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？ 通过通过Ct值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分进行定量分 析析 2021/3/116 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 扩增曲扩增曲 线线 扩增曲线图：扩增曲线

4、图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光 强度 每个循环进行一次荧光信号的收集 荧光基团荧光基团 荧光检测元件荧光检测元件 2021/3/117 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -荧光阈值荧光阈值 荧光信号阈值荧光信号阈值 （threshold threshold ）： q 前15个循环信号作为荧光本底信号 （baseline），即样本的荧光背景值和 阴性对照的荧光值 q 荧光域值的缺省设置是315个循 环的荧光信号的标准偏差的10倍 q 手动 设置：原则要大于样本的荧光 背景值和阴性对照的荧光最高值，同 时要尽量选择进入指数期的最初阶段， 并且保证回归系数大于0

5、.99 q 真正的信号:荧光信号超过域值 2021/3/118 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值 CtCt值的定义值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定 的阈值时所经过的扩增循环次数 C(t) value 2021/3/119 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值的重现 性 横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数 纵轴：荧光信号量纵轴：荧光信号量 CtCt值的特点值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性 2021/3/1110 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 定量原理

6、定量原理 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 2021/3/1111 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 标准曲线标准曲线 q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越 小 q Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标 准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中 所含的模板量 2021/3/1112 Sample 实时荧光定量PCR原理 绝对定 量 25 2021/3/1113 讲讲 座座 提提 纲纲 q

7、 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍 q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用 q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍 q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用 2021/3/1114 非特异性荧光标记：非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记：特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原

8、理原理 - DNA - DNA 产物的荧光产物的荧光 标记标记 2021/3/1115 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 1 -1 -SYBR Green 法 SYBR Green 2021/3/1116 SYBR Green 法 工作机 理 q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 q 变性时，DNA双链分开，无荧光 q 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光， 在此阶段采集荧光信号。 SYBR Green 2021/3/1117 53 53 SG No Emission SG SG

9、 SG ExcitationExcitation SG SG SGSGSG SGSG 53 53 Emission ExcitationExcitation 2021/3/1118 温度温度 荧光强度荧光强度 Tm 2021/3/1119 -dI dT Tm 2021/3/1120 SYBR Green SYBR Green 法法 融解曲线分析融解曲线分析 融解曲线分析，单一 峰 无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析，出现杂 峰 其他产物出现非特异性 荧光，因此定量不准确 非特异性产非特异性产 物物 2021/3/1121 Cycle number Flourescenc Ck 102 Ck

10、 104 Sample Cycle number Log of DNA concentration SYBR Green 法 定量原理 q 模板DNA量越多，荧光达 到域值的循环数越少 q Log浓度与循环数呈线性关 系，根据样品Ct值，就可以计 算出样品中所含的模板量 2021/3/1122 SYBR Green 法 -PCR反应的建立 反应体系的建立及优化: SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太 弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 反应Buffer 体系的优化 反

11、应温度和时间参数:由酶和引物决定 1.其他与常规PCR相同 2021/3/1123 SYBR Green SYBR Green 法法 应用范围应用范围 q 起始模板的测定 q 基因型的分析 q 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对 常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以 区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产 物。 2021/3/1124 SYBR Green SYBR Green 法法 优缺优缺 点点 q 对DNA模板没有选择性 -适用于任何DNA q 使用方便 -不必设计复杂探针 q 非常灵敏 q 便宜 优 点 q 容易与非特异性双链DNA 结合，产生假阳性 但可以通

12、过融解曲线的分 析，优化反应条件 q 对引物特异性要求较高 缺 点 2021/3/1125 与目标序列互补 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法2 -TaqMan2 -TaqMan 法法 TaqMan-水解型杂交探针 v 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 v 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) v 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧 光 v Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针 2021/3/1126 TaqManTaqMan法法 工作原工作原 理理 每扩增一条DNA 分子，释放一个 荧光信

13、号，可以 在循环过程中任 一点检测荧光 2021/3/1127 TaqMan TaqMan 法法 PCRPCR反应的建立反应的建立 1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定： 一般为：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ，45 S， 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相同

14、2021/3/1128 TaqManTaqMan法法 优缺点优缺点 q 对目标序列的高特异性 -阴性结果确定 q 设计相对简单 -与目标序列某一区 域互补 q重复性比较好 优 点 q 只适合一个特定的目标 q 委托公司标记，价格 较高 q 不易找到本底低的探 针 缺 点 2021/3/1129 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 3- Molecular beacon 3- Molecular beacon 法法( (分子分子 信标信标) ) 标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成 环 茎 荧光素 淬灭剂 发夹型杂交探针发夹型杂交探针 2021/3/1130

15、Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分子信标) ) 工作原工作原 理理 q 荧光共振能量转移（FRET） q 探针与DNA杂交时产生荧光 -变性过程：产生非特异性荧光 -延伸过程：不产生荧光 -退火过程：产生特异性荧光，检测荧光 信号 2021/3/1131 Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分子信标) ) 应用范应用范 围围 q 起始模板的定量 q 基因型分析 q 产物鉴定 q SNP（单核苷酸多态性）分析 2021/3/1132 Molecular beacon (Molecular beacon (

16、分子信标分子信标) ) 优优 缺点缺点 q高特异性：高特异性：对目标 序列 检测SNP最灵敏的试 剂之一 q荧光背景低荧光背景低 优 点 q 只能用于一个特 定目标 q 设计困难 q 价格比较高 缺 点 2021/3/1133 讲讲 座座 提提 纲纲 q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍 q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用 q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍 q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPC

17、R实验设计及应用实验设计及应用 2021/3/1134 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 标准样标准样 品品 相对定量中的内标相对定量中的内标 内标通常是内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素 影响小影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量 绝对定量的标准样品：绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒已知拷贝数的质粒DNA DNA 2021/3/1135 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 标准样品

18、标准样品 用于生成标准曲线的样品如何设定？用于生成标准曲线的样品如何设定？ 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 含有和待测样品相同扩增片段的含有和待测样品相同扩增片段的cDNAcDNA 紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度 根据质粒或根据质粒或cDNAcDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀分子量换算成拷贝数，做系列稀 释释 2021/3/1136 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 定量方定量方 法法 q 绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用 到标准曲线到标准曲线 q 相对定量

19、确定经过不同处理的样本目标转录本之相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之 间基因的表达差异（不同时相）间基因的表达差异（不同时相） 2021/3/1137 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 绝对定量绝对定量 方法方法 2021/3/1138 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 TaqManTaqMan法举法举 例例 2021/3/1139 TaqMan TaqMan法举例法举例 标记探标记探 针针 使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量 q FamFam标记目标基因探针标记目标基因探针 q VIC VIC标记看家基因探针标记看家基因探针 2021/3/1140 TaqMa

20、nTaqMan法举例法举例 材料准材料准 备备 q从正常乳腺组织中提取的从正常乳腺组织中提取的总总 RNA RNA q从乳腺癌组织中提取的从乳腺癌组织中提取的 总总RNARNA q含含 ERBB2 and GAPDH ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准的质粒用于生成标准 曲线曲线 q单双通道同时进行，独立分析单双通道同时进行，独立分析 2021/3/1141 TaqManTaqMan法举例法举例 癌症标记物癌症标记物 表达表达 Color 2 - VIC detection for GAPDH Color 1 FAM detection for ERBB2 2021/3/1142 TaqManTaqM