实验一蛋白质的定量测定

1、实验一 蛋白质的定量测定 Folin-酚试剂法(Lowry法) 实验室规则实验室规则 一、学生必须服从老师的指导，按照实验目的、要求和方法做好充分准备，一、学生必须服从老师的指导，按照实验目的、要求和方法做好充分准备， 进行实验。进行实验。 二、保持实验室内安静、整洁，有秩序地进行工作。二、保持实验室内安静、整洁，有秩序地进行工作。 三、按照操作规程三、按照操作规程( (规则规则) )进行实验，正确地据实将实验数据等情况填写在规进行实验，正确地据实将实验数据等情况填写在规 定的记录本上。定的记录本上。 四、节约实验材料和水电，按规定的数量取用原料和试剂。四、节约实验材料和水电，按规定的数量取用

2、原料和试剂。 五、爱护仪器设备，实验完毕时，负责清洗干净，并按规定要求存放原处；五、爱护仪器设备，实验完毕时，负责清洗干净，并按规定要求存放原处； 仪器设备如有损坏，应立即报告老师，同时向管理人员说明情况，按规定仪器设备如有损坏，应立即报告老师，同时向管理人员说明情况，按规定 办好报损或赔偿手续。办好报损或赔偿手续。 六、实验室内严禁吸烟，不准带入食品，不准会客。六、实验室内严禁吸烟，不准带入食品，不准会客。 七、不遵守实验室规则的应给予批评教育；对于严重违反操作规程并造成重七、不遵守实验室规则的应给予批评教育；对于严重违反操作规程并造成重 大损失者，除赔偿损失外，并视情节轻重给予必要的纪律处

3、分，直至追究大损失者，除赔偿损失外，并视情节轻重给予必要的纪律处分，直至追究 法律责任。法律责任。 实验报告的书写实验报告的书写 实验报告是对实验结果的科学总结。书写实验报告是培养和提实验报告是对实验结果的科学总结。书写实验报告是培养和提 高文字表达能力高文字表达能力 及概括综合分析问题能力的重要训练方法。每次实验后要求写及概括综合分析问题能力的重要训练方法。每次实验后要求写 好实验报告。实验报告的书写要求结构完整、条理分明、文好实验报告。实验报告的书写要求结构完整、条理分明、文 字简炼、书写工整、措词推理符合科学性、逻辑性。具体格字简炼、书写工整、措词推理符合科学性、逻辑性。具体格 式如下：

4、式如下： 1 1实验名称实验名称 姓名姓名 学号学号 班级班级 2 2目的要求目的要求 3. 3. 原理原理 4. 4. 主要试剂和仪器主要试剂和仪器 5 5操作方法：操作方法： 6 6实验结果：是实验报告的重要部分，一般要列出经过归纳实验结果：是实验报告的重要部分，一般要列出经过归纳 整理的结果，并将实验数据列表说明，若为图形资料，应做整理的结果，并将实验数据列表说明，若为图形资料，应做 好标记及剪贴。好标记及剪贴。 7 7讨论：要针对实验中所观察到的现象与结果而言，注意不讨论：要针对实验中所观察到的现象与结果而言，注意不 要离开实验的实际去空谈理论或照抄书本。要判断结果是否要离开实验的实际

5、去空谈理论或照抄书本。要判断结果是否 为预期的，属于非预期的，要认真分析原因。为预期的，属于非预期的，要认真分析原因。 1学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理 和方法。 2制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质 含量。 一目的要求 微量凯氏定氮法 含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二 元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则变成氨，氨 又与硫酸作用，变成硫酸氨。此过程通常称为 “消化”。强碱使硫酸铵分解游离出氨，借蒸汽 将氨蒸至酸液中，根据此过量酸液中和的程度， 计算样品的含氮量。 本法适用范围0.2-1.0mg氮，相对误差应小于2%。 蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共蛋白质分子中酪氨酸

6、和色氨酸残基的苯环含有共 轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸 收高峰在收高峰在280 nm280 nm波长处。紫外吸收法在蛋白质含波长处。紫外吸收法在蛋白质含 量量20-10020-100 g/ml内服从比尔定律。内服从比尔定律。 在碱性条件下在碱性条件下, ,具有两个以上肽键的物质能与双缩脲试剂具有两个以上肽键的物质能与双缩脲试剂 的铜离子（的铜离子（CuCu2+ 2+）作用，形成紫色络合物（该物质的分 ）作用，形成紫色络合物（该物质的分 子结构式见图），颜色深浅与肽键的多少即蛋白质含量子结构式见图），颜色深浅与肽键的多少即蛋白质含量 成正比

7、。成正比。 由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此 也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应。也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应。 通常可用此法来定性鉴定蛋白质的存在。通常可用此法来定性鉴定蛋白质的存在。 也可根据反应生成颜色的深浅，在也可根据反应生成颜色的深浅，在540nm540nm波长处进行比色，波长处进行比色， 定量测定蛋白质的浓度。定量测定蛋白质的浓度。 允许测定范围为允许测定范围为1 110 mg10 mg蛋白质。蛋白质。 除除-CO-NH-CO-NH-有此反应外，（有此反应外，（-CONH2-CONH2-）、（）、

8、（-CH2-CH2-）、（）、（- - NH2-NH2-）、（）、（-CS-CS-NH2-CS-CS-NH2）等基团亦有此反应。）等基团亦有此反应。 2021-7-18Biochemistry Experiments12 可检测的最低蛋白质量达5 g/ml，通常测定 范围是25250 g/ml 1 1 器材器材 1 1 试管及试管架试管及试管架 2 2 移液管移液管(5 (5、1 1、0.5ml)0.5ml)、移液枪（、移液枪（0.2ml,0.2ml,用于样品蛋白质）用于样品蛋白质） 3 7223 722型分光光度计型分光光度计 4 4 电热恒温水浴电热恒温水浴 三 试剂与器材 2 2 试剂试

9、剂 1 1 标准酪蛋白溶液：标准酪蛋白溶液：500g500gmlml的标准酪蛋白溶液。的标准酪蛋白溶液。 2 Fo1in2 Fo1in酚试剂甲酚试剂甲 3 Fo1in3 Fo1in酚试剂乙酚试剂乙 4 4 血清：稀释血清：稀释100100倍。倍。 Folin-Folin-甲由下述四种溶液配制甲由下述四种溶液配制 (1)4(1)4碳酸钠溶液；碳酸钠溶液； (2)0.2N(2)0.2N氢氧化钠溶液；氢氧化钠溶液； (3)1(3)1硫酸铜硫酸铜(CuS0(CuS04 45 H5 H2 20) 0)溶液；溶液； (4)2(4)2酒石酸钾钠溶液。酒石酸钾钠溶液。 在使用前，将在使用前，将(1)(1)与与

10、(2)(2)等体积混合配成碳酸钠等体积混合配成碳酸钠氢氧化钠溶液，将氢氧化钠溶液，将(3)(3) 与与(4)(4)等体积混合配成硫酸铜等体积混合配成硫酸铜酒石酸钾钠溶液。然后，将这两种酒石酸钾钠溶液。然后，将这两种 溶液按溶液按50:150:1的比例混合，即为的比例混合，即为Fo1inFo1in酚试剂甲。该试剂只能用一酚试剂甲。该试剂只能用一 天，过期失效天，过期失效。 Folin-Folin-乙乙 在在2000ml2000ml的磨口廻流装置内加入钨酸钠的磨口廻流装置内加入钨酸钠(Na2WO42 H20)100g(Na2WO42 H20)100g，钼酸，钼酸 钠钠(Na2MoO42 H20)2

11、5g(Na2MoO42 H20)25g，蒸馏水，蒸馏水700ml700ml，8585磷酸磷酸50ml50ml和浓盐酸和浓盐酸 100ml100ml，充分混合后，以小火廻流，充分混合后，以小火廻流10h10h。再加入硫酸锂。再加入硫酸锂(LiSO4)150g(LiSO4)150g，蒸，蒸 馏水馏水50ml50ml及数滴液体溴。然后，开口继续沸腾及数滴液体溴。然后，开口继续沸腾15min15min，以驱除过量的，以驱除过量的 溴。冷却后定容到溴。冷却后定容到1000ml1000ml，过滤，滤液呈绿色。，过滤，滤液呈绿色。 反应物反应物 (ml) 0（空白对（空白对 照管）照管） 12345 蛋白质

12、标准溶液蛋白质标准溶液 (500g/ml) 00.20.30.40.60.8 蒸馏水蒸馏水 ml1.00.80.70.60.40.2 Folin-酚甲酚甲ml5.05.05.05.05.05.0 Folin-酚乙酚乙ml0.50.50.50.50.50.5 A (640nm) 蛋白质浓度蛋白质浓度 (g/ml)030456090120 混匀后混匀后3030度水浴锅中放置度水浴锅中放置10 min10 min 取6支试管 加加FolinFolin乙后立即摇匀，室温下放置乙后立即摇匀，室温下放置3030分钟后以分钟后以0 0号试管为空白对照，在号试管为空白对照，在 640nm640nm处比色处比色

13、 1.标准曲线的制作 制作标准曲线：以制作标准曲线：以A A640 640为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标 为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标 标准蛋白浓度标准蛋白浓度= =标准液标准液(mL)(mL)标准液浓度（标准液浓度（500500g/mlg/ml）/1.0/1.0 取取2 2支试管，各加入一定量的血清稀释液支试管，各加入一定量的血清稀释液( (已经稀已经稀 释释100100倍，其蛋白质含量在酪蛋白标准曲线范围倍，其蛋白质含量在酪蛋白标准曲线范围 之内之内) )，本实验取，本实验取0.2ml0.2ml血清稀释液，再加入血清稀释液，再加入 0.8ml0.8ml蒸馏水使样品体积达到蒸馏水使样品体积

14、达到lmllml。其他操作与。其他操作与 “标准曲线的制作标准曲线的制作”相同。相同。 2. 2.血清蛋白质浓度的测定血清蛋白质浓度的测定 反应物反应物 (ml) 0（空白对（空白对 照管）照管） 12 血清稀释液血清稀释液 (已经稀已经稀 释释100倍倍) 00.20.2 蒸馏水蒸馏水 ml1.00.80.8 Folin-酚甲酚甲ml5.05.05.0 Folin-酚乙酚乙ml0.50.50.5 A (640nm) 蛋白质浓度蛋白质浓度 (mg/L)0 加加FolinFolin乙后乙后立即摇匀，立即摇匀，3030分钟后以分钟后以0 0号试管为空白对照，在号试管为空白对照，在640nm640nm处比色处比色 3、数据处理 1、绘制标准曲线：以A500为纵坐标，标准蛋白含 量为横坐标，在坐标纸上或用EXCEL绘制标准曲线。 2、计算特测蛋白浓度：用待测蛋白质的A500从标 准曲线上查出其对应的蛋白含量，据实验中所加 入的待测蛋白质的体积计算其浓度。 100 10 100/ (g