分子生物学实验(生技生科)下游-2017

1、分分 子子 生生 物物 学学 实实 验下验下 专业：生物科学专业：生物科学 生物技术生物技术 实验流程一实验流程一 实验安排实验安排 准备材料：重组工程菌目标蛋白的表达准备材料：重组工程菌目标蛋白的表达 第第1次次 菌体超声破壁、离心、包涵体复性、装菌体超声破壁、离心、包涵体复性、装 离子交换柱离子交换柱 第第2次次 测酶活、定蛋白、测酶活、定蛋白、 离子交换层析离子交换层析 第第3次次 亲和柱层析，并对收集样亲和柱层析，并对收集样 品进行测活、定蛋白等品进行测活、定蛋白等 第第4次次 对分离纯化各样品进行蛋白电泳分析对分离纯化各样品进行蛋白电泳分析 第第5次次 Western blottin

2、g， 绘出分离纯化表绘出分离纯化表 绘制包涵体复性曲线绘制包涵体复性曲线 实验操作实验操作 第第1次：次： 菌体超声破壁、离心、包涵体复性、装离子交换柱菌体超声破壁、离心、包涵体复性、装离子交换柱 实验顺序：实验顺序：超声破壁超声破壁-离心（洗涤，注意平衡）离心（洗涤，注意平衡）-装柱装柱 -平衡平衡-包涵体溶解（包涵体溶解（2hr） -复性复性-测活测活 涉及单元实验：涉及单元实验：破壁破壁、离心离心、装柱装柱、复性、酶活测定复性、酶活测定 掌握要点：破壁原理掌握要点：破壁原理 装离子交换柱方法装离子交换柱方法 包涵体复性原理及方法包涵体复性原理及方法 脂肪酶测活原理脂肪酶测活原理 O- O

3、- O- O P NO2 Na+ Na+ 对硝基苯酚磷酸酯对硝基苯酚磷酸酯 p-NPP 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 对硝基苯酚对硝基苯酚 p-NP NO2 OH 酯酶测活原理酯酶测活原理 以对硝基酚磷酸二钠为底物，根据水解磷酯键所产生的对以对硝基酚磷酸二钠为底物，根据水解磷酯键所产生的对 硝基酚量测定酶活力。在硝基酚量测定酶活力。在3737、pH10.0pH10.0条件下，每分钟转条件下，每分钟转 化产生化产生1mol/L1mol/L对硝基酚的酶量为对硝基酚的酶量为1 1个酶单位个酶单位 每每10秒记一个数（秒记一个数（0、10、20、120） 将时间及其对应的将时间及其对应的A405导入导入EXC

4、EL文档中，文档中， 做时间做时间tA405曲线，得到斜率，曲线，得到斜率， 用公式：用公式：酶活酶活=（OD405-自分解）自分解）*18231.26*稀释倍数稀释倍数 （此处为（此处为1000）（）（u/ml） （注：注：OD405为曲线斜率、为曲线斜率、自分解为如果底物未分解（无黄色），视为自分解为如果底物未分解（无黄色），视为0， 否则需要将底物以否则需要将底物以KPB为对照进行标定为对照进行标定） 定量测活与定性测活定量测活与定性测活 （2分钟测一个点）分钟测一个点） 对每个收集管进行对每个收集管进行A280A280与酶活力定性测定与酶活力定性测定 酶标定性测活酶标定性测活 每组一条

5、酶标版（每组一条酶标版（8孔孔 单位单位 uL） 孔号12345678 破碎 上清 原液 原液 稀释 10倍 原液 稀释 100倍 原液 稀释 1000 倍 原液 稀释 10000 倍 包涵 体复 兴液 空白 对照 无 KPB （磷 酸缓 冲液） 174174174174174174194 酶液2020202020200 底物6666666 底物留待即将酶标测定时加底物留待即将酶标测定时加 实验实验1次序安排次序安排 1 1 超声离心保留上清超声离心保留上清 沉淀沉淀洗涤离心洗涤离心 - - 保留沉淀保留沉淀 2 2 包涵体溶解包涵体溶解复性复性-放置冰箱，每次实验测活放置冰箱，每次实验测活

6、3 3 洗柱、装柱洗柱、装柱 ：水：水 1 1：1 1介质介质 平衡平衡50-100 ml50-100 ml 4 4 洗试管，自然倒扣晾干（纸巾垫）洗试管，自然倒扣晾干（纸巾垫） 5 5 注意留样注意留样! !（上清（上清0.5ml -200.5ml -20度保存）度保存） 注意标清组号！注意标清组号！ 6 登记测活数据（老师本子）登记测活数据（老师本子） 8 8 值日：值日： A A室、室、B B室室 （2 2组组/ /次）次） 公用台物品不得挪用公用台物品不得挪用 桌面整齐桌面整齐 出席率出席率- -平时分！平时分！ 冰箱分配冰箱分配 测活次序测活次序 上午定性测活！上午定性测活！ 实验二

7、内容实验二内容 对上一次制备的上清液（8ml8ml）/2/2 进行离子交 换层析 样品活性分析及蛋白浓度测定蛋白浓度测定 绘制纯化表 纯度分析 (蛋白电泳) 蛋白质分离纯化方法蛋白质分离纯化方法 离子交换离子交换 凝胶过滤凝胶过滤 亲和层析亲和层析 疏水层析疏水层析 凝胶过滤的工作原理凝胶过滤的工作原理 离子交换层析离子交换层析 蛋白质是两性电解质蛋白质是两性电解质 可解离基团：可解离基团： - -氨基，氨基， - -羧基，侧链羧基，侧链R R 基团基团 蛋白质等电点：在某一蛋白质等电点：在某一pHpH值，蛋白所带值，蛋白所带 正负电荷相等，即净电荷为零时溶液的正负电荷相等，即净电荷为零时溶液

8、的 pHpH称为该蛋白等电点称为该蛋白等电点 离子交换层析离子交换层析 柱层析程序： 装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱、合并样品 种类：种类： O OCH2CH2CH2CH2N+N+(CH2CH3)3(CH2CH3)3 二乙基氨基乙基纤维素（二乙基氨基乙基纤维素（DEAEDEAE） 葡聚糖葡聚糖 琼脂糖琼脂糖 纤维素纤维素 离子交换层析的洗脱过程示意离子交换层析的洗脱过程示意 离子强度梯度：通过不断增加离子强度，吸附到 交换剂上的物质根据其静电引力的大小而不断竞 争性的解脱 pH梯度：当pH梯度接近各样品离子的等电点时， 该物质就被解脱 连续的（称梯度洗脱），不连续的（称阶段洗脱） 待分离物质洗脱

9、时常用的两种方法待分离物质洗脱时常用的两种方法 实验设计实验设计 离子交换原理离子交换原理 离子交换层析根据化合物的净电荷进行离子交换层析根据化合物的净电荷进行 分离分离 ？应该选用哪种层析介质？应该选用哪种层析介质 ？pHpH如何选择如何选择 吸附条件及最佳吸附条件吸附条件及最佳吸附条件 ? ? 平衡判断的标准平衡判断的标准 操作手册？操作手册？ 实验二内容实验二内容 对上一次制备的上清液（8ml8ml）/2/2 进行离子交 换层析 样品活性分析及蛋白浓度测定蛋白浓度测定 绘制纯化表 纯度分析 (蛋白电泳) 层析操作一般过程 装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱、合并样品装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱

10、、合并样品 上样前后样品活性样品活性测定-当天测定 上样前后蛋白浓度蛋白浓度测定-最后一天测定 上样前后样品体积样品体积测定-当天测定 步骤步骤总体积总体积 （ml） 蛋白浓度蛋白浓度 （mg/ml） 蛋白总量蛋白总量 （mg） 酶浓度酶浓度 （U/ml） 比活力比活力 （U/mg蛋白）蛋白） 总活力总活力 （U） 产率产率 （）（） 提纯提纯 倍数倍数 粗无细胞抽提液粗无细胞抽提液1000121200050.41650001001.00 50 C热变性除杂蛋白热变性除杂蛋白1000880004.80.604800961.44 硫酸铵分级硫酸铵分级30-50饱和度饱和度 沉淀部分沉淀部分 25

11、0375011.03.672730558.83 DEAE-凝胶层析，凝胶层析，pH梯度第梯度第 50-60管（管（5ml/管）经透析、管）经透析、 浓缩浓缩 259225889.822004423.6 DEAE-纤维素纤维素KCl梯度，第梯度，第 21-31管（管（2ml/管）经透析、管）经透析、 浓缩浓缩 573536452182036.4125 凝胶过滤葡聚糖凝胶凝胶过滤葡聚糖凝胶G-100 第第31-40管（管（1ml/管）合并管）合并 100.929.2170185170034444 羟基磷灰石层析，磷酸盐梯羟基磷灰石层析，磷酸盐梯 度，第度，第15-18管（管（1ml/管）合管）合

12、并并 40.7533755001500301200 蛋白纯化过程分析 纯化过程评价指标 纯度检测方法 柱效的初步判断： OD280曲线和OD405曲线的重叠与纯化效果 A瓶 0 N NaCl 100ml B瓶 1 N NaCl 100ml 1)1)在梯度洗脱仪中的洗脱瓶在梯度洗脱仪中的洗脱瓶A A（混合器）和洗脱瓶（混合器）和洗脱瓶B B（贮存器）（贮存器） 内各装入内各装入100100毫升缓冲液毫升缓冲液和缓冲液和缓冲液（注意加溶液的方法），（注意加溶液的方法）， 注意液面应处于同一水平面，同时应排除连接管内的气泡注意液面应处于同一水平面，同时应排除连接管内的气泡 2) 2) 开动梯度洗脱仪

13、中的电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以开动梯度洗脱仪中的电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以 混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜 3) 3) 将洗脱瓶将洗脱瓶A A、洗脱瓶、洗脱瓶B B与层析柱上端连接管道打开，同时将与层析柱上端连接管道打开，同时将 层析柱下端接收样品层析柱下端接收样品 4)4)控制洗脱流速，收集洗脱流出液约控制洗脱流速，收集洗脱流出液约2020管（管（3 3毫升毫升/ /管），管）， 编号！编号！ 操作要点操作要点 同一凝胶柱在不同流速下的洗脱曲线：同一凝胶柱在不同流速下的洗脱曲线： 较快的流速下得到的冼脱峰也宽较快的流速下得到的冼脱峰也宽 流速

14、低洗脱峰窄而高流速低洗脱峰窄而高-分辨率较高，样品分辨率较高，样品 稀释较少稀释较少 流速对洗脱曲线的影响流速对洗脱曲线的影响 实验实验2次序安排次序安排 1 1 上样（稀释一倍左右）速度要慢！洗涤（上样（稀释一倍左右）速度要慢！洗涤（202030ml30ml左右）左右） 安装梯度洗脱装置安装梯度洗脱装置 200mlbuffer200mlbuffer于左侧瓶，平衡后关闭通道，左侧加于左侧瓶，平衡后关闭通道，左侧加6gNaCl6gNaCl，然然 后进行梯度洗脱，（注意流速！后进行梯度洗脱，（注意流速！1d/51d/5秒秒 5 5分分/ /管），管），试管编号！试管编号！ 定性定性测活及测活及OD

15、OD280 280，注意： ，注意：酶活最高管留样酶活最高管留样100ul100ul！将有酶活试将有酶活试 管合并，精确测活管合并，精确测活 酶液上清合并液酶液上清合并液留样留样0.5ml(0.5ml(上清液上清液) )用于分析，其余量好体积用于分析，其余量好体积 登记数据（上样前后精确测酶活性，体积）登记数据（上样前后精确测酶活性，体积） 定性测活和定量测活定性测活和定量测活 定性测蛋白和定量测蛋白定性测蛋白和定量测蛋白 ！ 留样？ 实验操作实验操作 第第2 次：次： 测酶活、测酶活、定蛋白、定蛋白、 离子交换层析分析离子交换层析分析 实验顺序：离心实验顺序：离心/ /留样留样/ /量体积！

16、量体积！-上柱上柱-定蛋白定蛋白-紫外吸收紫外吸收 测蛋白峰、测蛋白峰、 酶活曲线测定酶活曲线测定-收集样品收集样品/ /留样留样/量体积！量体积！ 涉及单元实验：测酶活、定蛋白、离子交换层析涉及单元实验：测酶活、定蛋白、离子交换层析 掌握要点：紫外吸收法绘蛋白浓度曲线方法掌握要点：紫外吸收法绘蛋白浓度曲线方法 离子交换层析原理及方法离子交换层析原理及方法 BSBS100100自动部分收集器安装圈自动部分收集器安装圈 1反全阀；2换管臂；3滴管；4，5换管臂固定螺丝；6.竖杆；7.竖杆囤定 螓丝；8报警板；9.试管；10收集盘；11.时间选挥旋钮；12.时间选择固定 螺钉；13自动开关；14、

17、指示灯；15.电源开关；16换向开关（逆、 顺）；17手动开关 实验操作实验操作 第第3次：次：粗酶样品制备，粗酶样品制备，亲和层析，并对收集样品进行分析亲和层析，并对收集样品进行分析 实验顺序：实验顺序：亲和层析亲和层析 -紫外吸收测蛋白峰紫外吸收测蛋白峰 -酶活曲线测定酶活曲线测定(3(3管管)-)-考马斯亮蓝法定蛋白考马斯亮蓝法定蛋白 涉及单元实验：涉及单元实验：破壁破壁、离心离心、装柱装柱、层析层析、分析、留样、分析、留样 掌握要点：掌握要点：亲和层析亲和层析原理和操作原理和操作 亲和层析亲和层析 合并液量体积、精确测活、合并液量体积、精确测活、定蛋白定蛋白 计算比活、纯化倍数、计算比

18、活、纯化倍数、回收率（登记数据）回收率（登记数据） 镍柱纯化实验流程镍柱纯化实验流程 一一上清液测活上清液测活 二二NiNi柱纯化步骤：柱纯化步骤： 装柱装柱: :清洗玻璃柱，连接好橡皮管，将层析柱安装到铁架清洗玻璃柱，连接好橡皮管，将层析柱安装到铁架 台上向柱内加入台上向柱内加入1-2ml 1-2ml 蒸馏水，再加蒸馏水，再加1-2ml 1-2ml 镍柱介质镍柱介质 （助教完成）（助教完成） 平衡平衡: :先用水先用水15-20ml15-20ml洗介质洗介质, ,再用再用5-10ml5-10ml 平衡液（实验平衡液（实验 台上台上20mM Tris 20mM Tris pH8.0pH8.0）

19、平衡柱子）平衡柱子( (流速慢流速慢!)!)。平衡液。平衡液 沿柱内壁缓慢加入沿柱内壁缓慢加入 上样上样: :取取3ml3ml上清液上样，上样过程中的穿出夜收集起来，上清液上样，上样过程中的穿出夜收集起来， 再重新上样，如此再重新上样，如此循环循环3 3次！（流穿液测活）次！（流穿液测活） 洗涤洗涤: :上样完成之后，用上样完成之后，用3-5ml3-5ml洗涤液（实验台上洗涤液（实验台上10mM 10mM Tris pH8Tris pH8，50mM 50mM 咪唑）洗去没有结合的蛋白咪唑）洗去没有结合的蛋白（洗涤液（洗涤液 测活）测活） 洗脱洗脱: :用用3ml3ml洗脱液（实验台上洗脱液（实

20、验台上10mM Tris pH810mM Tris pH8，300mM 300mM 咪咪 唑）洗脱目标蛋白。唑）洗脱目标蛋白。1ml/1ml/管管，收集收集3-53-5管管。各管洗脱液各管洗脱液 测活。测活。 三三复性液测活复性液测活 各样品测活、测蛋白稀释倍数及加样量参考表各样品测活、测蛋白稀释倍数及加样量参考表 待测液测酶活待测液测酶活 DEAEDEAE离子交换离子交换: :上清液上样稀释上清液上样稀释500-1000500-1000倍倍 复性液复性液: :直接测活直接测活 DEAEDEAE洗脱合并液洗脱合并液: : Ni-NTANi-NTA上清液上清液: :稀释稀释250-500250-

21、500倍测活倍测活 实验操作实验操作 第第4-5次：次：对分离纯化各样品进行蛋白电泳分析对分离纯化各样品进行蛋白电泳分析/ /Western bloting ， 绘出分离纯化表绘出分离纯化表 实验顺序：实验顺序：蛋白电泳，同时进行数据分析蛋白电泳，同时进行数据分析 涉及单元实验：涉及单元实验：蛋白电泳蛋白电泳 掌握要点：掌握掌握要点：掌握蛋白电泳方法及蛋白电泳方法及/Western bloting 了解分离纯化样品纯度鉴定的各种方法了解分离纯化样品纯度鉴定的各种方法 绘制酶的分离纯化表绘制酶的分离纯化表 1.1. 包涵体复性上样液包涵体复性上样液 2.2. 上清上样液（上清上样液（Ni柱沉淀柱

22、沉淀） 3. DE3. DE管活性最高管管活性最高管 4 Ni4 Ni柱洗脱活性最高管柱洗脱活性最高管 5. Mark5. Mark（蛋白电泳位置蛋白电泳位置） 6.6. 7.7. 8.8. 9. 9. 1010 点样量：点样量：20ul20ul样品样品 （不足用（不足用bufferbuffer补足）补足） 20ulloadingbuffer20ulloadingbuffer 煮沸煮沸3 3分钟，离心分钟，离心 NiNi柱点样：上清（柱点样：上清（1/31/3量）量） 、洗脱、洗脱 WestenWesten电泳位置！电泳位置！ Mark Mark 点在最边上，点在最边上，并空行，用于染色并空行

23、，用于染色 要求点两块板，顺序一致！要求点两块板，顺序一致！ 预染预染Mark 样品处理勿忘！样品处理勿忘！ NiNi柱点样：柱点样： NiNi柱洗脱活性最高管柱洗脱活性最高管1-81-8组组 Mark Mark 点在最边上，点在最边上，并空行，用于染色并空行，用于染色 要求点两块板，顺序一致！要求点两块板，顺序一致！ 走电泳时左右方向不能错，走电泳时左右方向不能错， 电泳结束后剪下电泳结束后剪下Mark泳道，氨基黑染色泳道，氨基黑染色 Western blotingWestern bloting 实验目的与原理实验目的与原理 Western blotingWestern bloting技术是

24、用来检测蛋白表达的灵敏方法技术是用来检测蛋白表达的灵敏方法 由蛋白质的由蛋白质的SDS-PAGESDS-PAGE、电转及杂交几部分组成、电转及杂交几部分组成 杂交技术主要有杂交技术主要有NCNC膜封闭，靶蛋白与第一抗体的反应，结合靶蛋膜封闭，靶蛋白与第一抗体的反应，结合靶蛋 白的一抗和二抗的反应，显色等组成白的一抗和二抗的反应，显色等组成 将凝胶上的蛋白质转移到将凝胶上的蛋白质转移到NCNC膜上，用其他蛋白作为封闭液，将膜膜上，用其他蛋白作为封闭液，将膜 上余下的其他蛋白结合位点封闭，加入与检测蛋白特异性结合的上余下的其他蛋白结合位点封闭，加入与检测蛋白特异性结合的 第一抗体，经免疫反应，一抗

25、与靶蛋白结合，经洗膜后，膜上仅第一抗体，经免疫反应，一抗与靶蛋白结合，经洗膜后，膜上仅 在靶蛋白处结合抗体。在靶蛋白处结合抗体。 然后加入与第一抗体有免疫特异性的二抗，使之与一抗反应，反然后加入与第一抗体有免疫特异性的二抗，使之与一抗反应，反 应后经洗膜液洗涤，二抗仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这应后经洗膜液洗涤，二抗仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这 种二抗都为酶标抗体，通过酶显色反应，膜上结合靶蛋白位置即种二抗都为酶标抗体，通过酶显色反应，膜上结合靶蛋白位置即 将呈现一定的颜色将呈现一定的颜色 WESTERN BLOT 从负极从负极(黑孔板黑孔板)到正极到正极(白孔板白孔板)依次为：依次

26、为： 黑孔板黑孔板、凝胶支持纤维垫、滤纸、凝胶、凝胶支持纤维垫、滤纸、凝胶 凝胶支持纤 维垫 滤纸 凝胶支持纤 维垫 膜 滤纸 蛋白凝胶 大小剪裁：大小剪裁： 胶准备：去除浓缩胶，去除一个角以定位，电转胶准备：去除浓缩胶，去除一个角以定位，电转buffer浸浸10min 电转电转12小时小时 电转后用镊子取下膜，在电转后用镊子取下膜，在Mark位置剪下条带，染色位置剪下条带，染色10分钟；分钟； 膜封闭：膜封闭：pH7.5，PBS （含（含5脱脂奶粉），脱脂奶粉），0.1吐温吐温20 冰箱过夜冰箱过夜 洗涤：洗涤： PBS（无（无Milk）洗三遍，每次）洗三遍，每次10分钟分钟 一抗：一抗： 用用PBS （含（含1脱脂奶粉，脱脂奶粉， 0.1吐温吐温20 ）稀释）稀释 1：1