蚕豆病实验设计课件

1、蚕豆病实验设计1 临床十二大班 9人组 2012级本科分子生物学实验设计 蚕豆病实验设计2 蚕豆病实验设计3 案例案例 l患儿，男性，患儿，男性，3 3岁，因面色苍白伴血尿岁，因面色苍白伴血尿1 1天入院。天入院。1 1天前天前 食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样 色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类 似情况。似情况。 l体格检查：体温体格检查：体温3838，脉搏，脉搏150150次次/ /分，呼吸分，呼吸4040次次/ /分，分， 血压血压80/60mmHg80/60mm

2、Hg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白， 皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常， 肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异 常。实验室检查：红细胞常。实验室检查：红细胞 1.981.981012/L1012/L，血红蛋白，血红蛋白 53g/L53g/L，血清总胆红素，血清总胆红素85.585.5mol/Lmol/L，结合胆红素，结合胆红素 13.713.7mol/Lmol/L，未结合胆红素，未结合胆红素71.871.8mol/Lmol/L，尿蛋白，

3、尿蛋白 （+），潜血），潜血(+)(+)，尿胆红素，尿胆红素( () )，尿胆素原，尿胆素原(+)(+)，尿液，尿液 镜下未见红细胞。镜下未见红细胞。 蚕豆病实验设计4 案例分析案例分析 1 1、恶心、呕吐、恶心、呕吐、排尿呈酱油样色排尿呈酱油样色，脸色苍白，脸色苍白， 皮肤及巩膜黄染皮肤及巩膜黄染（伴有溶血性黄疸伴有溶血性黄疸） 2 2、心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无、心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无 叩击痛，神经系统检查未及异常（叩击痛，神经系统检查未及异常（症状不严重症状不严重） 蚕豆病实验设计5 案例分析案例分析 3 3、血象、血象 红细胞红细胞 1.981.981012

4、/L1012/L（）4.05.51012/L 血红蛋白血红蛋白53g/L53g/L（） （110-150G/L ） 血清总胆红素血清总胆红素85.585.5mol/Lmol/L（）1.71-17.1mol/L 4 4、尿常规、尿常规 尿液下尿液下未未见红细胞（见红细胞（红细胞膜已不完整红细胞膜已不完整） 尿胆素原呈尿胆素原呈阳阳性性 蚕豆病实验设计6 轻度轻度 蚕豆病蚕豆病 并伴溶血性黄疸并伴溶血性黄疸 蚕豆病实验设计7 蚕豆病简介蚕豆病简介 l蚕豆病是一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶 （G-6-PD）缺乏所导致的疾病，表 现为在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 （G-6-PD）缺陷的情况下，食用新 鲜蚕

5、豆后突然发生的急性血管内溶血。 l多见于儿童，男性患者约占90%以上。 蚕豆病实验设计8 临床表现临床表现 l早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、 食欲缺乏、腹痛，继之出现黄疸、贫 血、血红蛋白尿，尿呈酱油色，此后 体温升高，倦怠乏力加重，可持续3 日左右。与溶血性贫血出现的同时， 出现呕吐、腹泻和腹痛加剧，肝脏肿 大，肝功能异常，约50%患者脾大。 严重病例可见昏迷、惊厥和急性肾衰 竭，若急救不及时常于12日内死亡。 蚕豆病实验设计9 红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 活性测定（紫外法） 设计实验进一步明确诊断设计实验进一步明确诊断 蚕豆病实验设计10 实验原理实验原理 要检测G6PD的活性，可以

6、检测NADPH生成量 蚕豆病实验设计11 实验原理实验原理 已知：NADPH在340nm的紫外线照射下产生 荧光 即可以每隔2分钟在340nm波长下测定孵育液中 NADPH吸光度 以10min吸光度值的变化（A340）计算 NADPH的产量。 蚕豆病实验设计12 实验原理实验原理 l还原型谷胱甘肽使高铁血红蛋白还原为血红蛋白 2G-SH MHb Hb G-S-S-G NADP+ NADPH 即可以检测血红蛋白的含量 蚕豆病实验设计13 实验器材和试剂实验器材和试剂 1.实验器材 恒温水循环紫外分光光度计，可见分光光度计，离心机。 2.试剂 （1）0.5mol/L Tris-HCl MgCl2缓

7、冲溶液（pH8.0）：称取 Tris12.1g,MgCl26H2O 4.06g,加入160mL蒸馏水溶解，用 HCl调pH至8.0，然后加入蒸馏水至200mL。 （2）2 mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP )：称取 NADP 21.3mg，溶于10mL蒸馏水中。4 可保存20天 左右。 蚕豆病实验设计14 （3）6mmol/L葡萄糖6磷酸二钠(G6PNa2)：称取 21.5mg G6PNa22H2O，溶于10mL蒸馏水中。4 可保 存20天左右。 （4）溶血剂：取巯基乙醇0.1mL，10% EDTA 2.0mL， 6mmol/L NADP 0.4mL，加蒸馏水至总体积200mL。

8、 （5）血红蛋白氧化剂（Drabkin试剂）：称取K3Fe(CN)6 0.2g，KCN 0.052g，NaHCO3 1.0g，加蒸馏水至1000mL， 置棕色瓶内避光保存，可保存20天。 （6）0.9% NaCl，ACD抗凝剂。 实验器材和试剂实验器材和试剂 蚕豆病实验设计15 实验操作流程实验操作流程 l1、洗涤红细胞 取静脉血2.0mL，放入含0.4mLACD抗 凝剂的试管中，混匀。吸取0.2mL抗凝血放入试管中，加 入4mL预冷的生理盐水，轻轻摇匀，2500r/min离心5min, 倾去上清，重复三次。 l2、溶血液的制备 向红细胞沉淀中加入溶血剂2.0mL，震 荡1min，4放置10m

9、in以上。 蚕豆病实验设计16 3、NADPH的测定 取石英比色杯两只，标为“测定”及 “空白”，按下表操作： 试剂体积 蒸馏水（uL） 0.5mol/L Tris-HCl MgCl2缓冲溶液（uL） 6mmol/L G6P-Na2 (uL) 2mmol/L NADP+ (uL) 2040 300 300 300 混匀后放入带恒温水循环（25）的紫外分光 光度计中，预热10min 然后在“测定”中加入溶血液60uL,“空白”中加入 溶血剂60uL，混匀 蚕豆病实验设计17 以“空白”调“0”,1min后开始测340nm吸光度（A340），每 2min纪录吸光度一次，至10min止，比较每2mi

10、nA值的变化情况， 若相近则表明酶促反应平稳。以10minA值的变化（A340）计 算NADPH的产量。 4.溶血液中血红蛋白含量的测定 取试管一支，按下表操作： 试剂体积 Drabkin(mL) 溶血液(mL) 0.3 3.0 混匀，室温放置15min，以Drabkin试剂调零，读取540nm 的吸光度（A540）。 蚕豆病实验设计18 注意事项注意事项 l1.洗涤红细胞时禁止剧烈震荡，避 免溶血。 l2.测定NADPH时读取吸光度的时间 要准确。 蚕豆病实验设计19 结果分析结果分析 l1.NADPH产量的计算 NADPH在340nm处，其每微摩尔的吸光 系数（）为6.220，故10min

11、内NADPH的产量计算公式为： lNADPH产量（mol） = l2.血红蛋白含量的计算 血红蛋白氧化为高铁血红蛋白以后，在 540nm处，其毫摩尔吸光细数（）为44，故溶血液中血红蛋白 的含量计算公式为： l血红蛋白含量（mmol）= 22. 6 340A 44 540A 蚕豆病实验设计20 3.G6PD比活性（U/g Hb）的计算 G6PD比活性单位（U/g Hb） = = 【参考范围】正常值：大于2.8U/gHb 1164500 10001010044 02. 0 1 10 1 22. 6540 340 A A 85.49 540 340 A A 蚕豆病实验设计21 从生化代谢解释患儿的

12、临 床表现和实验室检查结果 生化角度生化角度 蚕豆病实验设计22 实验室检查实验室检查 检查项目检查值正常值 红细胞 1.981012/L 4.05.01012/L 血红蛋白 53g/L 120160g/L 血清总胆红素 85.5mol/L 3.417.1mol/L 结合胆红素 13.7mol/L 总量的20% 未结合胆红素 71.8mol/L 总量的80% 蚕豆病实验设计23 结果导致结果导致 红细胞膜的破坏红细胞膜的破坏 胆色素代谢异常胆色素代谢异常 蚕豆病实验设计24 G6PD 磷酸戊糖途径 NADPH 磷酸戊糖 维持谷胱甘肽的还原性 核酸生物合成原料 红细胞膜的破坏红细胞膜的破坏 蚕豆

13、病实验设计25 谷胱甘肽阻止氧化血红蛋白，从而保护红细 胞膜的完整性，如若缺乏，此时的红细胞易于 破裂 。 NADPH高铁血红蛋白还原酶 GSH MHb Hb 红细胞膜的破坏红细胞膜的破坏 蚕豆病实验设计26 铁卟啉类化合物的降解产物 80%以上来自衰老红细胞破坏所释放的血 红蛋白的分解 自由通过生物膜产生毒性作用 蚕豆病实验设计27 G6PD缺乏缺乏 NADPH严重缺乏 谷胱甘肽难以保持还原状态NADPH高铁血红蛋白还原酶活性低 红细胞膜完整性破坏 红细胞裂解 血红蛋白大量溢出 胆红素生成量增加 Hb大量氧化成MHb，Hb含量减少 蚕豆病实验设计28 具体分析具体分析 皮肤及粘膜黄染皮肤及粘

14、膜黄染 血清总胆红素超过17mol/L即为高胆红素血， 一般若在1734mol/L，临床无明显黄疸， 为隐性黄疸，超过34mol/L则可见皮肤、粘膜 黄染。 血尿血尿 急性溶血时大量红细胞被破坏，其成分从尿液 中排除故出现血尿。 蚕豆病实验设计29 具体分析具体分析 体温升高体温升高 大量溶血，即血红细胞大量破坏，大量的无菌性坏 死物质入血，机体动员白细胞吞噬吸收坏死物质， 导致无菌性炎症，可引起发热，亦称为吸收热。 呼吸加快及心律升高呼吸加快及心律升高 由于急性溶血导致循环血量减少，红细胞减少， 血红蛋白减少，氧气供应相对不足，故机体通过加 快呼吸频率，以及加快心率维持心输出量的相对稳 定以

15、维持机体代谢的供氧。 蚕豆病实验设计30 患者体型瘦小与该病患者体型瘦小与该病 症是否有关，为什么？症是否有关，为什么？ （选答）（选答） 患者体型瘦小与该病症患者体型瘦小与该病症有有关关 蚕豆病实验设计31 蚕豆病是因为体内缺乏蚕豆病是因为体内缺乏G6PD， G6PD主要影响主要影响 体内的磷酸戊糖途径体内的磷酸戊糖途径 该途径主要生成两种重要的该途径主要生成两种重要的 物质即物质即5-磷酸核糖磷酸核糖和和NADPH 5-磷酸核糖影响：磷酸核糖影响： 1：核酸的合成：核酸的合成 2：体内己糖和戊糖的代谢：体内己糖和戊糖的代谢 3：37碳原子糖类物质的相互转化碳原子糖类物质的相互转化 G6PD

16、 蚕豆病实验设计32 NADPH影响：影响： 1 1：体内以NADPH作为供氢体合成多种活性物质如胆 固醇 脂肪酸 和一些非必需氨基酸 2 2： NADPH可作为羟化酶的辅酶，参与体内生物转化 作用 3 3： NADPH参与吞噬细胞的杀菌作用 4 4：维持GSH的正常水平 GSH可以保护体内蛋白质或 酶免遭氧化 使蛋白质或酶处于活性状态 蚕豆病实验设计33 磷酸戊糖途径中生成多余的核糖转变为6-磷酸果糖和3-磷酸甘 油醛进入糖酵解途径，G6PD缺乏使得糖代谢受到影响。脂酸 可以合成甘油三酯，其主要功能是储存和氧化能量，机体难以 合成甘油三酯则消耗原有储备的甘油三酯，使得机体消瘦。同 时体内的一些生物活性物质功能发生障碍，如胆固醇不能直接 氧化但能转化为胆汁酸、类固醇激素 、维生素D3，参与物质 代谢调节，胆汁酸具有促进脂类消化和吸收的作用；维生素D3 主要参与体内血钙和血磷的调节。生物转化作用可以对体内大 部分非营养物质进行代谢转化，或使有毒物质的毒性减低或消 除，增强这些非营养物质的水溶性和极性，从而易于从胆汁或 尿液中排除。 GSH可以保护体内蛋白质或酶免遭氧化 使蛋白 质或酶处