同工酶实验课件

1、同工酶实验1 垂直板聚丙烯酰胺垂直板聚丙烯酰胺 凝胶电泳分离乳酸凝胶电泳分离乳酸 脱氢酶同工酶脱氢酶同工酶 （活性染色鉴定法）（活性染色鉴定法） 同工酶实验2 实验目的实验目的： v理解同工酶的概念及遗传学意义理解同工酶的概念及遗传学意义 v学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 v掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术 v掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色 同工酶实验3 同工酶同工酶 是指能够催化相同的化学反应，但酶分子结构、理化特性乃至免疫 学性质不同的一组酶。它们是由遗传体系决定的在不同组织中表达 的蛋白质作用相同,但分子

2、结构、理化特性等不同。 本实验做的是乳酸脱氢酶（LDH）的分离鉴定。 同工酶实验4 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理 天然状态生物大分子进行的电泳，利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、 形状的差异，而在电场中泳动的速度和方向不同，达到分离的目的。 多数蛋白质的pH在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中进行 电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁移，称为阳极电泳； 对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而 向阴极迁移，称为阴极电泳。 同工酶实验5 夹在两块玻璃夹在两块玻璃 板之间的凝胶板之间的凝胶 电泳电泳 缓冲液缓冲液

3、 电泳电泳 缓冲液缓冲液 加在槽中的样品加在槽中的样品 分子量小分子量小 分子量大分子量大 电源电源 同工酶实验6 电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。 电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。 混合样品混合样品 带孔胶带孔胶 按分子按分子 大小分离大小分离 电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子 大分子大分子 同工酶实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型 相同孔径的凝胶、缓冲系统，是利用蛋白质分子的主要靠 电荷和分子筛效应进行分离。 不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的

4、电泳方式，在电泳分离过 程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶 的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，浓缩效应，然 后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效 应，也有分子筛效应。 不连续系统不连续系统 连续系统连续系统 同工酶实验8 一、动物组织的样品的获取 二、试剂的配制、仪器的准备 三、分离胶（30分钟） 四、浓缩胶（20分钟） 五、电泳（2-3小时） 六、染色（30分钟） 七、观察结果 实验流程实验流程 同工酶实验9 1.凝胶储备液： A储备液： pH8.9 TrisHCl缓冲液：1 M HCl 48ml，36.6g Tris，加 双蒸水到 80ml，调节pH

5、到8.9定容到100ml。 B储备液 ： pH6.7 TrisHCl缓冲液：1 M HCl 48ml，5.98g Tris，加双蒸水到 80ml，调节pH到6.7定容到100ml。 C储备液： 分离胶储备液（30% Acr/Bis）：30g Acr，0.8g Bis，用双蒸水定容 到100ml，备用，4存放可以保存1个月。 D储备液： 浓缩胶储备液：16g Acr，4g Bis，用双蒸水定容到 100ml，备用， 4可以保存1个月。 E储备液： 10% Aps（W/V）：1g定容到10ml，-20保存。 F储备液： 40%蔗糖：40g蔗糖溶解到60ml双蒸水中。 TEMED 一、试剂：一、试剂

6、： 同工酶实验10 2.电泳缓冲液： Tris6.0g，28.8gGly 加双蒸水到900ml调节pH到8.3，定容到1000ml，使用 时 稀释10倍。 3.乳酸脱氢酶染色剂的配制 1M 乳酸钠 0.5ml NAD 25mg PMS 2mg NBT 15mg 0. 2M TrisHcl溶液（PH8.0）2ml 去离子水定容至50ml 同工酶实验11 器材器材： 夹心式垂直板电泳槽，梳子，直流稳压电源（电压300-600V， 电流50-100mA），移液枪（各种量程），烧杯（100mL）， 培养皿 同工酶实验12 1.电泳槽 2.梳子 3.制胶器 4.夹胶框 封胶条 1 2 3 4 同工酶实验

7、13 v取材：鲫鱼若干条，解剖取眼、鳃、肺、肝、肠、肉、卵 、 心脏，放入冰箱保存。 v提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液Tris-Hcl(pH=7.0) 此溶液需4预冷，组织重量（g）与缓冲液体积（mL）之 比为：5。用研钵研磨充分。浆液4离心约30分钟， 15000转分钟。 v取上清液至新管，吸取其中150ul样品，加100ul 甘油和10ul 溴酚蓝，混匀之后即可点样。 二、样品的制备二、样品的制备 同工酶实验14 三、分离胶的制备三、分离胶的制备 储备液A储备液C储备液双蒸水E储备液TEMED总体积 用量（ml） 2.55.012.5100ul10ul20 配方表配方表 vTEMED

8、TEMED最后一个加入，轻轻混匀，最后一个加入，轻轻混匀，操作迅速操作迅速。胶高度距样品凹玻璃板下。胶高度距样品凹玻璃板下 缘约缘约1cm1cm，用移液枪在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，用移液枪在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气， 并使胶面平整。并使胶面平整。 v水与凝固的胶面有折射率不同的界限，用滤纸吸去多余的水。水与凝固的胶面有折射率不同的界限，用滤纸吸去多余的水。 同工酶实验15 四、浓缩胶的制备四、浓缩胶的制备 vTEMEDTEMED最后一个加入，轻轻混匀，最后一个加入，轻轻混匀，操作迅速操作迅速。浓缩胶液高度到凹玻璃板。浓缩胶液高度到凹玻璃板 下缘下缘0.5c

9、m左右，然后插入样品梳，注意不要产生气泡。约左右，然后插入样品梳，注意不要产生气泡。约3030分钟后，分钟后， 凝胶完全。凝胶完全。 v小心拔出样品梳（两端同时向外拔）。小心拔出样品梳（两端同时向外拔）。 储备液B储备 液 D储备 液 双蒸水F储备 液 E储备 液 TEME D 总体积 用量 （ml） 1.252.51.2560ul16ul10 配方表配方表 同工酶实验16 点样点样 加样加样 样品迁样品迁 移方向移方向 同工酶实验17 五、电五、电 泳泳 v电压和电流：电压电压和电流：电压180V， 电流流电流流1830mA； v溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束。溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束

10、。 同工酶实验18 六、染色与观察六、染色与观察 v揭去上面长型玻璃板，凝胶从短型玻璃板上剥离，慢慢地把 胶板冲入白瓷盘或大培养皿内，避光于37度摇床中染30min。 v观察拍照 同工酶实验19 m m：肌肉（：肌肉（musclemuscle）；）；l l：肝脏（：肝脏（liverliver）；）；k k：肾脏：肾脏 （kidneykidney）；）；s s：脾脏（：脾脏（spleenspleen）；）；h h：心（：心（heartheart）；）； e e：眼睛（：眼睛（eyeeye）；）；f f：鳍（：鳍（finfin）；）；g g：鳃（：鳃（gillgill）；）； b b：脑（：脑（brainbrain） 同工酶实验20 思考题：思考题： v根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺 凝胶垂直板电泳？哪些是关键步骤？凝胶垂直板电泳？哪些是关键步骤？ v为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和甘油甘油溶液？溶液？ 分别有何用途？分别有何用途？ 同工酶实验21 v谢谢 同工酶实验22 附：附：分离胶、浓缩胶配方分离胶、浓缩胶配方 储备液储备液A A储备液储备液C C储备液储备液双蒸水双蒸水E E储备液储备液 (APS)(APS) TEMEDTEMED总总 体体 积积 用量用量 （mlml） 2.52.