乌司他丁对重症急性胰腺炎大鼠脑毛细血管渗漏的影响及作用机制的实验研究

1、乌司他丁对重症急性胰腺炎大鼠脑毛细血管渗漏的影响及作用机制的实验研究中文摘要目的 探讨乌司他丁（ulinastatin,UTI）对重症急性胰腺炎（severe acutepancreatitis，SAP）大鼠脑毛细血管渗漏的影响及作用机制。方法 以胰胆管逆行注射 5%牛磺胆酸钠建立 SAP 模型，SAP 制模后 5 分钟股静脉注射乌司他丁(10000IU/kg)作为乌司他丁（UTI）干预治疗组，开腹翻动胰腺后随即关腹作为假手术组(sham operation SO)。48 只 SD 大鼠随机分为 SO 组、SAP 组、UTI 组,每组又分为 6h 和 24h 两个亚组,每个亚组 8 只。观察

2、6h、24h后各组死亡率、血清 TNF-及胰腺、脑组织病理，干湿重法检测脑含水率，RT-PCR检测脑组织 occludin mRNA 表达,免疫组化检测脑组织 occludin 蛋白表达。结果 SO 组、SAP 组、UTI 治疗组 6h 血清 TNF-分别为（34.764.44）pg/ml、（94.044.53）pg/ml、（77.264.32）pg/ml，24h 血清 TNF-分别为（40.282.16）pg/ml、（146.174.89）pg/ml、（112.724.77）pg/ml，组间差异均显著（P0.05）；6h 脑组织含水率分别为（71.113.84）%、（79.991.02）%、

3、（78.020.54）%，24h 脑组织含水率分别为（78.370.50）%、 82.530.90）%、（79.820.71）%，组间差异均显著（P0.05）；6h 脑组织 occludin 蛋白表达分别为 6.890.34、3.950.16、6.030.24，24h 脑组织 occludin 蛋白表达分别为 7.880.44、4.300.54、6.34 0.55，组间差异均显著（P0.05）；6h 脑组织 occludinmRNA 表达分别为 0.590.07、0.350.04、0.440.04，24h脑组织 occludinmRNA 表达分别为 0.780.06、0.600.04、0.70

4、0.03，组间差异均显著（P0.05）；SAP6h、24h 两亚组血清 TNF-、脑组织含水率较 SO 组显著增高（P0.05），脑组织 occludinmRNA、脑组织 occludin 蛋白表达较 SO 组显著减少（P0.05）；UTI 治疗组 6h、24h 两亚组血清 TNF-、脑组织含水率、较 SAP 组显著降低，脑组织 occludinmRNA、脑组织 occludin 蛋白表达较 SO 组显著增高（P0.05）；结论 乌司他丁能够减轻重症急性胰腺炎大鼠脑毛细血管渗漏，可能机制之一是通过下调 TNF-，间接上调 occludin 蛋白表达。关键词 重症急性胰腺炎 乌司他丁 occlu

5、din 毛细血管渗漏4（The experimental studies of the effects of ulinastatin on SAP braincapillary permeability and its possible mechanismAbstractObjectiveTo explore the effects of ulinastatin on SAP brain capillarypermeability and its possible mechanismMethodsThe models of SAP were induced by retrograde inje

6、ction of5% sodium taurocholate into the bili-pancreatic duct.UTI group wasmade by UTI(10000IU/kg) venae femoralis injection within 5 minutesafter SAP model was made.Sham operated(SO) group was made just bytipping the pancreas.Totally 48 helathy Sprague-Dawley(SD) rats wererandomly divided into 3 gro

7、ups：sham operation(SO) group, severe acutepancreatitis（SAP）group, ulinastatin（UTI） treated group. Each groupwas divided into two subgroups of 6h and 24h.There were 8 rats in eachsubgroup.The model was made by injecting 5% sodium taurocholate intopancreaticobiliary. The changes of TNF-,pathohistology

8、 and watercontent were compared among different groups. The expression ofoccludin protein in brain was analyzed by immunohistochemistrymethod，and occludin mRNA level was measured by RT-PCR techniqueResultTNF-，pathohistology，water content ,occludin protein andmRNA level in group UTI were significantl

9、y diferent from those in groupSO and SAP .ConclusionsUTI could improve brain capillary permeability in severe5acute pancreatitis rats. UTI may increase the expression of occludinprotein by decreasing the level of TNF-.Key words Severe acute pancreatitis；Ulinastatin；Occludin；Capillarypermeability;6英文

10、缩略词表英文缩写APARDSBBBCLSDABECELISAHEUTIICAM-1ILMODSOccludinPBSPERT-PCRSAP英文全称acute pancreatitisacute respiratory distress syndromeblood-brain barriercapillary leak syndromediazoamido-benzeneendothelial cellenzyme linked immunosorbent assayhematoxylin and eosinulinastatinInternal cell adhesion molecule-1

11、interleukinmultiple organ dysfunction syndromeOccludinPhosphate Buffered Salinepancreatic encephalopathyreverse transcription-polymerasechain reactionsevere acute pancreatitis中文急性胰腺炎急性呼吸窘迫综合征血脑屏障毛细血管渗漏综合征重氮氨基苯内皮细胞酶联免疫吸附剂测定苏木素伊红乌司他丁细胞内黏附分子-1白细胞介素多器官功能不全综合征咬合蛋白磷酸盐缓冲液胰性脑病逆转录聚合酶链反应重症急性胰腺炎SIRSsystemic in

12、flammatory response syndrome 全身炎症反应综合征SOTERTNF-TJsham operationtransendothelial electrical resistancetumour necrosis factor-tight junction3假手术跨内皮电阻肿瘤坏死因子-紧密连接学位论文原创性声明和版权使用授权书学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的真实成果。除文中已注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标

13、明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名（手写）：_年_月_日导师签名（手写）：_年_月_日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构（如国家图书馆、中国学术期刊电子杂志社的中国优秀博硕士学位论文数据库、中国科学技术信息研究所的中国学位论文全文数据库等）送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权福建医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）作者签名（手写）：_年_月_日1导师签名（手

14、写）：_年_月_日乌司他丁对重症急性胰腺炎大鼠脑毛细血管渗漏的影响及作用机制的实验研究前言急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是临床常见的急腹症之一，按临床表现，可分为轻型急性胰腺炎和重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）两种。轻型病情轻，预后较好，而重型病情凶险，病死率高，是目前外科急腹症中最棘手的疾病之一。与烧伤、感染、ARDS、过敏、严重创伤相同，SAP急性期也会发生严重的毛细血管渗漏综合症（capillary leak syndrome，CLS）1低蛋白血症、血压及中心静脉压均降低、血液浓缩，有效循环血量下降，心脑肾等重要脏器缺

15、血缺氧，同时肺组织不同程度的水肿、气体交换受限，导致低氧血症，加重了毛细血管损伤，使局部炎症病变发展成难以控制的全身炎症病变，严 重 时 可 发 生 多 器 官 功 能 衰 竭 （multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。 SAP 高死亡率与毛细血管渗漏综合症密切相关，但 SAP 时毛细血管渗漏的机理及治疗仍不完全清楚，因此研究重症急性胰腺炎毛细血管渗漏的特点，为临床治疗提供依据，降低毛细血管渗漏，提高重症急性胰腺炎救治成功率具有非常重要临床意义。SAP 病 程 中 出 现 神 经 系 统 并 发 症 称 为 胰 性 脑 病 (pancreaticen

16、cephalopathy，PE)，是 SAP 的严重并发症，该疾病于 1923 年最先由 lowell报道，定义于 1941 年由 Rothemich 提出，主要临床表现为定向力障碍、烦躁不安、妄想、幻觉、意识不清或反应迟钝、表情淡漠、抑郁等精神神经障碍，死亡率达到 50%2。其发病机制复杂，至今尚未完全明确，研究表明3，PE 主要与以下几方面因素有关：胰酶作用；细胞因子、氧自由基的过度释放；血流动力学紊乱；低氧血症；细菌及真菌感染；水、电解质紊乱及 vitBl 缺乏。其中细胞因子学说在 PE 发病机制中的作用一直是研究的热点，一般认为 PE 主要与 SAP 时细胞因子引起血脑屏障通透性增高、

17、脑水肿、脑组织缺血缺氧，进而引起脑细胞功能受损相关。血脑屏障（blood brain barrier,BBB）是维持中枢神经系统内环境稳定的重7，大量液体和蛋白迅速从血管渗透到组织间隙，引起进行性全身性水肿、要结构，该屏障结构主要由脑毛细血管的内皮细胞、血管基膜和星形胶质细胞突起末端扩大的脚板共同构成4，其中内皮细胞间的紧密连接（Tight Junction,TJ）是 BBB 结构和功能的重要基础，是 BBB 通透性调节的中心环节，其表达水平的变化与脑血管通透性的改变及脑水肿的程度密切相关。occludin 蛋白，是脑组织最重要的紧密连接蛋白，是 TJ 结构中最敏感和最可靠的标志，对内皮细胞紧

18、密连接和血脑屏障通透性的改变起着至关重要的作用。国内外大量文献报道，Occludin 蛋白与脑缺血再灌注、高原性脑水肿、脑肿瘤等疾病血脑屏障通透性改变密切相关，但 occludin 在重症急性胰腺炎血脑屏障通透性改变中的作用报道较少。乌司他丁(ulinastatin，UTI)是 Beuer 和 Reich 于 1909 年首先从男性尿中提取的精制糖蛋白，除对胰蛋白酶、磷脂酶 A2、弹力蛋白酶、透明质酸酶等多种酶有抑制作用外，还可稳定溶酶体膜，抑制溶酶体酶释放，清除氧自由基及抑制 TNF-a、IL-1 等炎症介质释放，阻止细胞因子、炎症介质作用，保护机体重要脏器的功能5,已经广泛用于临床治疗急性

19、胰腺炎、急性循环衰竭、胸部及腹部手术、器官移植等，但其对胰性脑病的治疗及机制研究甚少。本研究通过逆行性胰胆管注射法制作重症急性胰腺炎大鼠模型，应用乌司他丁进行干预，通过观察各组血清 TNF-以及胰腺、脑组织病理，脑含水率，脑组织 occludin mRNA 表达，脑组织 occludin 蛋白表达，探讨乌司他丁对 SAP 大脑毛细血管渗漏的影响及其可能作用机制。8材料和方法一1材料实验动物雄性 SD 大鼠福建医科大学动物实验中心提供2主要试剂和药品2.1 制模及药物牛磺胆酸钠10%水合氯醛乌司他丁2.2 RT-PCRTrizol 试剂PCR MasterMix6X DNA Loading Dy

20、eMarkerGoldviewOccludin 引物-actin 引物异丙醇氯仿无水乙醇DEPC2.3 免疫组织化学occludin 抗体即用型 SABC 免疫组化染色试剂盒PBS 缓冲液DAB 显色试剂盒Harris 苏木素液Citrate 柠檬酸盐多聚赖氨酸9美国 Sigma 公司附属协和医院药剂科广东天普生化医药公司美国 Invitrogen 生命技术公司北京百泰克生物技术有限公司Fermentas 公司福州鼎欣生物技术有限公司北京索莱宝科技有限公司南京金斯瑞生物科技公司南京金斯瑞生物科技公司福州鼎国生物技术有限公司福州鼎国生物技术有限公司福州鼎国生物技术有限公司上海生工生物技术服务有限

21、公司美国 Abcam 公司武汉博士德生物工程有限公司福州鼎国生物技术有限公司福州鼎国生物技术有限公司福州鼎国生物技术有限公司福州鼎国生物技术有限公司福州鼎国生物技术有限公司抗体稀释液2.4 ELISATNF-ELISA 试剂盒福州鼎国生物技术有限公司美国 RD 公司3主要仪器与设备SXP-IB 手术显微镜手术器械微量注射泵莱普 LP-220凝胶图像分析仪（Genegenius）台式高速冷冻离心机（5810R）DNA 扩增仪(PTC-200)725 型低温电冰箱（Forma）微量加样器电热恒温水槽 DK-450B 型手提式压力蒸汽灭菌器电子天平 AL104 型电热鼓风恒温干燥盒 DGG-9053

22、A 型微波炉722 光栅分光光度计电热恒温水温箱 DK-450B 型液氮罐 YDS-10凝胶电泳仪（IKA）制冰机（F-M-70）酸度计奥立龙 MODEL818尼康 Y100 光学生物显微镜振荡器DU640 紫外分光光度计石蜡自动包埋机石蜡标本脱水机石蜡连续切片机上海医用光学仪器厂上海医疗器械厂北京鑫禾医疗技术有限公司英国 SYNGEN 公司德国 Epppendorf 公司美国 MJ RESEARCH 公司美国 Thermo Forma 公司德国 Epppendorf 公司上海森信实验仪器有限公司上海华线医用核子仪器有限公司梅特勒-托利多仪器有限公司上海森信实验仪器有限公司美的集团上海分析仪厂

23、上海申腾生物技术生物有限公司乐山市东亚机电工贸有限公司德国 IKA诺顶仪器（上海）有限公司北京普盛阳科贸有限公司日本尼康德国 IKA美国 Beckman 公司Shadon Pathcentre 英国Shadon Hispocentre 英国Microm（HM340E）德国10超净工作台荧光倒置显微镜光学显微照相系统电泳槽、电泳仪酶标仪孵育盒耐高温塑料切片架苏州净化设备厂Olympus 日本Olympus 日本北京三恒多用电泳仪福州迈新生物技术公司福州迈新生物技术公司福州迈新生物技术公司二、方法1 实验分组雄性 SD 大鼠 52 只，福建医科大学实验动物中心提供，体重 200-250g。按照完全

24、随机法分为假手术（SO）组、SAP 组和乌司他丁（UTI）治疗组，每组又分 6h、24h 两个亚组，6hSAP 组 9 只（其中有 1 只死亡），24hSAP 组 10 只（其中有 2 只死亡），24hUTI 组 9 只（其中有 1 只死亡），其余每亚组 8 只。SO 组：开腹后找到胆胰管后仅翻动胰腺三次即关腹。SAP 组：开腹后行 5%牛磺胆酸钠(1.0ml/kg)逆行胰胆管穿刺微注泵注入。UTI 组：UTI 组于制模后 5 分钟，股静脉注射乌司他丁(10000IU/kg)。SO 组及 SAP 组股静脉注射等量的生理盐水。2 重症急性胰腺炎动物模型制作雄性 SD 大鼠，购自福建医科大学实验动

25、物中心，体重 200-250g。采用逆行性胰胆管注射法制作重症急性胰腺炎大鼠模型6，实验前大鼠禁食 12 小时，自由饮水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（2ml/kg），固定，碘伏消毒，取大鼠上腹正中切口逐层进腹，用镊子于肝下找出十二指肠降部和胰腺，用动脉夹在肝门处阻断胆管，经十二指肠找到胆胰管开口，于显微镜下将一连接微量注射泵的 4 号半头皮针于胆胰管开口逆行穿刺，用注射泵注入 5牛磺胆酸钠（1.0ml/kg），注射速度 0.2ml/min，针头和动脉夹保留 10 分钟后撤掉以防牛磺胆酸钠注入肝脏和逆流入十二指肠，肉眼下，可观察到沿胰管周围胰腺组织出现充血、水肿及点状出血，说明动物模型已建立。回

26、纳十二指肠后逐层关腹，大鼠背部多点注射生理盐水（20ml/kg）补液，送回动物饲养室（饲养室内环境无菌卫生，温度适宜），苏醒后禁食，自由饮水。3 试验标本的收集11各组分别于术后 6h、24h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（2ml/kg），立即进行下列操作：3.1 血液收集：按原腹部切口入腹，用生理盐水纱布蘸干腹腔内腹水，抽取下腔静脉血 2ml 备用检测血清 TNF-，冷冻离心机上离心（3000rpm/分,10 分钟，4）,离心后上清液-70冻存，然后采用腹主动脉放血处死大鼠；3.2 胰腺组织的取材与预处理：收集完血液后观察胰腺大体改变，迅速取部分胰体、尾部胰腺组织，4%甲醛溶液固定，待病理切片

27、检查；3.3 脑组织的取材与预处理：将鼠头自枕骨和寰椎之间切下，游离头部皮肤，使用持针器及直血管钳小心咬除颅骨，避免损伤脑组织，剪开脑膜，游离脑周围组织，利用脑的自重下坠，剪去颅底神经，完整取下脑组织，用手术刀沿正中矢状线切开鼠脑，取右半脑前半部置于 4ml 冻存管，迅速置于液氮罐中，备occludinmRNA 检查；取右半脑后半部，浸泡于 4%甲醛溶液中，备常规病理和occludin 蛋白免疫组化检查；左半脑置于 4ml 冻存管，放-70冰箱中保存，待测脑组织含水量。4 标本的观察和检测4.1 血清 TNF-含量检测：将待测标本从-70冰箱中取出，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法 ELISA（e

28、nzyme linked immunosorbent assay）法检测，向预先包被了大鼠肿瘤坏死因子（TNF-）单克隆抗体的酶标孔中加入肿瘤坏死因子（TNF-），温育；洗涤后，加入 HRP 标记过的肿瘤坏死因子（TNF-）抗体。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物 A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中大鼠肿瘤坏死因子（TNF-）的浓度呈正相关。ELISA 步骤按试剂盒说明书操作:1.建立标准曲线：设标准孔 8 孔，每孔中各加入标本稀释液 50l，第一孔加标准品 50l，混匀后用加样器吸出 50l，移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔

29、中吸出 50l 弃去，使之体积均为 50l。第八孔为空白对照。2.加样：待测品孔每孔各加入已经稀释的待测样品（为 5 倍稀释）50l。3.将反应板充分混匀后置于 37温箱温育 30 分钟。124.弃去液体，甩干，每孔加满 30 倍稀释后洗涤液，振荡 30 秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复 5 次，拍干。5.每孔加入酶标试剂 50l，空白孔除外。轻轻晃动混匀，37温育 30 分钟。6.弃去液体，甩干，每孔加满 30 倍稀释后洗涤液，振荡 30 秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复 5 次，拍干。7.每孔先加入显色剂 A 50l，再加入显色剂 B 50l，轻轻震荡混匀，37避光显色 10

30、分钟。8.取出酶标板，每孔加终止液 50l，终止反应（此时蓝色立转黄色）。9.测定：以空白孔调零，在 450nm 波长下测量各孔的吸光度值（OD 值）。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。10.根据标准品的浓度及对应的 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的 OD 值在回归方程上计算出对应的样品浓度。4.2 脑组织含水率检测：精密电子秤(精度达 0.000l)称取内有脑组织标本的冻存管重量，烘烤前为 a，烘烤后为 b，空冻存管为 c，75下烘烤 72h 至恒重，烘烤时冻存管开盖，含水量计算公式：脑组织含水量（%）=（ab）（ac）100%。4.3 胰腺组织及脑组织病理学观察：

31、将已获得的各组大鼠胰腺、脑组织标本置4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色，HE 染色后置光镜下观察。HE 染色步骤：1.将切片置于二甲苯、各脱蜡 15 min；2.100%酒精15min、100%酒精15min、95%酒精 10min、90%酒精 10min、75%酒精 5min、蒸馏水冲洗；3.苏木精染色 20min，自来水冲洗；4.1%盐酸分化，自来水冲洗；5.伊红染色 5min，自来水冲洗；6.梯度酒精脱水：70%酒精 30s、80%酒精 1min、90%酒精 5min、95%酒精 10min、100%酒精30min、1

32、00%酒精30min；7.二甲苯、各透明 15min；138.中性树胶封固。4.4 两步法 RT-PCR 检测各组脑组织 occludinmRNA：原理：两步法逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerasechain reaction,RT-PCR）是先以 RNA 为起始材料经逆转录反应产生 cDNA,再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达的实验技术。4.4.1 常用试剂配制与处理1. DEPC 水：吸出 1mlDEPC 浓缩液加入 1000ml 双蒸水中配成 1DEPC 水，放置于 1000ml 容器中静置 4 小时备用。

33、2. 75DEPC 水乙醇：DEPC 水加入无水乙醇配制（3：1），然后置于 4冰箱中保存备用。3. 异丙醇：放入棕色瓶中。4. 氯仿：放入棕色瓶中。5. 电泳缓冲液：Tris 碱硼酸0.5M EDTA蒸馏水54g27.5g20ml（pH8.0）1000ml5TBE（贮存液）使用时再将 5TBE 稀释 10 倍成 0.5TBE 就可以在电泳时使用（即工作液浓度）。4.4.2 琼脂糖凝胶的配制2.0琼脂糖凝胶：2.0g 琼脂糖100ml 电泳缓冲液，微波炉中火 30s 至沸腾，取出冷却至 60左右时加入 goldview I 型核酸染色剂 10ul，轻轻摇匀后，倒入已置好梳子的胶模中，在室温下放

34、置 30-45min 后，待胶完全凝固后上样进行电泳。4.4.3 脑组织总 RNA 提取1组织匀浆化取出备用的脑组织，用手术刀切取100mg，置入1.5ml的EP管中，加1.0ml的Trizol溶液，用小研磨杵彻底匀浆（冰上进行），室温放置5分钟以使核蛋白体完全分解。142RNA 的分离向 EP 管中加入 0.2ml 氯仿，盖紧样品管盖，用力振荡 15 秒，使其充分混匀，室温放置 5 分钟，在低温高速离心机上 4、12000rpm 离心 15 分钟（离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层、中间层和上层无色的水样层）。3RNA 的沉淀将约 400l 水样层转移到另一 1.5mlEP 管中，

35、加等体积异丙醇（约 400-500l），混匀后室温孵育 10 分钟，在低温高速离心机上 4、12000rpm 离心 10分钟（RNA 沉淀在离心前通常不可见，离心后形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底）。4、RNA 的洗脱移去上层悬液，加冰预冷的 75%乙醇（用 DEPC 水配）1ml 洗涤 RNA 沉淀一次，然后在低温高速离心机上 4、7500rpm 离心 5 分钟。5、RNA 的再溶解弃上清，置空气中 5-10 分钟干燥 RNA 沉淀，后用 50l 无 RNase 水溶解 RNA沉淀，用枪头反复吹打几次，60温水浴中孵育 10 分钟。6、RNA 浓度和纯度测定1)取 1l 总 RNA，加入

36、 99l 无核酶水，以无核酶水作空白对照，在紫外可见分光光度计分别读取 260nm,280nm 波长下的光密度值（OD 值），每次测定变动时均重新调零，计算 A260nm/A280nm 的比值。2)总 RNA 浓度：总 RNA 浓度（ng/l）=A260nm 读值40稀释倍数/1000，公式中 40 指波长为 260nm 时每一个吸光单位的 RNA 含量为 40g。纯度高的 RNA样本 A260nm/A280nm 的比值一般在 1.72.0 之间，若小于 1.6 提示样本有蛋白污染，需重新提取样品；若浓度太高可稀释后再测定。7、所得 RNA 直接做逆转录或者放-70冰箱中储存。4.4.4 RT

37、-PCR1.RNA 的变性RNase free 水OligodTRNA1510l1l1l加入 EP 管中振荡混匀，离心，70水浴 5min2.反应液配置试剂变性的 RNA 溶液5RT BufferdNTP MixtureRNase InhibitorReverTra AceTotal Volume使用量12l4l2l1l1l20l3.逆转录反应(RT)1).上述反应液混匀，离心，放入 PCR 仪 42中 60 分钟。2).PCR 仪中 85，5 分钟。3).产物立即进行 PCR 或-20保存。4.引物的设计将 肌动蛋白（-actin）设为内参基因（reference）, Occludin 设为

38、目的基因（target）。根据基因库中 Occludin 序列，利用软件 Primer Premier 5.0 设计特异引物,由南京金斯瑞生物科技公司合成, 合成的引物为 PAGE 纯化级别。基因Occludin序列片段大小上游 5-CAC ACT TGC TTG GGA CAG AGG C-3下游 5-TGA GCC GTA CAT AGA TCC AGA AGC-3-actin上游 5-TAT CGG CAA TGA GCG GTT CC-3下游 5-AGC ACT GTG TTG GCA TAG AGG-35.聚合酶链式反应(PCR)16369bp150bp反应体系：逆转录反应的样品10

39、PCR Buffer序列特异上游引物序列特异下游引物RNase InhibitorDNA 聚合酶Total Volume20l10l1l1l67l1l100l1.稍离心后放入 PCR 仪中 95预变性 5 分钟，1 个循环。2. 95 30sec，60 40sec，72 1min，35 个循环。3. 72 10 min，1 个循环。4.取出后一部分样品进行琼脂糖凝胶电泳，确认目的扩增片段的生成，置-20保存。5.同样条件扩增 -actin 片段作为内参对照。4.4.5 电泳和观察结果1.制备 2%琼脂糖凝胶：称取 2g 琼脂糖，加入 100ml 0.5TBE 电泳缓冲液加热至完全溶解后，冷至

40、60后加入 10lgoldview I 型核酸染色剂，混匀倒入水平电泳板中，室温凝固。2.取样品目的基因及内参（actin）PCR 产物各 5l 和 1l 6X DNALoading Dye，混匀后加入加样孔。以 100-600bp DNA ladder 作为 Marker，加入另一加样孔中。3.在 2.0%琼脂糖凝胶上进行水平电泳，电压 100V，当指示剂到达凝胶 4/5时终止电泳。4.在 254nm 紫外光透视下对结果进行观察、扫描，并将电泳后的凝胶置于凝胶图像分析系统进行半定量分析，计算所得产物的积分光密度与各自内参光密度的比值来反映该基因的 mRNA 水平。4.5 免疫组织化学方法检测

41、 occludin 蛋白表达4.5.1 主要试剂和仪器染缸或烧杯、玻璃架、湿盒、烤箱、微波炉、PBS（PH7.2-7.6）、0.01M 枸橼酸缓冲液、30% H2O2、乙醇174.5.2 主要试剂配制：免疫组化专用 PBS（PH7.2-7.6）：1000ml 蒸馏水中加氯化钠 8.5g，Na2HPO42.8g，NaH2PO4 0.4g。最终测定 PBS 液的 PH 值约为 7.4。0.01M 枸橼酸盐缓冲液：1000ml 蒸馏水中加枸橼酸三钠 3g,枸橼酸 0.4g。4.5.3 免疫组化步骤（按即用型 SABC 免疫组化染色试剂盒说明书操作）1.烤片：将切片置 60恒温箱里烤 45 分钟。2.

42、石蜡切片脱蜡和水化：切片用切片架装好依次置于二甲苯 I、II、III 各20min，100%酒精 I、II 各 5min；90%酒精 5min；80%酒精 5min；70%酒精 5min；蒸馏水 5min；3.灭活内源性酶：每张切片加一滴 3%H2O2 去离子水，室温孵育 10min，以灭活内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水洗 3 次。4.抗原修复：将切片侵入枸橼酸盐缓冲液（0.01mmol/L,pH 6.0），微波炉加热至沸腾后断电，间隔 10 分钟后，反复 2 次。冷却后 PBS（PH7.2-7.6）洗涤 2次。5.封闭：滴加 5%BSA 封闭液，室温孵育 20 分钟。甩去多余液体，不洗。6.

43、一抗和二抗滴加：每张切片加 50ul 的一抗工作液（occludin 兔多克隆抗体，浓度 1：250），置于湿盒中，4过夜，然后 37 度孵育 60min。PBS 冲洗 3次，每次 3 分钟。除去 PBS 液，滴加 50ul 二抗工作液（生物素化山羊抗兔 IgG），37培养箱孵育 30min，PBS 冲洗三次，每次 3 分钟。7.滴加试剂 SABC（链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物），37培养箱孵育 20min，PBS 冲洗四次，每次 5 分钟。8.DAB 显色：除去 PBS 液，用新鲜配制的 DAB 显色剂显色。使用 DAB 显色试剂盒（AR1022），取 1ml 蒸馏水，滴加试剂盒中

44、A、B、C 试剂各一滴，混匀后加至切片，室温显色，在显微镜下控制 DAB 显色 3 分钟。9.复染、返蓝：蒸馏水迅速充分冲洗 15min，苏木素复染 1min，自来水充分冲洗 5min，盐酸酒精分色 30sec，自来水充分冲洗 5min，氨水返蓝 5sec，自来水冲洗 5min，10.常规梯度酒精脱水、透明：将切片依次浸泡于蒸馏水 5min；70酒精5min；80酒精 5min；90酒精 5min；100%酒精5min；100%酒精5min；二18甲苯10min，二甲苯10min 透明。11.封片：滴加一滴中性树胶后盖上盖玻片，切片置于 70烤箱中 15min。12.显微镜下观察、拍照。4.5

45、.4 图像分析：每张片高倍镜下随机选取 5 个不重复视野，应用十三点评分法，首先计算阳性细胞数进行评分（无阳性细胞，0 分；阳性细胞百分比10%，1 分；阳性细胞百分比 1150%，2 分；阳性细胞百分比 5180%，3 分；阳性细胞百分比80%，4 分），然后对阳性细胞染色强度进行评分（染色强度按阴性、弱、中、强染色分别评为 0-3 分）。Occludin 蛋白表达值以阳性细胞数与染色强度的乘积表示，取 5 张片的均数，并做统计分析。5 统计学处理实验数据以均数标准差(xs)表示，各组间比较采用单因素方差分析（one-way analysis of variance,one-way ANOVA），采用 SPSS17.0 软件包进行数据处理，P0.05 为差异有显著性。19实验结果一、动物的存活情况假手术大鼠 6h 组、24h 组均全部存活；实验组大鼠死亡 3 只（6h 组 1 只，24h 组 2 只），死亡率为 15.84%（3/19）；乌司他丁干预组大鼠死亡 1 只（24h段），死亡率为 5.88%（1