血清成分的生化分析

1、 盐析盐析透析透析浓缩浓缩电泳（期间穿电泳（期间穿 插凝胶柱层析）插凝胶柱层析） 50%饱和度，血清球蛋白沉淀饱和度，血清球蛋白沉淀 、-（33%饱和度沉淀饱和度沉淀） 100%饱和度，血清清蛋白沉淀饱和度，血清清蛋白沉淀 （NH4）2SO4：破坏水膜、中和电荷：破坏水膜、中和电荷 纯度鉴定：层析（柱）、电泳等纯度鉴定：层析（柱）、电泳等 目的：去盐（柱层析也可）目的：去盐（柱层析也可） 透析袋：装样量：透析袋：装样量：1/ /22/ /3 目的：去水（目的：去水（蔗糖蔗糖） 目的：鉴定清蛋白和目的：鉴定清蛋白和 -球蛋白纯度球蛋白纯度 练习：分离蓝葡聚糖和重铬酸钾（蓝色练习：分离蓝葡聚糖和重

2、铬酸钾（蓝色+黄色）黄色） 鸡血清鸡血清 ：三黄鸡血清：三黄鸡血清 或或乌骨鸡血清乌骨鸡血清 -、透析与浓缩、透析与浓缩 一、目的一、目的 1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和方法、掌握盐析法分离蛋白质的原理和方法 2、掌握透析法脱盐及蛋白质浓缩的方法、掌握透析法脱盐及蛋白质浓缩的方法 二、试剂及仪器用品二、试剂及仪器用品 血清血清 PBS （NH4）2SO4溶液溶液 蔗糖蔗糖 双缩脲试剂双缩脲试剂 酪蛋白酪蛋白 BaCl2溶液溶液 离心机离心机 烧杯烧杯 移液管移液管 透析袋透析袋 三、三、 中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面的双电层中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面的双电层 和水膜，从而使蛋白质从

3、溶液中凝聚沉淀析出。和水膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析出。 沉淀不同蛋白质所需盐类浓度不同。如，沉淀不同蛋白质所需盐类浓度不同。如，50 饱和的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而饱和的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而33饱饱 和的硫酸铵则使和的硫酸铵则使 -球蛋白沉淀。因此，可根据所要球蛋白沉淀。因此，可根据所要 分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行 盐析。盐析。 透析是利用蛋白质等生物大分子不能通过半透透析是利用蛋白质等生物大分子不能通过半透 膜的性质的一类纯化方法，可利用该方法分离大分膜的性质的一类纯化方法，可利用该方法分离大分 子与小

4、分子的混合物。子与小分子的混合物。 由于由于NH4+ 和和 SO42- 可以通过半透膜，而血清清可以通过半透膜，而血清清 蛋白不能，因此，可以利用透析的方法使清蛋白溶蛋白不能，因此，可以利用透析的方法使清蛋白溶 液脱盐。液脱盐。 透析装置透析装置 利用半透膜还可以进行大分子溶液的浓缩。利用半透膜还可以进行大分子溶液的浓缩。 将盛有待浓缩的大分子溶液的透析袋放入高浓将盛有待浓缩的大分子溶液的透析袋放入高浓 度的吸水性强的蔗糖固体颗粒中，袋内溶液中的水度的吸水性强的蔗糖固体颗粒中，袋内溶液中的水 被袋外的多聚物所吸收而有效地浓缩。被袋外的多聚物所吸收而有效地浓缩。 四、实验步骤四、实验步骤 1、盐

5、析、透析与浓缩、盐析、透析与浓缩 离心管离心管 2mL 血清血清 2mL PBS 2mL （NH4）2SO4 摇匀摇匀 静置静置 30 3000rps 离心离心 20 上清液（主要上清液（主要 含清蛋白）含清蛋白） 沉淀（主要含沉淀（主要含 -球蛋白）球蛋白） 3.132g（NH4）2SO4 上清液上清液 静置静置30，离心，离心20 1mL水（或水（或PBS） 沉淀沉淀 流水透析流水透析1h 蔗糖蔗糖 浓缩浓缩 清蛋白清蛋白 1mL PBS 沉淀沉淀 1mL水（或水（或PBS） 流水透析流水透析1h 蔗糖蔗糖 浓缩浓缩 -球蛋白球蛋白 滴加滴加0.5mL（NH4）2SO4 静置静置30，离心

6、，离心20 沉淀（沉淀（-球蛋白球蛋白） - 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作学习醋酸纤维薄膜电泳的操作 了解电泳技术的一般原理。了解电泳技术的一般原理。 电泳电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持是用醋酸纤维薄膜作为支持 物的电泳方法。物的电泳方法。 醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均 一的泡沫样的结构，厚度仅一的泡沫样的结构，厚度仅120m微米，有强渗透微米，有强渗透 性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进 行蛋白电泳有简便，快速，样品用量少，应用范围行蛋白电泳有简便，快速，样品用量少，应用范围 广，分离清晰，

7、没有吸附现象等优点。目前已广泛广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛 用于血清蛋白，脂蛋白，血红蛋白，糖蛋白和同工用于血清蛋白，脂蛋白，血红蛋白，糖蛋白和同工 酶的分离及用在免疫电泳中。酶的分离及用在免疫电泳中。 是两性电解质，在是两性电解质，在pH不等于其等电点的不等于其等电点的 溶液中，可带有电荷，在电场中会向着与其所带电溶液中，可带有电荷，在电场中会向着与其所带电 荷相反的电极移动。荷相反的电极移动。 血清中含有白蛋白、血清中含有白蛋白、-球蛋白球蛋白、-球蛋白球蛋白、-球球 蛋白等蛋白质，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体蛋白等蛋白质，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体 构象、相对分子质

8、量、形状及等电点不同，在电场构象、相对分子质量、形状及等电点不同，在电场 中迁移速度就不同，故通过电泳法可将其分离。中迁移速度就不同，故通过电泳法可将其分离。 1、醋酸纤维薄膜（、醋酸纤维薄膜（28cm） 2、常压电泳仪、电泳槽、常压电泳仪、电泳槽 3、点样器（市售或自制）、点样器（市售或自制） 4、培养皿（染色及漂洗用）、培养皿（染色及漂洗用） 5、粗滤纸、直尺、单面刀片、电吹风、粗滤纸、直尺、单面刀片、电吹风 6、玻璃板、玻璃板 7、竹镊子、竹镊子 8、白磁反应板等、白磁反应板等 1、巴比妥、巴比妥-巴比妥钠缓冲液（巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度，离子强度0.07）：）： 1000m

9、L： 巴比妥巴比妥2.76g，巴比妥钠，巴比妥钠15.45g，加水至，加水至1000mL。 2、染色液：、染色液：300mL 含氨基黑含氨基黑 10B 0.25g，甲醇，甲醇50mL，冰醋酸，冰醋酸10mL， 水水 40mL可重复使用可重复使用。 3、漂洗液：、漂洗液： 2000mL 含甲醇或乙醇含甲醇或乙醇45mL，冰醋酸，冰醋酸5mL，水，水50mL。 4、透明液：、透明液：300mL：含无水乙醇：含无水乙醇7份，冰醋酸份，冰醋酸3份。份。 5、血清：、血清：新鲜，无溶血现象新鲜，无溶血现象 总体步骤：总体步骤： 膜处理膜处理30 装置装置电泳槽电泳槽 电极缓冲液：两槽等高电极缓冲液：两槽

10、等高 搭桥搭桥 点样点样电泳电泳染色染色漂洗漂洗透明透明 需做三条膜：全血清、需做三条膜：全血清、 -球蛋白、清蛋白球蛋白、清蛋白 1、膜处理、膜处理膜的浸泡膜的浸泡 用无齿镊子取醋酸纤维薄膜一张（识别用无齿镊子取醋酸纤维薄膜一张（识别 出光泽面与无光泽面，并在角上做好记号）出光泽面与无光泽面，并在角上做好记号） 放在缓冲液中浸泡放在缓冲液中浸泡 20min。 根据薄膜宽度剪裁合适的滤纸条。在两个电极根据薄膜宽度剪裁合适的滤纸条。在两个电极 槽中各倒入等体积电极缓冲液，在电泳槽两个膜支槽中各倒入等体积电极缓冲液，在电泳槽两个膜支 架上各放两层滤纸条，滤纸的一端与支架前沿对齐，架上各放两层滤纸条

11、，滤纸的一端与支架前沿对齐， 另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后， 用玻棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐气泡，使用玻棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐气泡，使 该端滤纸紧贴于膜支架上。滤纸条是两个电极槽联该端滤纸紧贴于膜支架上。滤纸条是两个电极槽联 系醋酸纤维素薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。系醋酸纤维素薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。 3、点样、点样 把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗 滤纸中吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上滤纸中吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上 （无光泽面朝上）。将点样器先于放置在白磁（无光泽面朝上）。

12、将点样器先于放置在白磁 反应板上的血清中沾一下，再在膜条一端反应板上的血清中沾一下，再在膜条一端2 3cm处轻轻地水平地落下并随即提起，这样即处轻轻地水平地落下并随即提起，这样即 在膜条上点上了细条状的血清样品。在膜条上点上了细条状的血清样品。 + - - 点样位点不可直接在薄膜上划线，以免破坏薄点样位点不可直接在薄膜上划线，以免破坏薄 膜。可制备膜。可制备：取等大小滤纸条，在距纸边：取等大小滤纸条，在距纸边 1.52cm处用铅笔划一平行线，此线为点样标志区。处用铅笔划一平行线，此线为点样标志区。 点样后要在薄膜上形成具一定宽度、粗细均匀点样后要在薄膜上形成具一定宽度、粗细均匀 的直线。此步骤

13、是实验关键，是获得具有清晰区带的直线。此步骤是实验关键，是获得具有清晰区带 电泳图谱的重要环节。点样前应在滤纸上反复练习，电泳图谱的重要环节。点样前应在滤纸上反复练习， 掌握点样技术后再正式点样。掌握点样技术后再正式点样。 4、电泳、电泳 将膜条上点样的一端靠近负极（将膜条上点样的一端靠近负极（点样面朝下，点样面朝下， 要求膜紧贴滤纸并绷直，中间不能下垂。若电泳要求膜紧贴滤纸并绷直，中间不能下垂。若电泳 槽中同时安放几张薄膜，则薄膜间应相隔几槽中同时安放几张薄膜，则薄膜间应相隔几 mm）。盖严电泳室，平衡）。盖严电泳室，平衡10min。通电。调节。通电。调节 电压到电压到160V，电流强度，电

14、流强度0.40.6mA/cm（毫安（毫安/厘厘 米）膜宽，电泳时间约为米）膜宽，电泳时间约为4560min。 5、染色、染色 电泳完毕后，将膜条取下并放在染色液电泳完毕后，将膜条取下并放在染色液 中浸泡中浸泡510min。 6、漂洗、漂洗 将膜条从染色液中取出后移置漂洗液中将膜条从染色液中取出后移置漂洗液中 漂洗数次到无蛋白区底色脱净为止，可得色带清漂洗数次到无蛋白区底色脱净为止，可得色带清 晰的电泳图谱。晰的电泳图谱。 7、定量、定量 、将膜条用滤纸压平吸干，按区带、将膜条用滤纸压平吸干，按区带 分段剪开，分别浸在分段剪开，分别浸在4.0mL 0.4mol/ /L氢氧化钠溶氢氧化钠溶 液中半

15、小时，并剪取相同大小的无色带膜条作空液中半小时，并剪取相同大小的无色带膜条作空 白对照，在白对照，在A650nm进行比色。进行比色。 可用光密度计直接测定，可用光密度计直接测定， 一、目的一、目的 掌握凝胶过滤层析的技术方法掌握凝胶过滤层析的技术方法 二、凝胶柱层析原理二、凝胶柱层析原理 1、凝胶层析也称凝胶过滤，是一、凝胶层析也称凝胶过滤，是一 类利用有一定孔径范围的多孔凝胶类利用有一定孔径范围的多孔凝胶 的层析技术。的层析技术。 2、当样品流经这类凝胶的固定相、当样品流经这类凝胶的固定相 时，不同分子大小的各组分因进入时，不同分子大小的各组分因进入 网孔受阻滞的程度不同而以不同的网孔受阻滞

16、的程度不同而以不同的 速度通过层析柱，从而达到分离的速度通过层析柱，从而达到分离的 目的。目的。 3、当样品通过层析柱时，分子量较大的物质因为不、当样品通过层析柱时，分子量较大的物质因为不 能或较难通过网孔而进入凝胶颗粒，而是沿着凝胶能或较难通过网孔而进入凝胶颗粒，而是沿着凝胶 颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动的速颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动的速 度较快，即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱；度较快，即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱； 反之，分子量较小的物质，因为颗粒直径小，可通反之，分子量较小的物质，因为颗粒直径小，可通 过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程较长，向前移动过网孔

17、而进入凝胶颗粒，所以流程较长，向前移动 的速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚。的速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚。 本实验采用本实验采用Sephandex G-25凝胶柱分离重铬酸凝胶柱分离重铬酸 钾和蓝葡聚糖混合物。钾和蓝葡聚糖混合物。 S e p h a n d e x ： 葡 聚 糖 凝 胶 。： 葡 聚 糖 凝 胶 。 G 2 0 、 G30G200等，编号越小，筛孔越小。根据需要等，编号越小，筛孔越小。根据需要 选取适当型号可分离高分子物质或脱盐等。选取适当型号可分离高分子物质或脱盐等。 三、试剂及仪器用品三、试剂及仪器用品 （1）Sephandex G-25 （1）铁架台

18、）铁架台 （2）生理盐水）生理盐水 （2）凝胶柱）凝胶柱 （3）重铬酸钾）重铬酸钾 （3）玻璃棒）玻璃棒 （4）蓝葡聚糖）蓝葡聚糖 （4）烧杯）烧杯 （5）试管）试管 （6）胶头吸管）胶头吸管 1、凝胶预处理、凝胶预处理 称取称取 8g G-25 放入放入250mL烧杯中烧杯中 100mL 蒸馏水蒸馏水小火煮沸小火煮沸1h 静止、冷却静止、冷却 倾弃蒸馏水倾弃蒸馏水 加入加入10mL PBS 轻轻搅拌至凝胶悬起轻轻搅拌至凝胶悬起 倾入倾入 10cm1.0cm层析柱。层析柱。 将全部凝胶都倾入柱内，当液面接近凝胶面时，将全部凝胶都倾入柱内，当液面接近凝胶面时， 用螺旋夹将橡胶管夹紧，然后小心放松

19、螺旋夹，使用螺旋夹将橡胶管夹紧，然后小心放松螺旋夹，使 液体缓慢流出（液体缓慢流出（45d/ /m），到液体刚好流入凝胶），到液体刚好流入凝胶 面时，将螺旋夹再夹紧，装柱工作完成。面时，将螺旋夹再夹紧，装柱工作完成。 用胶头吸管将柱中上方清液吸出，加入重铬酸用胶头吸管将柱中上方清液吸出，加入重铬酸 钾和蓝葡聚糖混合溶液，用胶塞封住上口。钾和蓝葡聚糖混合溶液，用胶塞封住上口。 4、洗脱、洗脱 用生理盐水洗脱液进行洗脱。打开螺旋夹，使用生理盐水洗脱液进行洗脱。打开螺旋夹，使 液体的流速达到液体的流速达到1015d/ /m。 混合液在凝胶柱中分离，蓝色的蓝葡聚糖混合液在凝胶柱中分离，蓝色的蓝葡聚糖

20、在下方，黄色的重铬酸钾在上方。用试管收集在下方，黄色的重铬酸钾在上方。用试管收集 流出蓝、黄色液体，比色并画出洗脱曲线。流出蓝、黄色液体，比色并画出洗脱曲线。 实验结果实验结果 1.洗脱曲线洗脱曲线 例子例子实际洗脱曲线实际洗脱曲线 2.实验结论实验结论 可通过凝胶过滤对样品脱盐可通过凝胶过滤对样品脱盐 * *盐析分离所得之盐析分离所得之-球蛋白，在进一步纯化之球蛋白，在进一步纯化之 前，先要将其中的硫酸铵除去。凝胶过滤法较前，先要将其中的硫酸铵除去。凝胶过滤法较 之透析法是一种快速有效的方法。之透析法是一种快速有效的方法。 * *当蛋白质、硫酸铵混合物流经当蛋白质、硫酸铵混合物流经Sepha

21、dex G-25 Sephadex G-25 柱时，硫酸铵渗入柱时，硫酸铵渗入 Sephadex G-25 Sephadex G-25 内部，而内部，而 蛋白质被排阻在外，因此，蛋白质随溶剂先流蛋白质被排阻在外，因此，蛋白质随溶剂先流 出，硫酸铵后流出。故能将二者分开。出，硫酸铵后流出。故能将二者分开。 二、操作方法二、操作方法 1 1装柱装柱 * *取层析柱取层析柱1 1根（根（1.51.520cm20cm），垂直于固定架上，夹），垂直于固定架上，夹 住流出口；住流出口； * *加加10ml10ml磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（0.0175 mol/L0.0175 mol/L，pH6.7pH6

22、.7）于）于 柱中；柱中； * *将溶胀好的将溶胀好的Sephadex GSephadex G2525倾倒去水，加入磷酸盐倾倒去水，加入磷酸盐 缓冲液（缓冲液（0.0175mol/L0.0175mol/L，pH6.7pH6.7）并搅拌成悬浮液；）并搅拌成悬浮液； * *慢慢将凝胶装入柱中，打开流出口；慢慢将凝胶装入柱中，打开流出口； * *继续加入继续加入SephadexGSephadexG2525使自然沉降至使自然沉降至15cm15cm高，关高，关 闭出口。闭出口。 * *打开出口，使柱中多余的磷酸盐缓冲液流出打开出口，使柱中多余的磷酸盐缓冲液流出 至凝胶柱床面（切勿低于柱床面）；至凝胶柱床

23、面（切勿低于柱床面）； * *用吸管吸取盐析所得的蛋白质溶液用吸管吸取盐析所得的蛋白质溶液2ml2ml，沿管，沿管 壁加入凝胶面上；壁加入凝胶面上； * *打开流出口，让样品进入凝胶柱；打开流出口，让样品进入凝胶柱； * *再用滴管小心加入磷酸盐缓冲液至离凝胶面再用滴管小心加入磷酸盐缓冲液至离凝胶面 2 23cm3cm高；高； * *接通装有磷酸缓冲液的洗脱瓶开始洗脱；接通装有磷酸缓冲液的洗脱瓶开始洗脱； * *调节流速为调节流速为0.5ml0.5mlminmin，每，每2ml2ml收集收集1 1管，编管，编 号，按顺序放在试管架上。号，按顺序放在试管架上。 3.3.检测检测 （1） 在收集的

24、同时，检查蛋白质是否流出：在收集的同时，检查蛋白质是否流出： *于每管中取出于每管中取出1滴放在黑色比色板孔中滴放在黑色比色板孔中(按编号顺序）；按编号顺序）； *再分别加入再分别加入1滴滴20磺酰水杨酸，如出现白色沉淀即表磺酰水杨酸，如出现白色沉淀即表 示蛋白质已流出凝胶柱；示蛋白质已流出凝胶柱； *如此再检查到蛋白质全流出为止。如此再检查到蛋白质全流出为止。 （2）与此同时，检测蛋白收集液中是否有硫酸铵：）与此同时，检测蛋白收集液中是否有硫酸铵： *再从含蛋白质的管中取出再从含蛋白质的管中取出1滴于白色比色板中；滴于白色比色板中； *加入奈氏试剂加入奈氏试剂1滴，如蛋白管中不出现棕色，即表

25、示蛋滴，如蛋白管中不出现棕色，即表示蛋 白质中的硫酸铵已除去，白质中的硫酸铵已除去， （3）合并无硫酸铵的蛋白质管，待用。）合并无硫酸铵的蛋白质管，待用。 透析装置透析装置 利用半透膜还可以进行大分子溶液的浓缩。利用半透膜还可以进行大分子溶液的浓缩。 将盛有待浓缩的大分子溶液的透析袋放入高浓将盛有待浓缩的大分子溶液的透析袋放入高浓 度的吸水性强的蔗糖固体颗粒中，袋内溶液中的水度的吸水性强的蔗糖固体颗粒中，袋内溶液中的水 被袋外的多聚物所吸收而有效地浓缩。被袋外的多聚物所吸收而有效地浓缩。 3.132g（NH4）2SO4 上清液上清液 静置静置30，离心，离心20 1mL水（或水（或PBS） 沉淀沉淀 流水透析流水透析1h 蔗糖蔗糖 浓缩浓缩 清蛋白清蛋白 1mL PBS 沉淀沉淀 1mL水（或水（或PBS） 流水透析流水透析1h 蔗糖蔗糖 浓缩浓缩 -球蛋白球蛋白 滴加滴加0.5mL（NH4）2SO4 静置静置30，离心，离心20 沉淀（沉淀（-球蛋白球蛋白） 是两性电解质，在是两性电解质，在pH不等于其等电点的不等于其等电点的 溶液中，可带有电荷，在电场中会向着与其所带电溶液中，可带有电荷，在电场中会向着与其所带电 荷相反的电极移动。荷相反的电极移动。 血清中含有白蛋白、血清中含有白蛋白、-球蛋白球蛋