种质离体保存

1、1 种质资源保存方法种质资源保存方法 就地保存（自然保护区）就地保存（自然保护区） 迁地保存（种质圃保存）迁地保存（种质圃保存） 种子保存种子保存 离体培养保存离体培养保存 基因文库保存基因文库保存 常温限制生长保存常温限制生长保存 中低温调控生长保存中低温调控生长保存 低温干燥保存低温干燥保存 减压保存减压保存 低温保存低温保存（低于（低于-80 -80 ） 超低温保存超低温保存（-196 -196 ） 难以长期保持种质寿难以长期保持种质寿 命，对种质保存的作命，对种质保存的作 用不是很大。用不是很大。 按保存条件按保存条件 （温度、含氧量等）（温度、含氧量等） 按材料和方式按材料和方式 2

2、 第一节第一节 概概 述述 一、植物种质资源低温保存的意义一、植物种质资源低温保存的意义 防止物种或品种灭绝防止物种或品种灭绝 节省人力物力节省人力物力 便于种质资源的国内外交流便于种质资源的国内外交流 3 二、超低温保存的概念二、超低温保存的概念 低温保存（低温保存（cryopreservation）是由是由cryo和和preservation组成，在组成，在 英语中英语中cryo为一前缀，被解释为低温、冷、冰、霜之意。从词义为一前缀，被解释为低温、冷、冰、霜之意。从词义 看，低温所涉及的温度范围是不确定的。看，低温所涉及的温度范围是不确定的。 超低温超低温:-80 极低温极低温:-70 (

3、干冰温度干冰温度) 低温低温:4 4 但对植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。如但对植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。如 果低温超过细胞原生质所能忍受的临界温度，就会致使植物细胞遭果低温超过细胞原生质所能忍受的临界温度，就会致使植物细胞遭 受冻害而死亡。如甜橙树发生冻害的临界温度通常在受冻害而死亡。如甜橙树发生冻害的临界温度通常在-6.5，枳壳，枳壳 通常在通常在-20左右（沈德绪等，左右（沈德绪等，1986）。）。 5 6 超低温保存的优点超低温保存的优点: : 在超低温条件下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎在超低温条件下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎 完全停

4、止，完全停止，呈现呈现“假死假死”状态。因此，细胞、组织和器状态。因此，细胞、组织和器 官在此过程中官在此过程中不会不会发生遗传性状的改变，也发生遗传性状的改变，也不会不会丢失形丢失形 态发生的潜能。态发生的潜能。 在超低温条件下，生命的代谢和衰老过程也基本停止，在超低温条件下，生命的代谢和衰老过程也基本停止， 故能够实现故能够实现长时期的保存。长时期的保存。 7 超低温保存的意义超低温保存的意义: 可以在可以在有限空间内保存大量种质材料有限空间内保存大量种质材料； 与种子保存相比，与种子保存相比，可以不受时间和种子含水量的制约可以不受时间和种子含水量的制约； 与试管苗相比，可以与试管苗相比，

5、可以避免频繁继代培养造成的变异避免频繁继代培养造成的变异，并，并 大幅度减少工作量。大幅度减少工作量。 8 常用的超低温保存方法：常用的超低温保存方法： 冷冻诱导保护性脱水的超低温保存法冷冻诱导保护性脱水的超低温保存法 玻璃化处理的超低温保存法玻璃化处理的超低温保存法 9 10 11 第二节第二节 植物材料超低温冻存的细胞学基础植物材料超低温冻存的细胞学基础 一、细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键一、细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键 植物细胞中含有大量的水分，约占细胞总重量的植物细胞中含有大量的水分，约占细胞总重量的60-90。细。细 胞中的水由游离水和束缚水组成，其中游离水约占

6、胞中的水由游离水和束缚水组成，其中游离水约占90，很容易，很容易 冻结，由于细胞内含有许多化合物，因此细胞内溶液并不象纯水冻结，由于细胞内含有许多化合物，因此细胞内溶液并不象纯水 那样在那样在0就结冰。就结冰。 12 1.1.细胞内外水分的冻结特性细胞内外水分的冻结特性 理论上讲，细胞外水的冻结温度为理论上讲，细胞外水的冻结温度为-5-5-15-15，细胞内，细胞内 游离水的冻结温度为游离水的冻结温度为-25-25，故，故在在-30-30时，细胞内的游离时，细胞内的游离 水全部被冻结，而结合水则在水全部被冻结，而结合水则在-100-100温度下也不发生冻结。温度下也不发生冻结。 13 根据根据

7、LuyetLuyet的冻结理论（的冻结理论（19371937），细胞内游离水的冻结），细胞内游离水的冻结 温度（温度（-30-30）可认为是细胞冻存的安全温度，因而细）可认为是细胞冻存的安全温度，因而细 胞冻存的两步冻结法一般以胞冻存的两步冻结法一般以-30-30为基础的。为基础的。 也就是说，也就是说，控制细胞内外水的冻结状态，是细胞冻存技控制细胞内外水的冻结状态，是细胞冻存技 术的关键。术的关键。 14 超低温保存的原理超低温保存的原理 为什么在为什么在超低温条件下材料不会冻死。超低温条件下材料不会冻死。关键原因是进关键原因是进 行了行了“防冻处理防冻处理”，具体如下：具体如下： 使用冷冻

8、防护剂可以使用冷冻防护剂可以降低培养基和培养材料的冰点降低培养基和培养材料的冰点。 使用冷冻防护剂可以提高培养基的渗透压，导致细胞发使用冷冻防护剂可以提高培养基的渗透压，导致细胞发 生轻微质壁分离，从而生轻微质壁分离，从而提高了组织和细胞的抗寒能力提高了组织和细胞的抗寒能力。 15 根据细胞内外水分的冻结特性，冻存方法有：根据细胞内外水分的冻结特性，冻存方法有： 分步冷冻分步冷冻：在细胞内游离水冻结之前，：在细胞内游离水冻结之前，先使细胞外水分冻结，先使细胞外水分冻结，从从 而使细胞内游离水向胞外渗溢，导致而使细胞内游离水向胞外渗溢，导致细胞适度脱水细胞适度脱水，利于细胞的冷，利于细胞的冷 冻

9、保存。冻保存。 快速冷冻：快速冷冻：也称也称玻璃化冷冻保存玻璃化冷冻保存技术，通过迅速降温，使技术，通过迅速降温，使细胞内细胞内 水冻结产生的冰晶体积非常小水冻结产生的冰晶体积非常小，呈现为一种玻璃状的冻结现象，避，呈现为一种玻璃状的冻结现象，避 免细胞受到伤害，达到细胞冷冻保存的目的。免细胞受到伤害，达到细胞冷冻保存的目的。 16 2.2.低温下细胞的致死损伤低温下细胞的致死损伤 超低温保存的一般过程：超低温保存的一般过程： 超低温保存是建立在生物细胞冻害和抗冻机理的基础之上的。超低温保存是建立在生物细胞冻害和抗冻机理的基础之上的。 超低温保存成功的关键，在于降温过程中避免细胞内溶液结冰。超

10、低温保存成功的关键，在于降温过程中避免细胞内溶液结冰。为为 此，对于不同的植物种类或材料，应筛选相应的冰冻保护剂，采用此，对于不同的植物种类或材料，应筛选相应的冰冻保护剂，采用 适当的降温速度及化冻方式，才能使细胞不受损伤或损伤最小。适当的降温速度及化冻方式，才能使细胞不受损伤或损伤最小。 预冻预冻超低温长期保存超低温长期保存解冻解冻 17 第三节第三节 超低温保存的方法超低温保存的方法 超低温保存的程序包括培养材料的准备、预处理、冰超低温保存的程序包括培养材料的准备、预处理、冰 冻及保存、化冻处理、细胞活力测定、植株再生和变异评冻及保存、化冻处理、细胞活力测定、植株再生和变异评 价等步骤。价

11、等步骤。 降温冰冻方法降温冰冻方法 玻璃化保存方法玻璃化保存方法 超低温保存的方法超低温保存的方法 18 一、传统的降温冰冻方法一、传统的降温冰冻方法 1慢冻法：以慢冻法：以0.5- -2/min速度降温至速度降温至-100后投入液氮，或以该速度后投入液氮，或以该速度 一直降温至一直降温至-196后投入液氮。后投入液氮。 在冰冻保保护剂的作用下，既可避免在细胞脱水时细胞内产生冰在冰冻保保护剂的作用下，既可避免在细胞脱水时细胞内产生冰 晶，又能防止因溶质含量增加引起的晶，又能防止因溶质含量增加引起的“溶液效应溶液效应”。因此，对于原生。因此，对于原生 质质 体、悬浮培养细胞等细胞类型一致的培养物

12、，这种方法效果最好。体、悬浮培养细胞等细胞类型一致的培养物，这种方法效果最好。 19 2快冻法：快冻法：将材料用玻璃瓶或锡箔纸袋保护后直接投入将材料用玻璃瓶或锡箔纸袋保护后直接投入 液氮或液氮的蒸气相中，该方法对高度脱水的材料如种液氮或液氮的蒸气相中，该方法对高度脱水的材料如种 子、花粉及抗寒性很强的休眠枝条或冬芽比较适宜，对子、花粉及抗寒性很强的休眠枝条或冬芽比较适宜，对 含水量高的细胞培养物则不适合。含水量高的细胞培养物则不适合。 20 3分步冰冻法：是慢冻法和快冻法的结合，先用较慢的分步冰冻法：是慢冻法和快冻法的结合，先用较慢的 速度速度(0.5 4/min)降至降至-30-40 ，停留

13、，停留0.51h，然，然 后直接投入液氮中保存。停留的目的是诱导细胞外水分后直接投入液氮中保存。停留的目的是诱导细胞外水分 结冰，对细胞进行保护性脱水，避免细胞内产生非均一结冰，对细胞进行保护性脱水，避免细胞内产生非均一 性冰晶。性冰晶。 21 4. 干冻法：将样品在高浓度干冻法：将样品在高浓度(0.5-1.5M)渗透性化合物培养基渗透性化合物培养基 上培养数小时至数天，再经过硅胶、无菌空气干燥脱水上培养数小时至数天，再经过硅胶、无菌空气干燥脱水 数小时数小时(使含水量降至使含水量降至1740)或用藻酸盐包埋后投入液或用藻酸盐包埋后投入液 氮保存。该法特别适合于愈伤组织、体细胞胚、胚轴、氮保存

14、。该法特别适合于愈伤组织、体细胞胚、胚轴、 胚、茎尖、生根苗保存，但不适用于脱水敏感的材料。胚、茎尖、生根苗保存，但不适用于脱水敏感的材料。 22 二、玻璃化保存方法二、玻璃化保存方法 玻璃化（玻璃化（vitrificationvitrification）是指液体转变为非晶体玻璃态的固化）是指液体转变为非晶体玻璃态的固化 过程。过程。 使溶液玻璃化有两条途径：一是大幅度提高冷却速率；二是增加使溶液玻璃化有两条途径：一是大幅度提高冷却速率；二是增加 溶液浓度。溶液浓度。 23 1.1.玻璃化法玻璃化法 玻璃化法是指将生物材料经高浓度玻璃化法是指将生物材料经高浓度玻璃化溶液玻璃化溶液快速脱快速脱

15、水水 后，直接投入液氮，使材料连同玻璃化溶液同时转变成玻后，直接投入液氮，使材料连同玻璃化溶液同时转变成玻 璃璃 态。在此过程中，水分子没有发生重排，不形成冰晶，不态。在此过程中，水分子没有发生重排，不形成冰晶，不 发发 生结构和体积的改变，因而不会对材料造成机械损伤。当生结构和体积的改变，因而不会对材料造成机械损伤。当 保保 存终止后，通过快速化冻防止去玻璃化的发生。如果材料存终止后，通过快速化冻防止去玻璃化的发生。如果材料 能能 够安全度过冷却和化冻两个关口，冻存即告成功。够安全度过冷却和化冻两个关口，冻存即告成功。 24 2.2.包埋玻璃化法包埋玻璃化法 包埋玻璃化法是包埋脱水法和玻璃化

16、法的结合。包埋玻璃化法是包埋脱水法和玻璃化法的结合。 先把保存材料用藻酸钙包埋，再经蔗糖浓度梯度脱水和玻先把保存材料用藻酸钙包埋，再经蔗糖浓度梯度脱水和玻 璃化溶液处理后投入液氮保存，其存活率比包埋脱水法要高，璃化溶液处理后投入液氮保存，其存活率比包埋脱水法要高， 可能是因为藻酸钙的包埋减轻了可能是因为藻酸钙的包埋减轻了玻璃化溶液玻璃化溶液的毒性。的毒性。 25 26 第四节 影响超低温保存效果的因素 材料的基本特性材料的基本特性 冰冻保护剂的应用冰冻保护剂的应用 再生技术再生技术 预培养与低温锻炼预培养与低温锻炼 解冻方法解冻方法 27 一、材料的基本特性 材料的基本特性材料的基本特性包括植

17、物的包括植物的基因型基因型、抗冻性、抗冻性、器官、组器官、组 织或细胞的织或细胞的年龄以及生理状态等年龄以及生理状态等（特别是基因型）。特别是基因型）。 植物细胞培养物的植物细胞培养物的生长年龄，生长年龄，也是决定冻后细胞成活率也是决定冻后细胞成活率 的最重要因素之一。的最重要因素之一。指数生长期和滞后期指数生长期和滞后期的幼龄细胞抗冻的幼龄细胞抗冻 力强，存活率高。力强，存活率高。 28 二、预处理和低温锻炼 预处理对于调整植物材料的生理状态非常有效，可以预处理对于调整植物材料的生理状态非常有效，可以减少细胞内减少细胞内 自由水含量，减轻冷冻伤害自由水含量，减轻冷冻伤害，提高抗冻能力。，提高

18、抗冻能力。 预处理措施预处理措施: :包括提高培养基的糖浓度、包括提高培养基的糖浓度、提高渗透压以减少细胞提高渗透压以减少细胞 内自由水含量内自由水含量；在预培养基中添加诱导抗寒力的物质或冰冻保护剂，；在预培养基中添加诱导抗寒力的物质或冰冻保护剂， 如如0.3-1.00.3-1.0蔗糖、甘露醇、山梨醇等蔗糖、甘露醇、山梨醇等渗透压调节剂渗透压调节剂，5-105-10DMSODMSO 等等冰冻保护剂冰冻保护剂。 低温预培养：将材料于低温预培养：将材料于00以上以上低温、黑暗或弱光低温、黑暗或弱光下离体培养几下离体培养几 周，可明显增强其忍耐冷冻能力。周，可明显增强其忍耐冷冻能力。 29 三、冰冻

19、保护剂的应用 冰冻保护剂（冰冻保护剂（Cryoprotective agentCryoprotective agent，CPACPA）也称抗冻剂，为）也称抗冻剂，为 植物低温保存必不可少。植物低温保存必不可少。 特点：特点：易溶于水，对细胞无毒害，容易从组织或细胞中清除。易溶于水，对细胞无毒害，容易从组织或细胞中清除。 作用：作用：增加膜透性，加速细胞内水流到细胞外结冰；稳定细胞膜增加膜透性，加速细胞内水流到细胞外结冰；稳定细胞膜 结构，阻止低温伤害；降低冰点，提高溶液的粘滞性，阻止冰晶的结构，阻止低温伤害；降低冰点，提高溶液的粘滞性，阻止冰晶的 生长生长。 依据渗透性的有无，可将依据渗透性的

20、有无，可将CPACPA分为两类：分为两类： 渗透型渗透型 非渗透型非渗透型 & 30 31 非渗透型冰冻保护剂非渗透型冰冻保护剂 特点：特点：能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态， 在特定温度下能够降低溶质（电解质）浓度，从而起到保在特定温度下能够降低溶质（电解质）浓度，从而起到保 护作用。护作用。 种类：种类：主要有聚乙烯吡咯烷酮主要有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(PVP)、葡聚糖、葡聚糖(Dextrane)(Dextrane)、 聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)、白蛋白、白蛋白(Albumin)(Albumin)、羟乙基淀粉、羟乙基淀粉

21、(HES)(HES)等。等。 32 四、解冻方法四、解冻方法 根据解冻速度分为快速解冻和慢速解冻两种方式：根据解冻速度分为快速解冻和慢速解冻两种方式： 快速解冻：快速解冻：能使材料迅速通过冰融点的危险温度区能使材料迅速通过冰融点的危险温度区(-50(-50- - 10 )10 )，防止降温过程中形成晶核对细胞造成损伤，防止降温过程中形成晶核对细胞造成损伤。通常的做。通常的做 法是把样品放入法是把样品放入37374545温水浴中，待冰完全溶化后（约温水浴中，待冰完全溶化后（约90s90s） 立即移开。立即移开。 慢速解冻：慢速解冻：对于脱水处理后干冻保存的材料，一般认为应先对于脱水处理后干冻保存

22、的材料，一般认为应先 置于置于00下一段时间，再于室温下缓慢解冻效果较好下一段时间，再于室温下缓慢解冻效果较好。 33 另外，不同另外，不同材料或方法材料或方法采用的化冻方式也有不同：采用的化冻方式也有不同： 材料含水量：材料含水量：液泡小、含水量少的细胞液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分生组织），（如茎尖分生组织）， 可采用快速化冻的方法；可采用快速化冻的方法；液泡大、含水量高的细胞液泡大、含水量高的细胞则一般需要采用则一般需要采用 慢速化冻法。慢速化冻法。 材料的材料的生理状态生理状态：生长季节中的材料生长季节中的材料，一般在，一般在37374545温水浴温水浴 中中快速化冻（快速化冻（50

23、0-700/min500-700/min）比在室温下慢速化冻要好，而比在室温下慢速化冻要好，而木本木本 植物的冬芽植物的冬芽，在超低温保存后，必须在，在超低温保存后，必须在00低温下进行慢速化冻才低温下进行慢速化冻才 能达到良好的效果。能达到良好的效果。 保存方法：保存方法：玻璃化冻存的材料玻璃化冻存的材料在保存终止后，要求快速化冻，在保存终止后，要求快速化冻， 以防止次生结冰对组织细胞造成伤害。以防止次生结冰对组织细胞造成伤害。 34 1. 冷冻保存后细胞和器官活力的检测冷冻保存后细胞和器官活力的检测 再培养法再培养法 测定存活率测定存活率 存活细胞存活细胞(或器官或器官)数目数目 解冻解冻

24、(或器官或器官)数目数目 存活率存活率= 100% 五、培养及再生 35 经冻存的材料，不可避免地受到一些伤害，需要小心经冻存的材料，不可避免地受到一些伤害，需要小心 维护：维护： 培养培养: :一般将材料培养在黑暗或弱光下培养一般将材料培养在黑暗或弱光下培养1-21-2周周，再转入正常，再转入正常 光照下培养。光照下培养。 培养基培养基: :一般是保存前使用的培养基一般是保存前使用的培养基，但有时需将大量元素或琼，但有时需将大量元素或琼 脂含量减半，或在培养基中附加一定量的脂含量减半，或在培养基中附加一定量的PVPPVP、水解酪蛋白等，以、水解酪蛋白等，以 利于材料的恢复生长。利于材料的恢复

25、生长。 2. 培养及再生培养及再生 36 六、超低温保存中变异及其检测 保持原有种质的遗传稳定性，是种质保存的基本要求。保持原有种质的遗传稳定性，是种质保存的基本要求。 超低温保存的遗传变异属于超低温保存的遗传变异属于体细胞变异体细胞变异。 变异与起始细胞的生理状态和培养基、预处理方式、解冻方式等变异与起始细胞的生理状态和培养基、预处理方式、解冻方式等 有关（有关（变异基本上都是在非超低温下产生的变异基本上都是在非超低温下产生的）。）。 在保证保存材料活性的同时，在保证保存材料活性的同时，应尽量采用减少变异的方法技术。应尽量采用减少变异的方法技术。 37 为了掌握超低温保存材料的遗传变异情况，

26、有必要为了掌握超低温保存材料的遗传变异情况，有必要 在保存材料的恢复和再生阶段建立有效的检测体系。目在保存材料的恢复和再生阶段建立有效的检测体系。目 前，形态学观察、细胞学方法、同功酶、分子标记（如前，形态学观察、细胞学方法、同功酶、分子标记（如 RFLP和和RAPD）等检测方法常常单独或结合起来用于）等检测方法常常单独或结合起来用于 遗传变异分析。遗传变异分析。 38 种质超低温保存法程序示意图种质超低温保存法程序示意图 植物器官、组织和细胞植物器官、组织和细胞 细胞生长或植株再生细胞生长或植株再生 再培养再培养 玻璃化冻存法玻璃化冻存法 分步冷冻法分步冷冻法 （两步法、（两步法、多步冰冻法

27、）多步冰冻法） 加冷冻防护剂（加冷冻防护剂（0 ） 快速冷冻法快速冷冻法 （降温速度（降温速度1000 /min 1000 /min ） 预处理预处理 （加速继代、提高培养基渗透压、低温锻炼）（加速继代、提高培养基渗透压、低温锻炼） 种质库（种质库（-196 -196 ） 迅速解冻（迅速解冻（34-45 ） 包埋干燥冷冻法包埋干燥冷冻法 39 40 冷冻保存的应用前景冷冻保存的应用前景 1、长期保存种质的遗传稳定性。、长期保存种质的遗传稳定性。 2、长期保存去病毒的种质。、长期保存去病毒的种质。 3、保持稀有珍贵及濒危植物的种质资源。、保持稀有珍贵及濒危植物的种质资源。 4、保持不稳定性的培养

28、物，如单倍体。、保持不稳定性的培养物，如单倍体。 5、保持培养细胞形态发生的能力。、保持培养细胞形态发生的能力。 6、防止种质衰老。、防止种质衰老。 7、延长花粉寿命，解决不同开花期和异地植物杂交上的困难。、延长花粉寿命，解决不同开花期和异地植物杂交上的困难。 8、冷冻解冻过程可筛选抗逆新品种。、冷冻解冻过程可筛选抗逆新品种。 9、便于国际间的种质交换。、便于国际间的种质交换。 41 液氮罐（30L） 42 制冰机 43 离心管 44 过滤离心管 45 快速冷冻法快速冷冻法分步冷冻法分步冷冻法 包埋干燥冷包埋干燥冷 冻法冻法 玻璃化冻存玻璃化冻存 法法 附件：常用的超低温冻存方法 慢速冷冻法慢

29、速冷冻法 干冻法干冻法 46 一. 快速冷冻法 把材料从把材料从00，或经其它，或经其它预处理后，直接投预处理后，直接投 入液氮中，入液氮中，其降温速度达其降温速度达10001000以上以上/min/min。 适用于直接快速冷冻法的植物材料为：适用于直接快速冷冻法的植物材料为： 高度脱水高度脱水的材料，如种子、花粉、球茎块根；的材料，如种子、花粉、球茎块根； 抗寒性较强的木本植物的枝条或芽抗寒性较强的木本植物的枝条或芽，如经过冬，如经过冬 季低温锻炼的材料。季低温锻炼的材料。 47 二. 分步冷冻法 两步冰冻法两步冰冻法多步冰冻法多步冰冻法 48 两步（级）冰冻法两步（级）冰冻法 第一步：降温

30、至转移温度第一步：降温至转移温度。样品在添加冰冻保护剂后，。样品在添加冰冻保护剂后， 用可控速率的降温设备（程序降温仪），以某种速率用可控速率的降温设备（程序降温仪），以某种速率 （一般在每分钟降（一般在每分钟降0.10.10.50.5之间），将样品降温至之间），将样品降温至 转移温度转移温度（一般为（一般为40407070）。）。 第二步：第二步：将处于转移温度的样品投入将处于转移温度的样品投入液氮中液氮中保存：保存： 样品在添加冰冻保护剂后样品在添加冰冻保护剂后转移温度转移温度 液氮液氮 0.10.10.5/min0.5/min 49 多步冰冻法多步冰冻法 将经保护剂处理的材料在将经保护剂

31、处理的材料在00预处理后预处理后，依，依 次通过次通过不同温度的冰浴不同温度的冰浴，如，如1010，1515， 2323，4040等。一般每级约等。一般每级约停留停留5 5分钟分钟，最，最 后投入液氮中。后投入液氮中。 简成令等（简成令等（19871987）报道，将甘蔗愈伤组织）报道，将甘蔗愈伤组织 在在00的冰冻保护剂（的冰冻保护剂（1010DMSODMSO0.5 mol/L0.5 mol/L山山 梨醇）中预处理梨醇）中预处理303045 min45 min，接着用，接着用1/min1/min的的 速度从速度从00降到降到4040，停留，停留1 13 h3 h，最后投入，最后投入 液氮中保存

32、，半年后仍可再生大量植株。液氮中保存，半年后仍可再生大量植株。 50 51 根据细胞内外水分的冻结特性，冻存方法有：根据细胞内外水分的冻结特性，冻存方法有： 分步冷冻分步冷冻：在细胞内游离水冻结之前，：在细胞内游离水冻结之前，先使细胞外水分冻结，先使细胞外水分冻结，从从 而使细胞内游离水向胞外渗溢，导致而使细胞内游离水向胞外渗溢，导致细胞适度脱水细胞适度脱水，利于细胞的冷，利于细胞的冷 冻保存。冻保存。 快速冷冻：快速冷冻：也称也称玻璃化冷冻保存玻璃化冷冻保存技术，通过迅速降温，使技术，通过迅速降温，使细胞内细胞内 水冻结产生的冰晶体积非常小水冻结产生的冰晶体积非常小，呈现为一种玻璃状的冻结现

33、象，避，呈现为一种玻璃状的冻结现象，避 免细胞受到伤害，达到细胞冷冻保存的目的。免细胞受到伤害，达到细胞冷冻保存的目的。 52 第三节第三节 超低温保存的方法超低温保存的方法 超低温保存的程序包括培养材料的准备、预处理、冰超低温保存的程序包括培养材料的准备、预处理、冰 冻及保存、化冻处理、细胞活力测定、植株再生和变异评冻及保存、化冻处理、细胞活力测定、植株再生和变异评 价等步骤。价等步骤。 降温冰冻方法降温冰冻方法 玻璃化保存方法玻璃化保存方法 超低温保存的方法超低温保存的方法 53 3分步冰冻法：是慢冻法和快冻法的结合，先用较慢的分步冰冻法：是慢冻法和快冻法的结合，先用较慢的 速度速度(0.5 4/mi