不同抑制剂添加对小麦生长期土壤脲酶活性的影响

1、 河南农业大学本科生毕业论文（设计）题 目 不同抑制剂添加对小麦生长期土壤脲酶活性的影响学 院 林学院 专业班级 环境工程（农村环境治理）2012级 2班 学 号 1202117049 学生姓名 王锐豪 指导教师 孔玉华 撰写日期： 2016 年 5 月 15 日不同抑制剂添加对小麦生长期土壤脲酶活性的影响王锐豪（河南农业大学环境系，郑州450002）摘要 尿素易被土壤脲酶分解成氨而挥发，不利于土壤对氨的固化和植物对氮的吸收，并且会排放出更多的温室气体。在尿素肥料中加入抑制剂,可降低脲酶活性,降低尿素水解速率,减少氮素损失，并减少农田作物施肥中温室气体的排放；在此我们设计不同抑制剂加入尿素肥料

2、中，在小麦生长期加入不同的抑制剂来观察对土壤脲酶的活性，并由此得出数据总结出不同抑制剂添加对小麦生长期脲酶活性的影响。关键字：土壤脲酶 温室气体 不同的抑制剂Add different inhibitors effects on wheat growth period soil urease activityWang RuihaoZhengzhou (henan agricultural university environment, 450002)ABSTRACTUrea were susceptible soil urease breaks down into ammonia volati

3、lization, is not conducive to soil solidification of ammonia and plants on the absorption of nitrogen, and emits more greenhouse gases. Add inhibitors in urea fertilizer, can decrease the activity of urease, reduce the rate of urea hydrolysis, reducing the loss of nitrogen, and reduce the emissions

4、of greenhouse gases in the farm crop fertilization; Here we design different inhibitors in urea fertilizer, join different inhibitors to watch in wheat growing season on soil urease activity, and the resulting data summarizes different inhibitor added to the wheat growth period of urease activity. K

5、ey words: soil urease greenhouse gases of different inhibitors 引言 温室效应(英文：Greenhouse Effect)，又称“花房效应”，是地球大气保温效应的俗称。大气层能使太阳短波辐射到达地面表层，但是地表受热后向外界排放出的大量长波热辐射线却被大气吸收，这样就使地表与低层大气作用类似于栽培农田作物的温室，故称之为温室效应。土壤温室气体是指地球大气中能够导致温室效应的气体。主要包括N2O、CH4、CO2和水蒸等气体。自工业革命以来，人类向大气中排放的N2O等吸热性强的温室气体逐年增加，大气的花房效应也随之增强，已经引起全球气候

6、变暖等一系列极其严重的问题，引起了世界各国的广泛关注。全球变暖是指在一段时间内陆地、大气和海洋因温室效应的影响而造成的温度上升的气候变化等现象。全球气候变暖是一种“自然现象”。人们过度焚烧化石矿物等以生成能量或过度砍伐森林并将其焚烧时产生的二氧化碳等多种温室气体，因这些温室气体对来自太阳辐射的可见光具有高度的透过性和对地球反射出的长波辐射具有高度的吸收性，能强烈地吸收地面辐射的红外线，也就是人们常说的“温室效应”，导致全球性气候变暖。 温室效应现在现在日益显著，令全球气候上升，导致了许多危害或者潜在的危害。地球上的病虫害将会增加，美国科学家们曾经发出严重警告，由于全球性气温上升令北极圈冰层融化

7、，被冰封十几万年的史前致命病毒有可能会重见天日，将会导致全球陷入疫症恐慌，人类的生命或将受到严重威胁。如果地球表面温度的升高按照现在的速度继续发展下去，到2052年全球温度将上升23摄氏度，南北极地的冰山将会大幅度融化，导致全球海平面大幅度上升，一些岛屿国家和沿海城市将会淹没于水中。全球将会气候反常，海洋风暴增多，土地干旱，土壤沙漠化面积增大。农田对温室效应的影响显著。温室气体引起的全球变暖和臭氧层破坏是全世界面临的两大环境问题。其中CO2、CH4和N2O是最主要的温室气体。据估计,农业源温室气体排放约占全球人类活动温室气体总排放的14%,呈逐年增加的趋势,到2022年土壤排放的N2O将会增长

8、26%，按照这种趋势农田的温室气体排放量是逐年递增的。而其中农田施肥所造成的温室气体排放量在农田总的温室气体排放量中比例较大，在向农田中施加尿素等肥料，尿素中的氨和碳等会在土壤脲酶的作用下排放出去，是农田中产生的主要温室气体。1.2研究的目的与意义脲酶大都存在于多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种极为专一性的酰胺酶，它仅仅只能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤中的微生物的数量、有机物质的含量、全氮和速效磷含量呈正性相关。根际的土壤脲酶活性比较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤脲酶活性。脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可以供植物利用的氮源，它的活性也

9、可以用来表示土壤供氮能力的强弱。现在人们常常用土壤脲酶活性来表征土壤的氮素状况。土壤脲酶活性对农田温室气体中排放中的CO2和N2O等的排放量有显著影响，土壤脲酶活性大水解尿素的产物就要多，氨和二氧化碳都是尿素水解的最终产物，所以土壤脲酶活性大，农田施肥后产生的温室气体加多，由此可以看出土壤脲酶活性是影响农田温室气体排放的主要因子，我们可以通过研究不同抑制剂对脲酶活性的影响来降低农田施肥对温室气体的排放，并加强土壤对氮的固化和吸收。2.研究材料和方法2.1试验区概况本试验位于平顶山市叶县项目区的小麦实验田。平顶山市大地位置构造处于华北陆块南缘，地表地层发育较全，岩浆活动次数频繁，地质构造复杂多样

10、，矿产资源丰富。叶县地势西南高，东北低，自西南向东北逐渐倾斜。叶县东部地层主要涉及的地层为上第三系（N）和第四系（Q）地层，局部少量渠段涉及元古界及下第三系（E）。项目区场地为中硬类场地，地基土不存在液化和湿陷问题。项目区的工程抗震设防分类为标准设防类。场区内未发现泥石流、滑坡等不良地质现象，是可以进行建设的一般性场地。叶县土壤共分5个土类，8个亚类，15个土属，48个土种。黄棕壤土类面积最大，占土地面积的82.3%。项目区土壤以黄棕壤土为主。2.2样地的选取试验在河南省叶县进行。以等氮量（纯氮量225 kg/ hm2）为原则，设4个处理，分别为： N1：秸秆还田+常规施肥（尿素），（施纯氮量

11、225 kg/ hm2）； N2：秸秆还田+尿素+硝化抑制剂双氰胺(（DCD）（施尿素量的5%）；N3：秸秆还田+尿素+脲酶抑制剂氢醌（HQ) （施尿素量的0.5%）；N4：秸秆还田+尿素+硝化抑制剂双氰胺(DCD,5%）+脲酶抑制剂氢醌（HQ) （施尿素量的0.5%）；，三次重复，计12个小区，每个小区面积60m2（10m*6m），各小区总计施纯氮量一致，其它管理同一般高产大田。田间示意图如下图1。(氮肥基追比6：4)测定时期：小麦返青期、小麦拔节期、小麦抽穗期等个3时期。N4N3N2N130米N4N3N2N1N4N3N2N1 24米 图12.3实验方法 2.3.1取样方法 采样于2016年

12、2月、3月、4月，一共有12个采样点，每一个采样点都用土钻取020cm，2040cm层土样，并用中性笔标注好采样人、采土日期、采样深度、采样地点，将标签贴于样品袋上。为保持土壤水分及有机碳损失率降到最低，取样回来当天过2mm孔径的土样筛，之后将过筛后的土壤放于4的冰箱内，以便后续其他指标测量。2.3.2土壤含水率的测定称取新鲜过筛的土样10 g左右，迅速装入称量过准确质量的铝盒内，然后将铝盒置于105 的电热恒温鼓风干燥箱中，烘干48 h后至恒重，移入干燥器内冷却至室温，称量重量，计算土壤的含水率。每个土壤样品都做三个重复。2.3.3土壤pH的测定用电子天平取10 g风干土，放入100 ml塑

13、料瓶中，加入25 ml蒸馏水，置于空气浴振荡器（HZQ-C）中，转速为120 r/min，震荡30 min后，用pH仪进行测定，并记录每个样品的pH值。每个土壤样品做三个重复。2.3.4土壤速效钾的测定 称取5.0g（精确到0.01g ）通过2mm筛孔筛选的风干土样放置于于浸提瓶中，加入50mL 1mol/L的乙酸铵溶液，加塞振荡30min左右，然后用干滤纸过滤，将滤液直接供火焰光度计测钾使用，记录检流计的读数。从工作曲线上查得待测液的钾（K）浓度（g/mL）。工作曲线的绘制：将配制好的钾标准系列溶液放置在桌面以待使用，用0g/mL钾标准系列溶液调火焰光度计上检流计读数到零后，然后由稀到浓依序

14、去测定钾标准系列溶液的检流计读数。在方格纸上以钾浓度（g/mL）为横坐标，以检流计读数为纵坐标，绘制工作曲线。结果计算方法如下： （1）式中：Wk速效钾（K）含量，mg/kg； c从工作曲线上查得测读液钾的浓度，g/mL； V浸提剂体积，50mL； K2将风干土样换算成烘干土样中水分换算系数；m1风干土样质量，g。2.3.5土壤速效磷的测定称取2.5g过20目筛的风干土样于浸提瓶中。加入0.5mol/LNaHCO350ml,再加一勺无磷活性炭，盖上瓶塞，在震荡机上震荡30min（转速160？一般控制温度2025）。用无磷滤纸（定量滤纸）过滤，滤液承接于三角瓶中。吸取10ml滤液于150ml三角

15、瓶中，再用滴定管加入35ml蒸馏水,接着用移液管加入5ml钼锑抗试剂,摇匀，放置30min后，用700nm或者880nm的波长进行比色。标准曲线的绘制：用移液管分别准确吸取5g/ml磷标液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于150ml三角瓶中，再加入0.5mol/LNaHCO310ml,加水至容量瓶刻度线处，摇匀，加入5ml钼锑抗试剂,快速混匀显色，绘制成标准曲线。2.3.6土壤脲酶的测定试剂配制：甲苯。10%尿素：称取100g尿素，用水溶至1L。柠檬酸盐缓冲液（pH6.7）：取368 g柠檬酸溶于蒸馏水中，另取295 g KOH（氢氧化钾）溶于水，待溶液冷却后再将两种溶液合并（大

16、概到1.5L），用1mol/L NaOH（氢氧化钠）将pH调至6.7，并用蒸馏水定容至2L。苯酚钠溶液（1.35mol/L）：125g苯酚溶于少量乙醇，加4ml甲醇和37ml丙酮，用乙醇稀释至200ml（A液）；54g NaOH溶于200ml水中（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A、B溶液各200ml混合，用蒸馏水稀释至1L。次氯酸钠溶液：取10%的45ml次氯酸钠溶液，用蒸馏水稀释定容至500ml容量瓶中，即活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，则得含氮0.1mg/ml的标准液。再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.0

17、1mg/ml）。标准曲线绘制：用移液管分别精确吸取配置好的氮工作溶液0（空白），1，3，5，7，9，11，13ml移至50m的l容量瓶，加入20ml蒸馏水，再加入苯酚钠溶液4ml，仔细混合后，再加入次氯酸钠溶液3ml，充分震荡，然后放置20分钟，用蒸馏水稀释至刻度。以空白调零，1h内在分光光度计上于波长578nm处进行比色。根据光密度值与溶液浓度绘制标准曲线。操作步骤 ： 称5.00g土样，置于50ml容量瓶中。 向容量瓶中加入甲苯1ml（以能全部使土样湿润为度），加容量瓶塞塞紧轻摇后，并放置15分钟 之后加入 10尿素溶液10ml和柠檬酸缓冲液20ml（pH6.7），并仔细混匀。 将容量瓶放

18、入恒温箱，在37下培养24h。 培养结束后，将悬液用致密滤纸过滤于离心管中。 显色：过滤后取新鲜滤液1ml加入50ml容量瓶中，加苯酚钠溶液4ml和次氯酸钠溶液3ml，随加随摇匀。放置20分钟左右，用水稀释至刻度，溶液呈现靛酚的蓝色。同时用1ml蒸馏水代替滤液，作为调零空白对照。 1h内在（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）分光光度计上于578nm处将显色液进行比色测定。无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照无基质对照：以等体积的蒸馏水来代替基质（10尿素溶液），其他操作与样品实验相同无差异。每个土样都必须设此对照。结果计算：脲酶活性以24h后1g土壤中NH

19、3N的mg数表示。Ure（a样品a无土a无基质）Vn/m式中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的NH3N毫克数； a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3N毫克数； a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3N毫克数； V为显色液体积（50ml）；n为分取倍数；m为烘干土重（g）。英文常用单位：Urease (mg NH3-N g-1 h-1)mg NH3-N g-1 h-13.结果与分析试验结果统计采用Excel多重比较。所有数据测定结果均以平均值表示（三次重复）。3.1不同抑制剂添加对土壤的水分特征影响水是地球上所有生物生长发育的必要条件，土壤中水分含量的多少将直接影响到所有植物

20、的生长发育，所以通过研究土壤中水分的含量的多少可以从侧面了解到土壤中植物的生长状况如何，经研究实验发现试验田的土壤中水分含量如下图2、图3所示由图可知由于4月份刚灌溉过麦地所以4月份含水量高且地表含水量高地下深处含水量低，4月份含水量最高，2月份次之，3月份最低，这是由于天气逐渐变热土壤含水量逐渐降低由2月份和3月份来看可以得出深层土壤的含水量略高于浅层土壤的含水量。且不同样品田的含水量大致相同，抑制剂的添加对土壤的含水量影响不大。3.2试验田土壤的粒径分布土壤粒径分布是指土壤固相中不同粗细级别的土粒所占的比数大小，常用任一粒径及任一粒径所对应的累积百分含量得曲线表示，本试验田的土壤粒径分布图

21、如下图4所示由图可以看出在本试验田中粉粒占土壤颗粒体积百分比最多，砂粒在试验田土壤颗粒体积百分比较少，而粘粒占试验田土壤颗粒体积百分比最少。3.3不同抑制剂添加对土壤pH的影响pH的化学定义是溶液氢离子活度的负对数。土壤pH是土壤酸碱度的强度指标，是土壤的肥力和基本性质的重要影响因素之一。本实验田二、三、四月份的pH变化如下图5、图6所示由pH柱形图可知同一块样品田二、三、四月份之间pH值变化不大，数值基本在56之间变化，没有明显的规律；然而由图可以看出同一块样品田深层土壤的pH都比浅层土壤的pH要大，说明土壤越深土壤pH越大；从四大块样品田来看，N2样品田pH略大些，但整体来看N1、N2、N

22、3、N4四大块施加不同抑制剂的试验田间的pH大致相同，没有明显的差距。3.4不同抑制剂添加对土壤速效磷的影响磷是植物生长发育中必需的主要营养元素之一，常常以有机态或无机态的形式存在于土壤中，其中包括了很少的速效磷和大部分的迟效磷。土壤中的速效磷定义是指能为当季作物吸收利用的磷，土壤磷素供应的指标是它速效磷的含量，能够准确详细了解速效磷的供应状况，对施肥有着直接的指导意义。绿色植物进行光合作用把无机物（二氧化碳和水）转变为有机物（葡萄糖）是借助于叶绿素的作用，并把光能转变为化学能。叶绿素则是植物叶子制造“粮食”的工厂，而葡萄糖是植物体内合成各种有机物的原料。氮也是植物体内能量系统和维生素的重要组

23、成部分之一。磷在植物体内参与呼吸作用、光合作用、细胞分裂、能量储存和传递、细胞增大和其他一些过程。磷能促进早期根系的形成和生长，有助于植物耐过冬天的严寒，并且具有提高植物适应外界环境条件的能力。本试验田经过实验测得不同样品地不同月份的速效磷含量如下图7、图8所示。 由图可知020cm层土壤中二月份土壤速效磷含量大于三月份土壤速效磷含量大于四月份土壤速效磷含量；加硝化抑制剂的样品田N2和不加抑制剂的样品田N1的速效磷含量大致相同，而加脲酶抑制剂的样品田N3的速效磷含量最小，最后的同时加脲酶抑制剂和硝化抑制剂的样品田N4比样品田N1、N2的速效磷含量略小，比样品田N3要大。2040cm层土壤中二月

24、份土壤速效磷含量大于四月份土壤速效磷含量大于三月份土壤速效磷含量；同样的不加抑制剂的样品田N1和加硝化抑制剂的样品田N2的速效磷含量大致相同，而加脲酶抑制剂的样品田N3的速效磷含量最小，最后的同时加硝化抑制剂和脲酶抑制剂的样品田N4比样品田N1、N2的速效磷含量略小，比样品田N3要大。相同月份相同处理下020cm层土壤的速效磷含量大于相同月份相同处理2040cm层土壤的速效磷含量。3.5不同抑制剂添加对土壤速效钾的影响氮磷钾等是植物生长所必需的元素，小麦生长过程中需要大量的氮磷钾等还有其他微量元素。氮素是叶绿素的组成成分，叶绿素a和叶绿素b;都是含氮化合物。绿色植物进行光合作用，使光能转变为化

25、学能，把无机物（二氧化碳和水）转变为有机物（葡萄糖）是借助于叶绿素的作用。钾能够促进光合作用，缺钾使光合作用减弱。钾能明显地提高植物对氮的吸收和利用，并很快转化为蛋白质。钾还能促进植物经济用水。由于钾离子能较多地累积在作物细胞之中，因此使细胞渗透压增加并使水分从低浓度的土壤溶液中向高浓度的根细胞中移动。在钾供应充足时，作物能有效地利用水分，并保持在体内，减少水分的蒸腾作用。为了了解各个处理中的速效钾在小麦生长期的含量和变化做了检测，结果如图9、图10所示由图可知：020cm层土壤二月份土壤速效钾含量大于三月份土壤速效钾含量大于四月份速效钾含量；020cm层只加硝化抑制剂的样品田N2的速效钾含量

26、较大，同时加硝化抑制剂和脲酶抑制剂的样品田N4次之，不加抑制剂的样品田N1和样品田N4的速效钾含量大致相同，只加脲酶抑制剂的样品田N3的速效钾含量较低。2040cm层土壤二月份土壤速效钾含量大于三月份土壤速效钾含量大于四月份速效钾含量；2040cm层只加硝化抑制剂的样品田N2的速效钾含量较大，同时加硝化抑制剂和脲酶抑制剂的样品田N4次之，不加抑制剂的样品田N1和样品田N4的速效钾含量大致相同，只加脲酶抑制剂的样品田N3的速效钾含量较低。相同月份020cm的土壤速效钾含量大于相同月份2040cm的土壤速效钾含量。3.6不同抑制剂添加对土壤脲酶活性的影响脲酶存在于大多数真菌、细菌和高等植物里。它是

27、一种酰胺酶并且能够酶促有机物质分子中酶键的水解。脲酶为白色细微结晶性粉末。该粉末能溶于水，而不能溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂。脲酶的等电点=5.05.1，最适pH为8.0。酶活性受重金属离子抑制。它能催化尿素水解成二氧化碳和氨。能刺激机体产生脲酶抗体，抑制胃肠道内脲酶活性，从而减少尿素水解，降低血氨，达到防治肝昏迷的作用。脲酶的作用是极为专一性的，它仅仅只能水解尿素，水解的最终产物是碳酸和氨。磷酸酶可以来来完成土壤中有机磷的转化,它可以水解磷酸脂类形成磷酸及其他产物。农业方面目前研究较多的是单酯磷酸酶,它又可分为碱性磷酸酶和酸性磷酸酶。芳基硫酸脂酶,主要是水解芳基硫酸脂,形成芳香族化合物和硫酸。

28、借鉴于土壤质量管理中的重要功能指标,土壤脲酶活性是一种单位质量，单位时间内脲酶作用的活性单位在数值上就等于浓度变化量除以时间。从你记录下起的始时刻和末时刻的光密度，计算出其相对应浓度，两个浓度之差再除以时间差就是我们要的脲酶活性。土壤脲酶活性，与有机物质的含量、土壤的微生物数量、速效磷含量和全氮呈正相关。研究者们研究得出根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤脲酶活性。我们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况的不同。不同抑制剂的添加对土壤脲酶活性有一定影响。四个月份实验添加不同抑制剂处理下土壤脲酶活性变化大小的测定结果如下图11、图12所示。由图可知：020cm层土壤二月份土壤脲酶活性

29、到三月份因为添加抑制剂作用一直在下降，而到了四月份因为抑制剂作用降低并且还因为植物对土壤中氨离子和氮的吸收和外界环境因素的影响有了略微的提升；020cm层相同月份情况下，不加任何抑制剂的样品田N1的酶活性最高，加硝化抑制剂的样品田N2和加脲酶抑制剂的样品田N3酶活性较低，而同时加硝化抑制剂和脲酶抑制剂的样品田N4相对来说的脲酶活性最低。因为硝化抑制剂和脲酶抑制剂都能抑制脲酶的活性并加强土壤对铵离子和氮的固化和吸收，所以样品田N2、N3和N4的脲酶活性相比N1都要低，但由于抑制剂的能力强弱和外界原因导致N2和N3有略微差别，N3比N2要低一些，又因为同时加硝化抑制剂和脲酶抑制剂的效果更好，所以样

30、品田N4的脲酶活性最低。2040cm层土壤二月份土壤脲酶活性到三月份因为添加抑制剂作用一直在下降，而到了四月份因为抑制剂作用降低并且还因为植物对土壤中氨离子和氮的吸收和外界环境因素的影响有了略微的提升，但因为离地表较深所以抑制剂的作用没有表层那么明显；2040cm层相同月份情况下，不加任何抑制剂的样品田N1的酶活性最高，加硝化抑制剂的样品田N2和加脲酶抑制剂的样品田N3酶活性较低，而同时加硝化抑制剂和脲酶抑制剂的样品田N4相对来说的脲酶活性最低。因为硝化抑制剂和脲酶抑制剂都能抑制脲酶的活性并加强土壤对铵离子和氮的固化和吸收，所以样品田N2、N3和N4的脲酶活性相比N1都要低，但由于抑制剂的能力

31、强弱和外界原因导致N2和N3有略微差别，N3比N2要低一些，又因为同时加硝化抑制剂和脲酶抑制剂的效果更好，所以样品田N4的脲酶活性最低。相同月份下的相同样品田020cm层的土壤脲酶活性要比2040cm层的土壤脲酶活性要低，因为抑制剂是被撒在土壤表层，所以土壤表层的抑制效果要比土壤深层次的抑制效果要好。4. 结论（1） 这四个不同处理的样品田之间的含水量差异并不大，但添加抑制剂的样品田要比不加任何抑制剂的样品田含水量要高，而加不同抑制剂的样品田N2、N3、N4之间的含水量大致相同，4月份含水量最高，2月份次之，3月份最低。由此可以看出抑制剂的添加有利于植物的生长。（2） 这四个处理的样品田在这三个月份的pH变化不大，由此可见抑制剂的添加对土壤pH没有较大影响。（3） 这四个不同处理的样品田的速效磷和速效钾随着时间递减，四个样品田的速效磷和速效钾含量大小规律是样品田N1N2N3N4,含量差距很小，这说明加抑制剂的样品田对速效磷和速效钾的吸收会好些，且同时加加硝化抑制剂和脲酶抑制剂的样品田队速效磷和速效钾的吸收更好，但是效果很小不明显。（4） 在四个不同处理中的样品田中，二月到三月的土壤脲酶活性降低，到四月份脲酶活性又有略微提升；因为土壤脲酶活性在抑制剂