[毕业设计精品]鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中微小RNA29c表达的研究

1、2008级研究生学位论文 鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中微小rna29c表达的研究学位类别：学术型毕业时间：2011年6月所学专业：肿瘤学研究方向：鼻咽癌的综合治疗学位论文：鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中微小rna29c表达研究论文编号：目 录论文鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中微小rna29c表达的研究摘要中文摘要1英文摘要3前言6材料与方法.9结果.20讨论.26小结.34参考文献.35附表41综述微小rna与鼻咽癌.44致谢59攻读硕士学位期间发表的文章.60鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中微小rna29c表达的研究摘 要目的 检测鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中微小rna29c（mir29c

2、）的表达量，探讨mir29c与鼻咽低分化鳞状细胞癌发生、发展和侵袭转移的关系。方法 24例鼻咽低分化鳞状细胞癌患者和24例健康人分为鼻咽癌组和正常组，收集两组的血清，用q-pcr方法检测血清中mir29c的表达量。结果 （1）鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中mir29c的表达量明显低于健康人血清中mir29c的表达量（p0.05）；（2）有淋巴结转移的鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中mir29c的表达量明显低于无淋巴结转移的鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中mir29c的表达量（p0.05）；（3）鼻咽癌2008分期期的鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中mir29c的表达量明显低于-期的鼻咽低分化鳞状细胞

3、癌患者血清中mir29c的表达量（p0.05）；（5）不同年龄的鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中mir29c的表达量无明显差异（p0.05）。结论 鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中mir29c表达量明显降低，有淋巴结转移和临床分期晚的患者，mir29c的表达量更低。mir29c可能具有抑制鼻咽低分化鳞状细胞癌的发生、发展和侵袭转移的作用。鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中mir29c的表达量可反映鼻咽低分化鳞状细胞癌的发生、发展和侵袭转移的情况。关键词 micror29c，鼻咽癌，淋巴结转移，临床分期the research about the expression leveal of microrn

4、a29c in the serum of patients with nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinomaabstractobjective to detect the expression level of micror29c(mir29c) in the serum of patients with nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma. and to explore the relationship between mir

5、29c and the occurrence、progression、invasion and metastasis of nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma.methods 24 patients with nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma were divided into the group of nasopharyngeal carcinoma (npc) , and 24 healthy people were

6、divided into the normal group. collect serum from the tow groups, and detected the expression level of mir29c in the serum.result (1) the expression level of mir29c in the serum of patients with nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma was obviously lower than the expression leve

7、l of mir29c in the serum of healthy people (p0.05); (2) the expression level of mir29c in the serum of patients with nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma who had lymph node metastasis was obviously lower than the expression level of mir29c in the serum of patients with nasoph

8、aryngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma who had not lymph node metastasis (p0.05); (3)the expression level of mir29c in the serum of patients with nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma whose stages were nasopharyngeal carcinoma 2008 stage - was obviously lower t

9、han the expression level of mir29c in the serum of patients with nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma whose stages were nasopharyngeal carcinoma 2008 stage (p0.05); (5) among the patients with nose pharynx poorly differentiated squamous cell carcinoma whose age were diferent,

10、 the expression level of mir29c in their serum of had no difference(p0.05).conclusion the expression level of mir29c in the serum of patients with nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma was obviously reduced, and the expression level of mir29c was more lower in the serum of pat

11、ients who had lymph node metastasis, and whose clinical stage was more later. mir29c may have the effection of suppressing the occurrence, development, invasion and metastasis of nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma.the expression level of mir29c in the serum of patients with

12、 nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma could reflect the states about the occurrence, development, invasion and metastasis of nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma.key words mir29c, nasopharyngeal carcinoma, lymph node metastasis，clinical stage前 言鼻咽癌的发病具

13、有明显的地域聚集性，我国鼻咽癌的发病率在世界范围内最高。鼻咽癌的发生、发展和侵袭转移是多因素、多阶段的过程，由基因、生物与环境等因素协同作用产生，基因在鼻咽癌的发生、发展和侵袭转移方面起到重要的作用，寻找与鼻咽癌发生、发展和侵袭转移有关的基因是目前研究鼻咽癌的热点1。鼻咽部复杂的解剖结构，以及我国97的鼻咽癌组织病理学类型为低分化鳞状细胞（2005 who组织病理学分类标准中的非角化性癌），使我国的鼻咽癌有早期侵袭转移的倾向，治疗效果和预后比较差2。因此，研究鼻咽低分化鳞状细胞癌的发生、发展和侵袭转移的机制，在提高鼻咽癌治疗效果和改善患者预后等方面具有重要的意义。微小rna(microrna，

14、mirna)是长度仅有1825核苷酸（nt）的一类内源性非编码小rna3。从1993年lee rc等4在线虫体内首次发现mirna到2010年9月，已经在生物体中找到15172种mirna5，其中至少有721种在人体中表达。mirna能编码人类30%的基因，调控50%的蛋白质 6。mirna进化高度保守，不直接编码蛋白质，而是通过与靶mrna的特异性碱基互补配对，促使靶mrna降解或抑制靶mrna转录，在转录后水平负向调节蛋白质的表达，影响细胞生长、增殖、分化和凋亡，调节生物的多种功能7。mirna在生物中的表达具有明显的组织特异性，在肿瘤组织中这种特异性尤为突出，可反映肿瘤的发生、发展和侵袭

15、转移情况，用于肿瘤的诊断和预后判断。体液中表达的mirna被称为循环mirna，此概念由研究者的在进行实验研究的推论【】中提出：在肿瘤患者的体液中可以检测到循环dna和rna8，在福尔马林固定的肿瘤组织有稳定而特异性表达的mirna9，那么在肿瘤组织中稳定而特异性表达的mirna可能在肿瘤患者体液中稳定而特异性表达，循环mirna可能是理想的肿瘤标志物，可用于肿瘤的诊断和预后判断10。之后，研究者发现mirna可通过超微小泡和外来体穿过肿瘤细胞膜到达体液中，或在核磷蛋白（rna结合蛋白，npm1）作用下穿过肿瘤细胞膜到达体液中，在体液中核磷酸蛋白保护mirna不被核酸酶降解而稳定表达11,12

16、。近年来研究者在非霍奇金淋巴瘤13、乳腺癌14和胃癌15等多种肿瘤患者体液中检测到稳定而特异性表达的循环mirna，这些循环mirna与肿瘤的发生、发展和侵袭转移有关。检测循环mirna在鼻咽癌患者血清中的表达量，研究循环mirna在鼻咽癌发生、发展和侵袭转移过程中的作用，可能对鼻咽癌的诊断、治疗和预后判断等方面具有重要作用。大量研究表明mirna29c在恶性肿瘤组织中表达量降低，与肿瘤的发生、发展和侵袭转移有关16-18。mir29c在鼻咽癌组织中表达量也明显降低，可通过调节鼻咽癌组织中细胞外基质蛋白（extracellular matrix，ecm）和血管内皮生长因子（vascular e

17、ndothelial growth factor，vegf）信号通路中的多种蛋白生成和功能表达，抑制鼻咽癌的发生、发展和侵袭转移19,20。目前，在鼻咽癌患者血清中mir29c是否有表达，未见报道。本研究采用q-pcr技术检测鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中mir29c的表达量，分析mir29c与鼻咽低分化鳞状细胞癌患者淋巴结转移和临床分期的关系，进一步探讨mir29c与鼻咽低分化鳞状细胞癌发生、发展和侵袭转移的关系。材料和方法1 研究对象鼻咽癌组24例鼻咽低分化鳞状细胞癌患者。鼻咽低分化鳞状细胞癌患者为2009年6月-2010年3月期间在广西医科大学第一附属医院首诊住院的患者。入组条件所有患者

18、均在广西医科大学第一附属医院病理科经鼻咽部肿瘤组织病理学检查，确诊为鼻咽低分化鳞状细胞癌；所有患者治疗前均在广西医科大学第一附属医院放射科行头颈部mri检查，以明确临床分期和淋巴结转移；所有患者一般情况良好（用kps评分标准判定，详见附录1），器官功能正常；所有患者除患本病外无其它合并症和既往特殊疾病史，无家族重大疾病史和肿瘤病史；所有患者经超声、胸部x线、ect等检查排除远处转移。亚组（1） 按患者性别分：男性亚组（13例），女性亚组（11例）；（2）按患者年龄分：45岁亚组（11例），45岁亚组（13例），年龄在1456岁间，平均年龄43岁；（3）按淋巴结转移情况分：有淋巴结转移亚组（14

19、例），无淋巴结转移亚组（10例）；（4）按临床分期分：-期亚组（13例），期亚组（11例）。淋巴结转移根据影像学淋巴结诊断标准（详见附录2）诊断，临床分期根据鼻咽癌2008分期（详见附录3）确定，鼻咽低分化鳞状细胞癌患者的临床资料详见表1-1。正常组24例健康人。健康人为2009年11月-2010年3月期间在广西医科大学第一附属医院体检中心进行健康体检的人。入组条件 所有人一般情况良好（用kps评分标准判定），器官功能正常；所有人未患全身性疾病，无既往特殊疾病史，无家族重大疾病史和肿瘤病史；所有人与鼻咽癌组年龄相近（经t检验，p0.05，证实两组年龄有可比性，详见表1-2）；健康人与鼻咽癌组的

20、性别比例相同。表1-1 鼻咽低分化鳞状细胞癌患者临床资料编号患者年龄（岁）性别淋巴结情况鼻咽癌2008分期1npc145男-t3n0m02npc234男-t2n0m03npc335男+t3n2m04npc452女+t4n2m05npc548男-t4n0m06npc623男+t4n1m07npc747女+t4n2m08npc846男-t3n0m0编号患者年龄（岁）性别淋巴结情况鼻咽癌2008分期9npc943男+t3n2m010npc1040男+t4n1m011npc1152男+t4n2m012npc1252女+t3n3m013npc1351男-t3n0m014npc1439女+t3n1m015

21、npc1541女+t3n2m016npc1643女-t3n0m017npc1742女-t3n0m018npc1850男-t3n0m019npc1948男-t2n0m020npc2050男+t3n1m021npc2145女+t4n2m022npc2242女+t4n3m023npc2356女-t2n0m024npc2414女+t4n3m0注：“-”指无淋巴结转移，“+”指有淋巴结转移。表1-2 鼻咽癌组与正常组年龄的比较分组例数年龄tp鼻咽癌组2443.259.490.1760.862正常组2443.1710.022 材料2.1 主要试剂反转录试剂盒广州复能基因有限公司q-pcr试剂盒广州复能基因

22、有限公司trizol-a+北京天根生化技术有限公司dna mark北京天根生化科技有限公司depc处理水北京天根生化科技有限公司无水乙醇天津四有生物医学技术有限公司三氯甲烷上海振兴化工一厂5tris-硼酸(tbe)北京鼎国公司溴化乙锭(eb)美国sigma公司异丙醇衡阳有机化学试剂厂琼脂糖(apoose)spanish2.2 主要仪器7500型实时荧光定量pcr仪美国abi公司凝胶成像分析系统美国bio-rad公司凝胶成像扫描仪美国bio-rad公司紫外分光光度计美国pe公司-80低温冰箱日本三洋公司4、-20冰箱美的公司ab240-e分析天平瑞士海特勒-托利多公司高速低温离心机德国eppen

23、ndorf公司多通道pcr扩增仪美国mj公司电泳仪美国bio-rad公司颗粒制冰机上海安亭科学仪器厂高压灭菌消毒锅日本tomy公司烤箱上海跃进医疗仪器厂所有仪器由广西医科大学实验中心提供。3 方法3.1 鼻咽低分化鳞状细胞癌组织病理检查所有鼻咽低分化鳞状细胞癌患者均在广西医科大学第一附属医院耳鼻喉科经电子纤维鼻咽镜检，取鼻咽部肿瘤组织，在广西医科大学第一附属医院病理科行组织病理学检查，经常规he染色，病理科医生在光学显微镜下仔细阅片诊断，确诊为鼻咽低分化鳞状细胞癌。3.2 鼻咽组和正常组血清中mir29c的检测3.2.1 标本采集经鼻咽低分化鳞状细胞癌患者和健康人同意，分别在入院后治疗前或体检

24、当天，清晨空腹条件下，抽取外周静脉全血5ml于无菌无rna酶和无抗凝剂的10ml干燥试管中，室温凝固后离心（3000 rmp 10min），提取2.5ml血清于10ml离心管中，放入-80超低温冰箱保存，待用。3.2.2 总rna提取3.2.2.1 方法采用trizol法提取鼻咽低分化鳞状细胞癌患者和健康人血清中的总rna。3.2.2.2 步骤（1） 标本处理取出-80下保存的血清，在冰上自然解冻，常温下加入2.5ml 裂解液trizol-a+，剧烈震荡5min，室温静置10min，重复一次。（2） 相分离在经裂解液trizol-a+裂解处理后的混合液中加入1.5ml氯仿，剧烈震荡1min，室

25、温静置5min，4离心12000 rmp 15min，小心取出离心管。观察发现离心管中液体分为三层，无色透明的上层液中含总rna，稀薄的中间层液中含dna，固体状的下层物质中含蛋白质。小心转移上层液5ml于10ml离心管中，避免接触中间层或管壁。用同样方法进行第二次相分离，以保证总rna纯净，即加入1.5ml氯仿，剧烈震荡1min，室温静置5min，4离心12000 rmp 15min，转移上层液4ml于10ml离心管中。（3） 总rna沉淀在上层液中加入4ml异丙醇，小心震荡混匀1min，冰上静置10min，4离心 12000 rmp 10min，使总rna贴于离心管底壁，小心倾倒，去掉液体

26、。（4）总rna洗涤在管底贴有总rna的离心管中加入2ml 75%乙醇（用depc处理水配制，保存于4冰箱中）漂浮沉淀，4离心12000 rmp 5min，小心倾倒，去掉液体。再用2ml 75%乙醇洗涤一次，4离心12000 rmp 5min，小心倾倒，去掉液体，倒置离心管，室温干燥20min。（5）总rna溶解在管底贴有总rna的离心管中加入25ul depc处理水，溶解总rna，制成总rna溶液。（6）总rna浓度测定取1ul总rna样品加入99ul depc处理水中，稀释至100ul，用depc处理水作空白对照，校正调零，在紫外分光光度计下测总rna的光吸收值a260，计算总rna的浓度

27、，公式如下：rna浓度（ug/ul）=40a260稀释倍数/1000（7）总rna纯度测定取1ul总rna样品加入99ul depc处理水中，稀释至100ul，用depc水作空白对照，校正调零，在紫外分光光度计下测定总rna的光吸收值的比值a260/a280，a260/a280低于1.8或高于2.0表明总rna被污染或降解。（8）总rna完整性测定1琼脂糖凝胶制备：用ab240-e分析天平称取0.4g琼脂糖粉末，加入40ml 1tbe电泳缓冲液中（0.4/401/100），混匀，加热使琼脂糖完全溶解，稍冷却后加入2ul溴化乙锭（eb），充分混匀，倒入装好宽口梳子的胶槽中，室温下冷却凝固，得到1

28、琼脂糖凝胶，水平放置待用。总rna样品制备：取3l总rna 样品，加入18l depc处理水中，65变性10min后立即冷却，加入2l 10rna上样液，得到总rna样品。总rna电泳：取出制备好的1琼脂糖凝胶，平放入盛有1tbe电泳缓冲液的电泳槽中，使缓冲液没过凝胶表面1mm，在直流恒定电压100v下电泳5min。将总rna样品点样在凝胶孔中，100v电压下电泳至溴酚蓝至胶的1/3 处。rna完整性检测：立即在凝胶电泳成像分析系统下进行凝胶扫描，观察电泳结果并拍照。观察条带，若在琼脂糖凝胶上28s、18s、5s三条带清晰，28s带的亮度约是18s条带亮度的两倍，说明总rna完整。若某条带无显

29、示或模糊，说明总rna有降解。3.2.3 cdna合成（1）试剂准备将试剂盒all-in-onetm mir29c q-pcr detection kit中反转录所需的试剂（2.5u/l polya polymerase，rtase mix，5reaction buffer）放在冰上融解，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。同时在冰上预冷无rna酶的反应管。（2）反转录反应液配制按表1-3要求，在冰上依次向反应管中加入反转录所需的试剂和总rna。表1-3 反转录反应液配制试剂成分体积total rna18ul2.5u/l polya polymerase1ulrtase mix1ul5r

30、eaction buffer5ulfinal volume25ul（3）反转录将反转录反应液充分混匀，短暂离心，使反应液位于管底，37反应 60min，85灭活 5min。得到的反转录产物cdna，立即用于q-pcr反应或-20保存待用。3.2.4 q-pcr反应3.2.4.1 q-pcr方法的原理在q-pcr反应体系中加入sybr green，sybr green在cdna的指数扩增期与双链dna结合，发出荧光信号，利用荧光信号积累实现实时监测整个pcr反应过程，对cdna的初始模板mirna进行定量分析。本研究所用的q-pcr反应试剂盒（all-in-one tm mir29c q-pcr

31、 detection kit）采用国际上公认的核酸检测标准对mir29c进行检测，特异性强、灵敏度高。all-in-one tm mir29c q-pcr detection kit 采用在多聚腺苷酸聚合酶（poly a polyase）作用下对mir29c的3端加多聚腺苷酸（poly a），用反转录酶m-mlv rtase及独特的反转录引物oligo dt adaptor对加上poly a的mir29c进行反转录，用含有sybr green的pcr反应试剂混合物（all-in-one tm q-pcr mix）和mir29c的特异性引物对反转录产物进行基因扩增和溶解曲线分析（图2-1，引用于

32、mir29c q-pcr detection kit的产品说明书）。图1-1 实验原理及步骤fig1-1 experimental principle and procedure3.2.4.2 步骤（1）试剂准备冰上融解all-in-one tm mir29c q-pcr detection kit中的2all-in-onetm q-pcr mix、通用引物universal adaptor pcr primer, 特异性引物all-in-one tm mirna q-pcr primer）和单链cdna，上下轻微颠倒混匀，短暂离心，放置冰上待用。同时在冰上预冷q-pcr反应管，（2）q-pc

33、r反应液配制按表1-4要求依次加入以下试剂（所用反应液配制两份，同时用于q-pcr反应，并用depc处理水代替cdna做阴性对照，检测反应体系是否有污染），mir29c和u6的反应液分管配制。充分混匀反应液，使混合液位于反应管底部。表1-4 q-pcr反应液配制组成成分体积2all-in-onetm q-pcr mix10ulall-in-one tm mirna q-pcr primer (2um)2uluniversal adaptor pcr primer (2um)2ul1st strand cdna 6ulfinal volume20ul（3）q-pcr扩增 使用abi 7500型实

34、时荧光定量pcr仪两步法进行q-pcr扩增。 95预变性10min，循环1次；95变性20sec、60退火30sec、72延伸30sec，循环40次（表1-5）。在延伸时收集荧光信号。表1-5 q-pcr反应要求循环数步骤温度（）时间检测1预变性9510min否40变性9520sec否退火6030sec否延伸7230sec是（4）q-pcr溶解曲线分析 按abi 7500型实时荧光定量pcr仪中软件要求进行溶解曲线分析。基线设定为反应的前315个循环时收集到的荧光信号。阈值由abi 7500型实时荧光定量pcr仪自动设置，为基线的标准偏差的10倍。荧光值达到阈值时的pcr循环数为ct值，调整总

35、rna的浓度，使ct值在1535之间。按abi 7500型实时荧光定量pcr仪自定的反应程序进行溶解曲线分析。用2-ct方法36统计实验结果：鼻咽低分化鳞状细胞癌患者mir29cct均值鼻咽低分化鳞状细胞癌患者mir29c ct均值同一鼻咽低分化鳞状细胞癌患者u6 ct均值，健康人mir29cct均值健康人mir29c ct均值同一健康人u6 ct均值，均值是平行重复实验时，同一样本在两个反应管中反应所得的基因的ct值的均值，目的是为了消除加样量误差，u6为阳性内对照基因，用来校正q-pcr所扩增的基因的拷贝数。ct均值 = 鼻咽低分化鳞状细胞癌患者mir29cct均值健康人mir29cct均

36、值，2-ct表示相对于健康人，鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中mir29c的相对表达量。3.2.4.3 q-pcr产物凝胶电泳验证（1）3琼脂糖凝胶制作将1.2g琼脂糖粉末加入1tbe电泳缓冲液40ml，混匀，加热使琼脂糖完全溶解，稍冷却，加入2ul eb，充分混匀，倒入装好梳子的胶槽中，室温下冷却凝固，得到3琼脂糖凝胶，水平放置待用。（2） rna电泳取出制备好的3琼脂糖凝胶，平放于盛有1tbe电泳缓冲液的电泳槽中，使缓冲液没过凝胶表面上1mm，在直流恒定电压100v下电泳5min，将q-pcr产物加入凝胶孔中，100v电压下电泳至溴酚蓝至胶的1/3 处。4 统计学处理所有数据用均数+标准差(

37、 x+s)表示，采用spss 17.0统计学软件进行统计学处理，t检验方法进行统计学分析，p0.05有统计学意义。结 果1 鼻咽低分化鳞状细胞癌患者的病理检查结果在坏死细胞和细胞碎屑的背景中可见到大量体积增大，形状多样的肿瘤细胞，呈癌巢分布；癌巢内细胞分层不明显，细胞大小、形态不一，呈卵圆形、多角形、梭形或不规则形；胞浆丰富，境界清楚，细胞间无细胞间桥，无细胞角化或角化珠存在；细胞核大、深染，部分细胞核有一个或多个核仁（图2-1，图2-2）。 图2-1 鼻咽低分化鳞状细胞癌病理(he400)图2-2 鼻咽低分化鳞状细胞癌病理(he400)fig2-1 the pathological figu

38、re of nasopharyn- geal poorly differentiated squamous cell carcinoma（he100）fig2-1 the pathological figure of nasopharyn- geal poorly differentiated squamous cell carcinoma（he100）注：箭头所指为癌巢2 总rna的浓度和纯度检测结果鼻咽癌组血清中总rna的浓度最大值为0.168ug/ul，最小值为0.04ug/ul，正常组血清中总rna的浓度最大值为0.204ug/ul，最小值为0.04ug/ul，所有总rna的浓度均在1

39、ng5g之间，满足实验要求。鼻咽癌组血清中总rna的a260/a280比值最大值为1.983，最小值为1.801；正常组血清中总rna的a260/a280比值最大值为1.990，最小值为1.821。1.80a260/a280 0.99，扩增效率在90110之间， 5倍稀释间隔的ct值约为2.5，说明扩增有效（图2-8， 2-10）。 图2-7 u6的扩增曲线图2-9 u6的标准曲线fig2-7 the amplication curve of u6fig2-9 the standard curve of u6 图2-8 mir29c的扩增曲线图2-10 mir29c的标准曲线fig2-8 th

40、e amplication curve of mir29cfig2-10 the standard curve of mir29c6 鼻咽癌组与正常组血清中mir29c表达量的差异性分析结果相对于正常组，鼻咽癌组血清中mir29c的表达量为0.3310.167，t=19.595，p0.05，有统计学意义，说明鼻咽低分化鳞状细胞癌患者与健康人血清中mir29c的表达量有明显差异，鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中mir29c的表达量明显低于健康人血清中mir29c的表达量（表2-6，图2-11）。mir29c的相对表达量表2-2 鼻咽癌患者与健康人血清中mir29c表达量差异性分析结果分组例数mir

41、29c的相对表达量p正常组2410.00鼻咽癌组240.3310.167注：用xs表示7 鼻咽癌组的各亚组间mir29c表达量差异性分析结果（1）男性亚组血清中mir29c相对表达量为0.3440.178，女性亚组血清中mir29c相对表达量为0.3150.161，t=0.426，p0.05，差异无统计学意义，说明鼻咽低分化鳞状细胞癌患者中，男性患者和女患者血清中mir29c的表达量无明显差异（表2-7）；（2）45岁亚组血清中mir29c相对表达量为0.2900.144，45亚组血清中mir29c相对表达量为0.3650.183，t=-1.108，p0.05，差异无统计学意义，说明年龄45岁

42、和45岁的鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中mir29c表达量的无明显差异（表2-7）；（3）有淋巴结转移亚组血清中mir29c相对表达量为0.2320.064，无淋巴结转移亚组血清中mir29c相对表达量为0.4690.171，t=-4.749，p0.05，差异有统计学意义，说明-期与期鼻咽低分化鳞状细胞患者血清中mir29c的表达量有明显差异，期鼻咽低分化鳞状细胞患者血清中mir29c的表达量明显低于-期鼻咽低分化鳞状细胞患者血清中mir29c的表达量（表2-7）。表2-7亚组间mir29c表达量差异性分析临床特征亚组例数相对表达量tp性别男130.3440.1780.4260.000女110

43、.3150.161年龄45130.2900.144-1.1080.00045110.3650.183淋巴结转移有140.2320.064-4.7490.000无100.4690.171临床分期分期-期130.4230.1733.6370.000期110.2220.064注：用xs表示图2-11 mir29c在各组中相对表达量的比较fig2-15 the comparison between every two groups about the relative exnpression of mir29c讨 论一、研究鼻咽低分化鳞状细胞癌发生、发展和侵袭转移的重要性鼻咽癌的发病具有明显的地域、种

44、族差异和家族高发倾向，who资料显示1978/1983-2002年期间世界鼻咽癌新发病例64,796人，其中我国约占43.2，近十年来我国鼻咽癌的发病率未见减少，且发病机制不清楚22。侵袭转移是恶性肿瘤的基本生物学特性，绝大多数肿瘤患者致死的主要因素。早期具有侵袭转移的倾向是我国鼻咽癌的显著特征，这与鼻咽部复杂的解剖结构和我国鼻咽癌特有的组织病理学特点有关。鼻咽部周围有丰富的血管、神经、淋巴管和许多孔隙，以及骨、脑、脊髓、眼球等重要器官，鼻咽癌细胞很容易向周围侵袭和区域、远处转移。我国90的鼻咽癌组织病理类型为低分化鳞状细胞癌，此类分化差、异形性明显、恶性程度高，极易发生侵袭转移23。通过病例

45、收集及临床工作中观察，发现目前绝大多数的鼻咽癌患者的组织病理类型为低分化鳞状细胞癌，在首诊入院时肿瘤已发生明显的邻近组织器官侵袭，局部淋巴结转移，患者的治疗效果不理想，预后较差。因此，研究鼻咽低分化鳞状细胞癌的发生、发展和侵袭转移机制十分重要。本研究通过检测鼻咽低分化鳞状细胞癌患者血清中mir29c的表达量，分析mir29c与鼻咽低分化鳞状细胞癌发生、发展和侵袭转移的关系，发现mir29c可能具有抑制鼻咽低分化鳞状细胞癌发生、发展和侵袭转移的作用。二、mirna的基本生物学特性及其检测方法mirna是近二十几年来发现的一类内源性非编码小rna，长约1825核苷酸（nt），广泛存在于真核生物中，

46、具有高度保守性、时序性和组织特异性。目前在生物体中已发现15172种mirna，其中至少有721种存在于人体中24。mirna主要由位于基因内含子区域的核苷酸编码产生，在细胞浆中与argonaute蛋白结合，形成rna诱导沉默复合体（rna-induced silencing comple，risc）后稳定表达于生物中 25。mirna主要通过与靶mrna碱基互补配对，降解靶mrna或抑制靶mrna翻译，阻止蛋白质生成和功能表达，影响细胞增殖、分化和凋亡，调控疾病的发生、发展和转归26。从1993年发现mirna以来，检测mirna的方法主要有：mirna微阵列芯片检测技术（microarry

47、），高通量基因测序技术，northern blot分子杂交技术和q-pcr技术。其中mirna微阵列芯片检测技术的重现性、准确性和灵敏性比较差，只能用于mirna初筛和检测已知mirna，不适合临床应用研究；高通量基因测序技术在无需任何基因序列信息的前提下可测出mirna的表达谱，发现并鉴定出新的mirna，但价格昂贵，不适合推广应用；northern blot分子杂交技术检测步骤繁琐、样本量需求大，灵敏度较低，存在放射性元素对健康的影响，不适用于大样本检测；q-pcr技术是目前最有效、经济、实用的检测方法，操作时间不长、步骤简便、效率高，敏感性和特异性也高，实际应用最多27。目前用于检测mi

48、rna的q-pcr技术主要有两种：基于茎-环结构的q-pcr方法，基于poly a加尾的q-pcr方法。这两种方法均可用taqman探针和sybr green染料进行检测，其中taqman探针法特异性更高，而sybr green染料法更经济、实用28。本研究首次采用基于polya加尾的q-pcr技术sybr green染料法检测鼻咽低分化鳞癌患者血清中mir29c的表达量，分析鼻咽低分化鳞癌患者与健康人血清中mir29c的表达量的差异，以及鼻咽低分化鳞状细胞患者血清中mir29c的表达量与患者性别、年龄、淋巴结转移和临床分期的关系，探讨鼻咽低分化鳞状细胞癌发生、发展和侵袭转移机制中mir29c

49、的作用，发现mir29c可能具有抑制鼻咽低分化鳞状细胞癌发生、发展和侵袭转移的作用。三、恶性肿瘤中mirna表达量改变的意义mirna在恶性肿瘤中的表达具有组织特异性，可能是一类理想的肿瘤标志物。mirna在恶性肿瘤中表达量的改变与恶性肿瘤的发生、发展和侵袭转移有关，在恶性肿瘤的诊断、治疗和预后判断等方面具有重要的作用。hussein k29研究发现mir10a在费城染色体阴性的骨髓增生性肿瘤患者的巨核细胞中几乎不表达，而在正常巨核细胞中明显表达，mir10a能抑制费城染色体阴性的骨髓增生性肿瘤发生，通过检测巨核细胞中mir10a的表达量可协助诊断费城染色体阴性的骨髓增生性肿瘤。yu j等30研究发现侵袭性鳞状细胞癌中mir205表达量明显升高，抑癌基因ship2表达量明显降低，通过抑制癌细胞中mir205的表达可以增加侵袭性鳞状细胞癌中抑癌基因ship2的表达量，抑制肿瘤发展和侵袭转移，mir205在侵袭性鳞状细胞癌的治疗方面具有重要作用。chang kw31研究发现口腔癌组织中mir2