碱性磷酸酶比活力测定课件

1、碱性磷酸酶比活力测定1 碱性磷酸酶比活力的测定碱性磷酸酶比活力的测定 碱性磷酸酶比活力测定2 1.1.学习分光光度法测定的原理和方法学习分光光度法测定的原理和方法 掌握碱性磷酸酶比活测定的方法掌握碱性磷酸酶比活测定的方法 一、目的要求 碱性磷酸酶比活力测定3 二、原理二、原理 （一）、比色分析法（一）、比色分析法 光的互补示意图光的互补示意图 1. 物质的颜色和波长：物质的颜色和波长： 可见光：波长（可见光：波长（）400760nm 紫外光：紫外光：小于小于400nm 红外光：红外光：大于大于760nm 2. 溶液的颜色和光吸收的关系：溶液的颜色和光吸收的关系： 溶液的颜色，是由于不同的有色物

2、质有选择地吸收某种颜溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜 色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相 互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。 碱性磷酸酶比活力测定4 3. 物质浓度，液层厚度与光吸收的关系物质浓度，液层厚度与光吸收的关系 （Lambert-Beer定律）：定律）： 当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（D） 与溶液的浓度（与溶液的浓度（C），），液层的厚（液层的厚（L）以及入射光的强以及入射光的强

3、 度（度（I0）有关。溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多，有关。溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多， 这就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸收这就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸收 定律。定律。 碱性磷酸酶比活力测定5 4. 待测溶液浓度的计算：待测溶液浓度的计算： （1 1）标准管法：）标准管法： 在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（D D） 值，然后计算：值，然后计算： C C未知 未知 = =（D D未知 未知/ /D D标准标准） ）C C标准 标准 （2 2）标准曲线法：）标准曲线法： 分析大批待测样品时，采用此法较方便。

4、先配制一系列分析大批待测样品时，采用此法较方便。先配制一系列 浓度由小到大的标准溶液，测出它们的光密度（浓度由小到大的标准溶液，测出它们的光密度（D D）值。值。 在一定浓度范围内，溶液浓度（在一定浓度范围内，溶液浓度（C C）与其光密度（与其光密度（D D）之之 间呈直线关系。以各管间呈直线关系。以各管D D为纵坐标，为纵坐标，C C为横坐标，绘制标为横坐标，绘制标 准曲线。待测溶液准曲线。待测溶液D D值测出后，在曲线上查出值测出后，在曲线上查出C C。 碱性磷酸酶比活力测定6 1%1%浓度，浓度，1 1cmcm厚度溶液中测得：厚度溶液中测得：K = E1cm1%K = E1cm1% 或克

5、分子浓度，或克分子浓度，cmcm厚度溶液中测得：厚度溶液中测得：K = K = C = D/E1cm%, C = D/E1cm%, 或或 C = D/C = D/ 常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分 别在别在280280nmnm和和260260nmnm处有最大吸收，其消光系数可查处有最大吸收，其消光系数可查 到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度, , 带入带入 上式即可求得上式即可求得C C。 （3 3）消光系数法：）消光系数法： 碱性磷酸酶比活力测定7 （二）、酶活力（二）、酶活力 在在37 C下，

6、以下，以5mmol/L pNPP为底物，在为底物，在pH 10.1的的 碳酸盐缓冲液含碳酸盐缓冲液含2 mmol/L 的测活体系中每分的测活体系中每分 钟催化产生钟催化产生的酶量定为的酶量定为1个酶活力单个酶活力单 位。位。 酶的比活力定义为每酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位蛋白所具有的酶活力单位 数。数。 碱性磷酸酶比活力测定8 酶活性测定前处理酶活性测定前处理 1、2号样品稀释号样品稀释50倍（用洗脱液稀释）倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释号样品稀释20倍（用洗脱液稀释）倍（用洗脱液稀释） 4号样品不稀释（用洗脱液稀释）号样品不稀释（用洗脱液稀释） 蛋白浓度测定前处理蛋白浓度测

7、定前处理 1、2号样品稀释号样品稀释100倍（用洗脱液稀释）倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释号样品稀释20倍（用洗脱液稀释）倍（用洗脱液稀释） 4号样品对倍稀释（用洗脱液稀释）号样品对倍稀释（用洗脱液稀释） 碱性磷酸酶比活力测定9 12支试管，支试管，1-4做两组平行测定管，做两组平行测定管，01-04作为空白对照作为空白对照 管管 号号空白空白（01-04） 1-12-23-34-4 5 mM pNPP(mL) 各各0.2mL Na2CO3-NaHCO3 (mL) 各管加入各管加入1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 (mL) 各管加入各管加入0.2 mL H2O (mL) 各各0.

8、50mL 混匀，混匀，37，5分钟分钟 酶液（酶液（mL） /各各0.1mL 37，精确反应，精确反应10分钟分钟 0.1 mol/L NaOH (mL) 各管加入各管加入2.0 mL 酶液（酶液（mL） 0.1mL OD 405 nm 碱性磷酸酶比活力测定10 蛋白浓度测定蛋白浓度测定 1. 测定测定100 g/mL牛血清白蛋白溶液的牛血清白蛋白溶液的OD值值； 2. 将稀释后的样品在将稀释后的样品在280nm下测定吸光度；下测定吸光度； 3. 以洗脱液作空白。以洗脱液作空白。 蛋白浓度按下式计算：蛋白浓度按下式计算： 280280 OD C OD /100 未知 牛血清白蛋白mLg 碱性磷酸酶比活力测定11 数据处理数据处理 单位时间单位时间0.1mL酶液催化产物量计算：酶液催化产物量计算： 克分子消光系数法克分子消光系数法 OD C 108 . 8OD )1 (/1 3 405 未知 ）（ 光程 cmLmolPNP 即即 C未知OD/(8.8103) 碱性磷酸酶比活力测定12 A V C = (mg/mL) Vt B =(U/mL) 2 1 蛋白浓度 酶活力 计算： 式中：A为稀释倍数，B为由消光系数法计算得的 pNP m