外周血循环肿瘤细胞检测技术进展

1、 主要内容主要内容 循环肿瘤细胞检测的意义循环肿瘤细胞检测的意义 循环肿瘤细胞检测的基本原理循环肿瘤细胞检测的基本原理 纳米材料技术在循环肿瘤细胞检测中的应用纳米材料技术在循环肿瘤细胞检测中的应用 微流控技术在循环肿瘤细胞检测中的应用微流控技术在循环肿瘤细胞检测中的应用 循环肿瘤细胞循环肿瘤细胞 （circulating tumor cells, CTCs） 1896年年Ashworth在患者外周血中发现与原发肿瘤细在患者外周血中发现与原发肿瘤细 胞胞 体积和形态相似的细胞；体积和形态相似的细胞； 目前目前CTCs定义为自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发定义为自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发 灶或转

2、移灶进入外周血循环的一类肿瘤细胞。灶或转移灶进入外周血循环的一类肿瘤细胞。 Ashworth TR. Aust Med J, 1869, 14: 146-147 Allard WJ, Matera J, Miller MC, et al. Clin Cancer Res, 2004, 10: 6897-6904 研究研究CTCs的临床意义的临床意义 TNM分期的重要补充分期的重要补充 疗效监测和预后判断疗效监测和预后判断 个体化治疗的指导个体化治疗的指导 转移复发的早期预警转移复发的早期预警 血循环转移的机制血循环转移的机制 TNM分期的重要补充分期的重要补充 CTCs的临床意义的临床意义 疗

3、效监测和预后判断疗效监测和预后判断 CTCs的临床意义的临床意义 个体化治疗的指导个体化治疗的指导 CTCs的临床意义的临床意义 转移复发的早期预警转移复发的早期预警 CTCs的临床意义的临床意义 血循环转移的机制血循环转移的机制 CTCs的临床意义的临床意义 CTCs特点特点 外周血含量低：110个CTC/mL血液1 个 CTC/109 个血细胞； CTCs特性、形态及细胞标志随着内环境改 变而改变，无统一鉴定标准。 CTC的的 检测步检测步 骤骤 检测检测 富集富集 以特异性 抗体经抗 原抗体吸 附筛选 根据细胞 大小进行 富集 免疫细胞 化学结合 纳米材料 物理学免疫学免疫/化学 CTC

4、富集方法富集方法 免疫磁性分离免疫磁性分离 阳性选择法阳性选择法 MACS、Cellsearch系统以及系统以及CTC-Chip 阴性排除法阴性排除法 CD45磁珠去除白细胞（磁珠去除白细胞（IMB法）法） 抗原抗体吸附筛选抗原抗体吸附筛选 光镜下(放大倍数400倍)免疫磁珠吸附目标 细胞 分子生物分子生物 学方法学方法 (PCR) CTC 检测检测 免疫细胞免疫细胞 化学方法化学方法 (ICC(ICC、 EPISPOT)EPISPOT) 流式细流式细 胞技术胞技术 CellTracks AutoPrep System CellSearch 检测CTCs 流程图 1 1、不同肿瘤表面抗体的表达

5、量存在差异、不同肿瘤表面抗体的表达量存在差异 2 2、肿瘤发展过程中细胞的去上皮化、肿瘤发展过程中细胞的去上皮化 CTC研究现状研究现状 磁珠体积很小，不损伤细胞、不影响细胞功能、磁珠体积很小，不损伤细胞、不影响细胞功能、 不影响细胞的特异染色不影响细胞的特异染色( (细胞膜，细胞质，细胞细胞膜，细胞质，细胞 核核) )，显微镜下可直接观察或计算机计数。，显微镜下可直接观察或计算机计数。 前期应用微米磁珠，比表面积小、尺寸大、稳定前期应用微米磁珠，比表面积小、尺寸大、稳定 性差、易聚沉，致细胞分离效率低，难洗脱并保性差、易聚沉，致细胞分离效率低，难洗脱并保 持细胞活性；持细胞活性； 检测成本高

6、、样品用量多、样品检测时间长、检检测成本高、样品用量多、样品检测时间长、检 测过程封闭等诸多不足测过程封闭等诸多不足 纳米技术增大比表面积，分散性好，降低机械压纳米技术增大比表面积，分散性好，降低机械压 力，提高富集率力，提高富集率 CTC方法学现状方法学现状 纳米技术纳米技术 纳米科技是指在纳米尺度(从单个原子、分子到亚 微米尺度之间)上研究物质特性和相互作用，以及 由纳米结构集成的功能系统。以此可获得结构可 控、表面功能化的纳米材料和纳米结构； 纳米材料具有一些独特的效应，包括小尺寸效应、 量子尺寸效应、界面效应以及宏观量子遂道效应， 使纳米材料在性能上与具有相同组成的传统概念 上的微米材

7、料有非常显著的差异，表现出许多优 异的性能和全新的功能； 纳米技术增大比表面积，分散性好，降低机械压纳米技术增大比表面积，分散性好，降低机械压 力，提高富集率。力，提高富集率。 基于非磁性纳米材料的基于非磁性纳米材料的CTC 富集富集 基于纳米材料修饰表面 将抗体功能化的不同形状的纳米材料(纳米颗粒、纳米线等) 提高了细胞与捕获靶点的接触几率、方便将CTC 细胞从表面 洗脱，减少纳米颗粒吸附对于细胞活力和分析检测的影响 Sekine J, et al. Adv Mater, 2011, 23 (41):4788-4792 Zhang N, et al. Adv Mater, 2012, 24

8、(20):2756-2760 基于非磁性纳米材料的基于非磁性纳米材料的CTC 富集富集 基于纳米结构表面 肿瘤细胞和正常细胞在粗糙表面上具有不同的黏附特性，利用纳米 粗糙表面(如功能化的纳米线、纳米柱)分离血液中的CTC Chen W Q,et al. ACS Nano, 2013, 7 (1): 566-575 Hou S, et al. Adv Mater, 2013, 25(11): 1547-1551 微流控技术微流控技术 微流控技术是一种针对极小量(10-9 10-18 L)流体进行操控的系统科学技术; 微流控芯片是微流控技术实现的主要 平台和技术装置，其主要特征是容纳 流体的有效结

9、构(通道、反应室和其他 某些功能部件)至少在一个维度上为微 米级尺度。 纳米技术与微流控技术结合纳米技术与微流控技术结合 CTC-chips 纳米技术与微流控技术结合纳米技术与微流控技术结合 磁性纳米材料与微流控结合用于CTC 富集； 非磁性纳米材料与微流控结合用于CTC富集。 磁性纳米材料与微流控结合 与CellSearchTM原理类似； 微流控芯片的样品量小、流速可控及构件 透明； 磁珠用量减少25%。 非磁性纳米材料与微流控结合 第二代第二代CTC-chips A) The HB-Chip consists of a microfluidic array of channels with

10、 a single inlet and exit. Inset illustrates the uniform blood flow through the device. (B) A micrograph of the grooved surface illustrates the asymmetry and periodicity of the herringbone grooves. Cartoon illustrating the cell- surface interactions in (C) the HB-Chip, and (D) a traditional flat-wall

11、ed microfluidic device. Flow visualization studies using two paired streams of the same viscosity (one stream is green, the other clear) demonstrate (E) the chaotic microvortices generated by the herringbone grooves, and the lack of mixing in (F) traditional flat-walled devices. 旧方法旧方法: :病人血液样本通 过一种

12、表层涂有抗体的 硅芯片，该抗体与肿瘤 细胞结合，血液平滑流 过microposts限制了与 抗体覆盖层的接触。 新方法：新方法：将血液标本经 过一个人字形沟槽，可 快速混合液体，并产生 一个更乱的血流，显著 增加捕获细胞的数量。 Toner M, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010，107(43):18392-7 HB-chips Blood from metastatic prostate cancer patients and healthy donors was processed using the HB-Chip. (A) Healthy do

13、nors (n = 10, red circles) were used to select the signal intensity threshold in our automated imaging system (19). The metastatic prostate cancer patient data (n = 15, green circles) had significantly higher results, with 14 15 patient samples presenting CTCs above-threshold levels. Additionally, (

14、B) the TMPRSS2-ERG fusion transcript was detected from RNA isolated from the HB-Chip, using RT-PCR. Sequencing of the gel band identified the rare gene fusion of TMPRSS2 exon 1 and ERG exon 5. (C and D) Micrographs of CTCs isolated from patients with metastatic prostate cancer costained using antibo

15、dies against PSA (green), a leukocyte marker, CD45 (red), and a nuclear stain (DAPI). Corresponding micrographs of the same cells are shown to the right of the fluorescent images, demonstrating their appearance after subsequent staining with H and E. (Scale bars: 10 m). Toner M, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010，107(43):18392-7 Toner M, et al. Proc Natl Acad Sci