血清谷丙转氨酶活性的测定课件

1、血清谷丙转氨酶活性的测定1 赖氏法测定血清谷丙赖氏法测定血清谷丙 转氨酶活性转氨酶活性(ALT)(ALT)的测的测 定定 血清谷丙转氨酶活性的测定2 【目的要求目的要求】 n1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 n2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作 方法。 n3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。 血清谷丙转氨酶活性的测定3 【实验原理实验原理】 ALT催化丙氨酸与-酮戊二酸之间的氨基转移, 生成丙酮酸和谷氨酸,在37, pH7.4,经30min反应之 后，加入2,4-二硝基苯肼终止反应,并与反应中的二 种-酮酸生成2,4-二硝基苯腙,在碱性条件下显红棕 色,于波长505nm处

2、读取A值。 两种苯腙的吸收光谱曲线在500520nm处差异 最大,丙酮酸苯腙的呈色强度是-酮戊二酸苯腙的3 倍,据此可以计算出丙酮酸的生成量,后者与血清中的 ALT的活性浓度成正比。 血清谷丙转氨酶活性的测定4 【实验原理实验原理】 n丙氨酸丙氨酸+-酮戊二酸酮戊二酸 丙酮酸丙酮酸+ +谷氨酸谷氨酸 ALT 2,4-2,4-二硝基苯肼二硝基苯肼 -酮戊二酸酮戊二酸-2,4-2,4-二硝基苯腙二硝基苯腙丙酮酸丙酮酸-2,4-2,4-二硝基苯腙二硝基苯腙 0. 4mol/LNaOH0. 4mol/LNaOH 红棕色红棕色红棕色红棕色（三倍）（三倍） 卡门单位卡门单位: :1ml1ml血清血清在在2

3、5,340nm,25,340nm,体积为体积为3ml,3ml,光径为光径为1cm1cm每分钟每分钟光密光密 度度下降下降0.0010.001的酶量。的酶量。 血清谷丙转氨酶活性的测定5 1 1、主要器具、主要器具 微量移液器微量移液器 【实验仪器实验仪器】 可见分光光度计可见分光光度计 血清谷丙转氨酶活性的测定6 【实验试剂实验试剂】 n10.1mol/L0.1mol/L磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（pH7.4pH7.4） n2基质缓冲液基质缓冲液 精确称取D-L-丙氨酸1.79g,-酮戊二酸29.2mg, 先溶于0.1mol/L磷酸盐缓冲液约50ml中,用1mol/L NaOH调pH至7.4,

4、再加磷酸盐缓冲液至100ml,每升底 物缓冲液中可加氯仿防腐,4保存。 n31.0mmol/L 21.0mmol/L 2，4-4-二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液 n40.4mol/L NaOH0.4mol/L NaOH溶液溶液 n52.0mmol/L2.0mmol/L丙酮酸标准液丙酮酸标准液 n6待测标本待测标本: : 病人血清或质控血清。病人血清或质控血清。 血清谷丙转氨酶活性的测定7 【操作步骤操作步骤】 n（1）待测血清的测定 加入物加入物(ml)(ml)对照管对照管测定管测定管 血清血清0.10.10.10.1 基质缓冲液基质缓冲液0.50.5 混匀，混匀，3737水浴水浴30min0m

5、in 2 2，4-4-二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液0.50.50.50.5 基质缓冲液基质缓冲液0.50.5 混匀，混匀，3737保温保温20min0min 0.4mol/L NaOH0.4mol/L NaOH溶液溶液5.05.05.05.0 混匀，室温放置混匀，室温放置5min5min，在波长为，在波长为505nm505nm处比色，处比色，蒸馏水调蒸馏水调“0”0” 血清谷丙转氨酶活性的测定8 【操作步骤操作步骤】 n（2）校正曲线的制备 加入物加入物(ml)(ml)01234 0.1mol/L0.1mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.

6、1 2.0mmol/L2.0mmol/L丙酮酸标准液丙酮酸标准液0 00.050.050.100.100.150.150.200.20 基质缓冲液基质缓冲液0.500.500.450.450.400.400.350.350.300.30 1.0mmol/L 21.0mmol/L 2，4-4-二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5 混匀，混匀，3737保温保温20min0min 0.4mol/L NaOH0.4mol/L NaOH溶液溶液5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0 卡门单位卡门单位0 02828575797971

7、50150 混匀，室温放置混匀，室温放置5min5min，在波长为，在波长为505nm505nm处比色，处比色，蒸馏水调蒸馏水调“0”0” 血清谷丙转氨酶活性的测定9 取取7 7支试管，按下表操作支试管，按下表操作 卡门单位卡门单位0 0282857579797150150 加入物加入物(ml)(ml)对照管对照管测定管测定管0 01 12 23 34 4 血清血清0.10.10.10.1 基质缓冲液基质缓冲液0.50.5 混匀，混匀，3737水浴水浴30min0min 0.1mol/L0.1mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1 2.0

8、mmol/L2.0mmol/L丙酮酸标准液丙酮酸标准液0 00.050.050.100.100.150.150.200.20 基质缓冲液基质缓冲液0.500.500.450.450.400.400.350.350.300.30 1.0mmol/L 21.0mmol/L 2，4-4-二硝基苯二硝基苯 肼溶液肼溶液 0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5 基质缓冲液基质缓冲液0.50.5 混匀，混匀，3737保温保温20min0min 0.4mol/L NaOH0.4mol/L NaOH溶液溶液5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.

9、05.05.05.05.0 混匀，室温放置混匀，室温放置5min5min，在波长为，在波长为505nm505nm处比色，处比色，蒸馏水调蒸馏水调“0”0” 血清谷丙转氨酶活性的测定10 【实验结果实验结果】 1.校正曲线的制备 以标准管各管的A值-“0”号管的A值,所得差 值与对应酶卡门氏单位作图,即成校正曲线。 2.测定管 测定管A值-对照管A值,根据所得差值，从校正 曲线查得标本中ALT的卡门氏单位。 参考值范围：参考值范围：5-255-25卡门单位卡门单位 血清谷丙转氨酶活性的测定11 【注意事项注意事项】 n1.血清和底物应于37水浴后操作,最好置37水浴 箱中操作。以一定时间加入，各

10、管即时混匀,以第一 管开始计时,准确反应30分钟,各管加入时间间隔一致, 保证每管反应时间均为30分钟。 n2.加入2,4-二硝基苯肼溶液后,应充分混匀,使反应完 全。 n3.加入NaOH溶液的方法和速度要一致,如液体混合不 完全或加入速度不同均会导致吸光度的差异。 n4.底物和显色剂均为呈色物质,称量必须很准确。 n5.呈色的深浅与NaOH的浓度也有关系,其浓度越大呈 色越深,但其浓度0.25M时,吸光度下降变陡,因此浓 度要准确。 血清谷丙转氨酶活性的测定12 【方法【方法学学评价评价 】 n1.重复性差重复性差 n1) 由于限制了-酮戊二酸的用量。使生成量与 酶活性不能呈现良好的线性关系。 n2) 2,4-二硝基苯肼在碱性条件下也能显色,为了 降低试剂空白的吸光度而不得不使用低浓度的 2,4-二硝基苯肼,此种水平的苯肼仅能与反应体系 中的两种酮酸的一半反应。 n3) 产物旁路效应：丙酮酸在LDH的催化作用下的 消耗。 血清谷丙转氨酶活性的测定13 【方法【方法学学评价评价 】 2.准确性差准确性差：线性范围狭窄,尽管标本采用稀释 后测定,但偏差仍较大。 3.试剂稳定性差试剂稳定性差 4.操作简单操作简单 血清谷丙转氨酶活性的测定14 【临床意义】【临床意义】 n 肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾 病致肝细胞受损伤时，ALT即