基因治疗生物化学

1、基因治疗生物化学1 l基因治疗（基因治疗（gene therapy）是向靶细胞导入外源基因，）是向靶细胞导入外源基因， 以纠正或补偿基因缺陷，达到治疗遗传病目的。以纠正或补偿基因缺陷，达到治疗遗传病目的。 l人类遗传疾病人类遗传疾病5000多种，基本上不可能用常规方法治多种，基本上不可能用常规方法治 疗。个别病例只能对症疗法，减轻症状，不能治愈。疗。个别病例只能对症疗法，减轻症状，不能治愈。 基因治疗可能是唯一的方法。基因治疗可能是唯一的方法。 l1990年美国重组年美国重组DNA咨询委员会批准治疗腺苷脱氨酶咨询委员会批准治疗腺苷脱氨酶 （ADA）临床治疗方案，）临床治疗方案，2个病例症状改善

2、。个病例症状改善。 l1991B，患者症状有所改善，患者症状有所改善 基因治疗生物化学2 l 1. 1. 基因调控治疗基因调控治疗 l 从基因水平调控缺陷基因表达，改善症状从基因水平调控缺陷基因表达，改善症状 镰型细胞贫血症镰型细胞贫血症-用用5-氮胞苷抑制甲基化酶，使氮胞苷抑制甲基化酶，使 因甲基化而关闭的因甲基化而关闭的基因重新开放，产生基因重新开放，产生HbF代代 替替HbA l用反义用反义RNA抑制基因表达抑制基因表达 l核酶（核酶（ribozyme）切割）切割RNA阻断基因表达阻断基因表达 l肿瘤治疗，在基因水平抑制肿瘤细胞基因恶性肿瘤治疗，在基因水平抑制肿瘤细胞基因恶性 表达和引导

3、肿瘤细胞逆转。表达和引导肿瘤细胞逆转。 基因治疗生物化学3 2. 基因矫正治疗基因矫正治疗 基因增补基因增补正常基因导入患者体内补偿缺陷基因功能正常基因导入患者体内补偿缺陷基因功能 基因替换基因替换以正常基因取代变异基因以正常基因取代变异基因 基因校正基因校正体外对异常基因进行纠正。体外对异常基因进行纠正。 基因治疗生物化学4 按矫正基因的类型分为两种基因治疗：按矫正基因的类型分为两种基因治疗： 生殖细胞基因治疗生殖细胞基因治疗 对生殖细胞或早期胚胎细胞进行基因矫正。对生殖细胞或早期胚胎细胞进行基因矫正。 体细胞基因治疗体细胞基因治疗 以体细胞为受体细胞，不影响下一代以体细胞为受体细胞，不影响

4、下一代 常用细胞介导法：选择靶细胞在体外进行基因常用细胞介导法：选择靶细胞在体外进行基因 修饰，再将其输入体内。修饰，再将其输入体内。 基因治疗生物化学5 基因置换（gene replacement） 定义：将特定目的基因导入特定细胞，通过定定义：将特定目的基因导入特定细胞，通过定 位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原有位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原有 的缺陷基因。的缺陷基因。 目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复， 不涉及基因组的任何改变。不涉及基因组的任何改变。

5、 基因治疗生物化学6 l定向整合的条件定向整合的条件:转导基因的载体与基因组转导基因的载体与基因组DNA具有具有 相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组 的位点，进行部分基因序列的交换。的位点，进行部分基因序列的交换。 l基因同源重组技术又称为基因同源重组技术又称为基因打靶基因打靶(gene targeting） l细胞内基因同源重组的发生率很低。细胞内基因同源重组的发生率很低。 基因同源重组技术基因同源重组技术 基因治疗生物化学7 基因增补（gene augmentation） 定义定义: : 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身通过导入外

6、源基因使靶细胞表达其本身 不表达的基因。不表达的基因。 类型类型: : n有缺陷基因细胞中导入正常基因，而细胞内有缺陷基因细胞中导入正常基因，而细胞内 的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的 表达产物，补偿缺陷基因的功能；表达产物，补偿缺陷基因的功能； n向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因， 利用其表达产物达到治疗疾病的目的。利用其表达产物达到治疗疾病的目的。 基因治疗生物化学8 基因干预（gene interference） 基因失活 定义：定义： 采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破采用特定的方式抑制某个

7、基因的表达，或者通过破 坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾 病的目的。病的目的。 基因治疗生物化学9 （一）反义（一）反义RNA（antisense RNA） 1. 反义反义RNA与基因表达调控与基因表达调控 利用反义利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调对体外培养的细胞进行基因表达调 控，通常采用的方法有两种：控，通常采用的方法有两种： （1）体外合成反义）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收，直接作用于培养细胞，细胞吸收 RNA后，发挥作用。后，发挥作用。 （2）构建一些能转录反义）构建一些能转录反义RNA的重组质粒，

8、将这些质粒转入的重组质粒，将这些质粒转入 细胞中，转录出反义细胞中，转录出反义RNA而发挥作用。而发挥作用。 基因治疗生物化学10 反义RNA技转移术 受体介导的受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高；转移十分专一，而且效率高； 被转移的被转移的RNA是被保护的，与周围环境之间是被保护的，与周围环境之间 存在多聚赖氨酸的保护层存在多聚赖氨酸的保护层, 可以抵抗环境中可以抵抗环境中 的核酸酶的降解作用。的核酸酶的降解作用。 借助前述的受体介导基因转移方法，可借助前述的受体介导基因转移方法，可 以实现受体介导的反义以实现受体介导的反义RNA转移。转移。 基因治疗生物化学11 反义RNA的优点 受

9、体介导的反义受体介导的反义RNA基因治疗有其自身的优点，基因治疗有其自身的优点， 而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。 （l）安全性高）安全性高 （2）反义）反义RNA设计和制备方便设计和制备方便 （3）具有剂量调节效应）具有剂量调节效应 （4）能直接作用于一些）能直接作用于一些RNA病毒病毒 基因治疗生物化学12 核酶 (ribozyme) 天然核酶多为单一的天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我分子，具有自我 剪切作用。但核酶也可以由两个剪切作用。但核酶也可以由两个RNA分子组成。分子组成。 在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶在基因治疗时，利用核酶分

10、子结合到靶 RNA分子中适当的部位，形成锤头状核酶结构，分子中适当的部位，形成锤头状核酶结构， 将靶将靶RNA分子切断，通过破坏靶分子切断，通过破坏靶RNA分子而达分子而达 到治疗疾病的目的。到治疗疾病的目的。 基因治疗生物化学13 只要两个RNA分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级 结构（3个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（13个或11个保守 核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。 目目 录录 基因治疗生物化学14 1.核酶的设计 核酶是通过靶核酶是通过靶RNA分子与核酶分子共同组成酶活分子与核酶分子共同组成酶活 性结构域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核性结构域，要从靶分子

11、和核酶分子两个方面来设计核 酶。酶。 （1 1）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点，）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点， 能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。 （2）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由 三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结 构域），两端是引导序列。构域），两端是引导序列。 基因治疗生物化学15 干扰干扰RNA 1.RNA干扰现象干扰现象 RNA干扰干扰（RNA interference， RNAi）是一种由双是一种由双 链链R

12、NA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链 RNA有同源序列的信使有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从）被降解，从 而抑制该基因的表达。有义而抑制该基因的表达。有义RNA（sense RNA）或反）或反 义义RNA（antisense RNA）均能抑制线虫基因的表达，）均能抑制线虫基因的表达， 双链双链RNA比单链比单链RNA更为有效。这与传统上对反义更为有效。这与传统上对反义 RNA技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的 效率比反义效率比反义RNA至少高至少高2个数量级。个数量级。 基因治疗生物化学16

13、2.RNA干扰的机制 RNA干扰过程主要有干扰过程主要有2个步骤：个步骤： （1）小干扰性）小干扰性RNA（siRNA） （2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体， 称为称为RNA诱导的沉默复合体（诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC)。 基因治疗生物化学17 研究基因功能的新工具 由于由于 RNA干扰技术具有高度的序列专一性干扰技术具有高度的序列专一性 和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功 能丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强能丧失，因此可以作为功

14、能基因组学的一种强 有力的研究工具。有力的研究工具。 RNA干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定 基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的 时间可以控制在发育的任何阶段。时间可以控制在发育的任何阶段。 基因治疗生物化学18 1. 体外化学合成; 2.用质粒载体或病毒载体可在细胞内稳定 地生成。 siRNA的产生的产生 基因治疗生物化学19 l定义：定义：将将“自杀自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因基因导入宿主细胞中，这种基因 编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代 谢物，诱导靶

15、细胞产生谢物，诱导靶细胞产生“自杀自杀”效应，从而达到清效应，从而达到清 除肿瘤细胞的目的。除肿瘤细胞的目的。 l应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法。应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法。 （四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗(Suicide Gene Therapy) 基因治疗生物化学20 （五）基因免疫调节 通过将抗癌免疫增强的细胞因子或通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC 基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的 抗癌免疫反应。抗癌免疫反应。 基因治疗生物化学21 对导入的基因及其产物有详尽了解；对导入的基因及其产物有详尽了解； 外源基因有效导入受体细胞

16、、稳定整合、外源基因有效导入受体细胞、稳定整合、 适量表达；适量表达； 不影响受治细胞基因组及表达调控；不影响受治细胞基因组及表达调控； 导入基因方法安全，载体对靶细胞无害；导入基因方法安全，载体对靶细胞无害； 基因治疗生物化学22 l 对象是病情严重、预后差、别无他法对象是病情严重、预后差、别无他法 的患者的患者 l转移的基因被克隆转移的基因被克隆 l无需高水平表达和精确定量控制就有治无需高水平表达和精确定量控制就有治 疗效果疗效果 l靶细胞获取或回输安全靶细胞获取或回输安全 l转移基因表达对细胞微环境无严格特异转移基因表达对细胞微环境无严格特异 性要求性要求 基因治疗生物化学23 l 目的

17、（治疗）基因的选择目的（治疗）基因的选择 根据基因治疗类型选择相应目的基因根据基因治疗类型选择相应目的基因（增（增 补、替换、添加）补、替换、添加） l 基因载体的构建基因载体的构建 使目的基因在受体细胞内高效、可控、使目的基因在受体细胞内高效、可控、 稳定地表达稳定地表达 l 受体细胞选择受体细胞选择 易分离获取，体外增殖存活，大量扩增。易分离获取，体外增殖存活，大量扩增。 如成纤维细胞、淋巴细胞、骨髓造血干细胞如成纤维细胞、淋巴细胞、骨髓造血干细胞 基因治疗生物化学24 基因转移基因转移(gene transfer)方法方法 1.病毒介导的基因转移病毒介导的基因转移 2.非病毒介导的基因转

18、移非病毒介导的基因转移 基因治疗生物化学25 1. 1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导基因转移效率较高病毒载体介导基因转移效率较高 据统计，有据统计，有72%72%的临床实验计划和的临床实验计划和71%71%的病的病 例使用了病毒载体，其中用得最多的是反转例使用了病毒载体，其中用得最多的是反转 录病毒载体。录病毒载体。 基因治疗生物化学26 反转录病毒的结构及生活周期反转录病毒的结构及生活周期 （1 1）反转录病毒）反转录病毒 基因治疗生物化学27 （2）腺病毒）腺病毒(adenovirus)载体载体 通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组通过受体介导的

19、内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组 转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞 基因组中。基因组中。 腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，尚未发现与肿瘤腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，尚未发现与肿瘤 发生有关联。发生有关联。 基因治疗生物化学28 常用基因治疗载体常用基因治疗载体 整合整合致病性致病性感染细胞感染细胞克隆容量克隆容量 反 转 录 病 毒反 转 录 病 毒 载体载体 随机整合，效率随机整合，效率 高高 可能致病可能致病分裂细胞分裂细胞7kb7kb 腺病毒载体腺病毒载体不整合，可能丢不整合，可能丢 失失 不致病不致病分裂细胞、

20、非分裂细胞、非 分裂细胞分裂细胞 腺相关病毒载腺相关病毒载 体体 定点整合定点整合( (1919号染号染 色体特定区域色体特定区域) ) 不致病不致病分裂细胞、非分裂细胞、非 分裂细胞分裂细胞 5kb5kb 7.5kb7.5kb 基因治疗生物化学29 2.非病毒载体介导的基因转移系统非病毒载体介导的基因转移系统 （1）脂质体介导的基因转移技术）脂质体介导的基因转移技术 使用方便、成本低廉。使用方便、成本低廉。 基本原理基本原理: 利用阳离子脂质体单体与利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可形成包埋混合后，可形成包埋 外源外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细的脂质体，然后与细胞一起

21、孵育，即可通过细 胞内吞作用将外源胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，（即目的基因）转移至细胞内， 并进行表达并进行表达。 基因治疗生物化学30 （2）受体介导转移技术 将将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，与细胞或组织亲和性的配体偶联， 可使可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多具有靶向性。这种偶联通常通过多 聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳 离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作 用与带负电荷的用与带负电荷的DNA结合，将结合，将DNA包围，只包围，只 留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可

22、留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可 被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外 源源DNA导入靶细胞。导入靶细胞。 基因治疗生物化学31 （3）基因直接注射技术）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露DNA注入动物注入动物 肌肉或某些器官组织内。肌肉或某些器官组织内。 动物实验表明：接受注射外源动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码的小鼠能够按其基因编码 合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。 将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁 内毛细血管增加内毛细血管增加30%40%； 将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛 素；素；