流式细胞术贝克曼

1、 临床应用临床应用 疾病诊断疾病诊断:为疾病诊断提供直接的或支持诊断的依据为疾病诊断提供直接的或支持诊断的依据 免疫调节免疫调节：细胞因子：细胞因子/受体的相互作用受体的相互作用 共刺激分子受体共刺激分子受体/配体的相互作用配体的相互作用 发病机理发病机理：肿瘤的发病与机体的免疫力低下、以及信号传递肿瘤的发病与机体的免疫力低下、以及信号传递 障碍有关障碍有关 药物药物/疫苗效果的评价疫苗效果的评价：肿瘤生物治疗的时机选择、以及效果肿瘤生物治疗的时机选择、以及效果 的监测的监测 免疫状态评价免疫状态评价： 移植、放化疗等移植、放化疗等. 细胞周期分析细胞周期分析: :在细胞周期在细胞周期( (G

2、0G0，G1G1，S S， G2 G2 ，M)M)的各个时期，的各个时期，DNADNA的含量随各时相呈现的含量随各时相呈现 出周期性的变化。通过核酸染料标记出周期性的变化。通过核酸染料标记DNADNA，并并 由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时 期的分布状态，计算出期的分布状态，计算出G0/G1%G0/G1%，S%S%及及G2/M%G2/M%。 了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可 利用细胞周期蛋白（利用细胞周期蛋白（CYCLINCYCLIN）、）、Ki67Ki67、核增殖核增殖 抗原（抗原（PCNAPCN

3、A）等，对细胞周期进行精确的分期：等，对细胞周期进行精确的分期： G0G0、G1G1、S S、G2G2、M.M. DNA含量及细胞周期分析含量及细胞周期分析 0 200 400 600 8001000 DNA content C o u n t Normal Cell Cycle 1. 肿瘤的早期诊断。肿瘤的早期诊断。 2. 肿瘤的良恶性判断。肿瘤的良恶性判断。 3. 观察细胞的增殖状态及周期分布。观察细胞的增殖状态及周期分布。 4. 疗效监测疗效监测 细胞功能分析细胞功能分析 1.吞噬功能试验吞噬功能试验 2.氧爆发试验氧爆发试验 3.根据根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同将淋巴细胞分泌细胞因

4、子的不同将CD4+或或 CD8+分为介导细胞免疫的分为介导细胞免疫的I型细胞和介导体液型细胞和介导体液 免疫的免疫的II型细胞型细胞. 4.药物泵的功能检测药物泵的功能检测 5.NK细胞的肿瘤杀伤活性检测细胞的肿瘤杀伤活性检测 6.血小板的粘附血小板的粘附,聚集功能检测聚集功能检测 树突状细胞分析（树突状细胞分析（Dendritic Cells,DC) uDC是主要的抗原递呈细胞，同时又是重要的先 天免疫细胞，还是具有免疫调控功能的一个细胞 群，没有发现特异性的抗原标记 uDC研究的主要内容包括直接分析计数、体外诱 导检测,一般分为两群PDC,MDC u当前DC检测的方法： 1）Lin-,CD

5、11c,CD123,同时可能表达 CD80,CD86,CD83,DR等 2）利用BDCA1,2,3,4对外周血或其它组织DC进 行分析 3） CD14+16/CD85/CD33,CD14+16/CD85 /CD123 T细胞分析细胞分析 u相对计数相对计数淋巴细胞亚群数量检查项目和意义 疾病疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK 自身免疫病自身免疫病降低降低增高增高降低降低降低降低 AIDS降低降低严重严重 降低降低 增高增高降低降低 SARS降低降低降低降低降低降低降低降低降低降低 慢性活动性肝炎、慢性活动性肝炎、 肝硬化肝硬化 降低降低正常正常 或或 增高增高 降低降低降低降低 肿瘤肿瘤

6、降低降低降低降低增高增高降低降低降低降低 CD4细胞绝对计数细胞绝对计数 u对AIDS病人的诊断、疗效和预后有重要的指导 意义，一般认为CUTOFF值为200/ul. u绝对计数是加入浓度已知的标准微球与标本一起 测定，流式细胞仪控制软件在设置后能自动计算 出浓度 u对任何细胞群体都可以进行绝对计数 Th1Th2细胞因子分泌细胞测定细胞因子分泌细胞测定 u根据产生的细胞因子的类 型和生物学功能,人的4+ 细胞可以分为1、2 u1细胞产生 2、 12、 、 等 细胞因子,主要参与细胞介导的 免疫反应、迟发性过敏反应,并 在清除病毒等细胞内致病因子 方面起着重要作用 u2细胞分泌 4、 5、 6、

7、 10、 13等细胞因子,主要促进体液 免疫反应,中和胞外病原体 u相应地，CD8+T细胞也可以分 为Tc1和Tc2 Th1细胞：细胞：介导细胞免疫、细 胞毒性T细胞的生长和活化 、巨噬细胞的活化、介导 迟发型过敏反应。其功能 亢进将导致炎症慢性迁延 ，器官特异性自身免疫病 ，急性排异反应和接触性 皮炎等的发病和免疫病理 损伤。 Th2细胞细胞 ：介导体液免疫， 促进B细胞的生长、活化和 分化，是IgG1和IgE类抗 体的转换因子，其功能亢 进将导致特异性过敏反应 ，参与高IgE综合症和嗜酸 性粒细胞增多症。 Th1Th2检测检测Tips u一定要确定T细胞是否已经活化，细胞转运阻滞是否成功，

8、胞 膜打孔是否有效 u一定要用胞浆内同型对照（特别是FITC标记时） ，以便分别部分弱表达的细胞因子。 TETRAMER u抗原递呈细胞（APC）携带抗原片段通过与TCR复合物结合，在APC和T细 胞的MHC相容和其它共刺激分子的相互作用下激活T细胞并产生细胞免疫效 应。MHC-四聚体染色技术用于抗原特异性T细胞分析的原理在于体外模仿 上述抗原递呈的过程来实现对特异性T细胞的鉴定，通过流式细胞仪这种高 通量分析仪器对标本中这群细胞进行分析 u四聚体技术的优势是：可以对特异性免疫细胞进行定量；用流式细胞仪检测 可以快速测定大量细胞，可以同时进行其它表面染色，可以直接用外周血测 定而不需要培养；四

9、聚体染色不会杀伤细胞，因此染色后的细胞可以进行分 选或其它功能分析；四聚体对所有的特异性T细胞都能够结合，而不仅仅是 对有功能的细胞进行检测。 u不同厂家的MHC四聚体产品不太一样：贝克曼库尔特公司创造性地 构建和表达了MHC分子3链的区域突变的蛋白（iTAg），能降低 其与非特异性T细胞结合，大大提高了特异性。并且将MHC四聚体 直接标记荧光，和常用的抗原多肽负载后整体商品化，也有单独的 MHC分子（iTAg）单独出售，极大方便了研究者 CD4CD25 Treg u调控性T细胞的主要功能是抑制机体免疫功能，太强则免 疫耐受，太弱会引起自身免疫反应 u调控性T细胞调节抗原递呈细胞对抗原的递呈

10、u调控性T细胞的表型是CD4+CD25bright，逐渐发现越 来越多的其它分子可能能够更精确限定（eg.FOX-1?) uCD25也是免疫细胞晚期活化的标记，但表达的平均荧光 强度不足够强 非特异性的先天免疫细胞非特异性的先天免疫细胞 u细胞:占外周血T细胞的10以下，非抗原依赖型免 疫细胞，在传染病、肿瘤病人外周血数量增加，表达 CD3量较普通T细胞多 uNK细胞：占外周血淋巴细胞825，传染病和肿瘤病 人数量偏低。NK细胞可以根据NKR的不同而分类，丙型 肝炎的发生和预后可能与NK细胞的表型相关 uDC：分布与淋巴组织和外周血，为非成熟状态，遇到相 应的抗原后主要分泌IFN-alpha来

11、发挥左右 其它重要分子的流式分析的意义其它重要分子的流式分析的意义 u粘附分子：物种间高度保守，与细胞间通讯，干细胞 HOMING，肿瘤的发生可能有很重要的关系，如 CD11C/CD18-CD54与DC成熟和迁移有关； CD209-CD102与抗原递呈有关 uCD26:移植后造血干细胞表达可能不利于该细胞的 homing，有证据表明抑制造血干细胞有利用移植成功 流式细胞术在移植中的应用流式细胞术在移植中的应用 u移植配型和群体反应性抗体的检测 u荧光示踪标记的移植细胞：CFSE是一个确定的荧光标 记物，开发其它稳定的荧光素应该更有帮助 流式细胞仪分选流式细胞仪分选 u为达到最高的分选效率，实用

12、中最好先用磁珠分选系 统进行初步分选 u活细胞分选非常有用 流式细胞术在生物医学研究的新方向流式细胞术在生物医学研究的新方向 u细胞多态性分析：受体、抗原折叠、HLA等，包括 CXCR4,CCR5,DC-SIGN(与AIDS易感性有关）， NKR(中国科大研究领先项目） u信号传导（实际主要为胞浆内磷酸化及去磷酸化蛋白的 检测） u新型荧光特异性探针：胞内病原体检测、转录因子检测 、细胞器或细胞生命活动指标的新荧光素的应用 u利用分选的细胞进行体内和体外功能研究 u与其它定位性的荧光设备联合使用（如 MPE,CONFOCAL,IC100等） Cell Lab IC 100 Complete d

13、ata mining and analysis Flexible Analysis Plug-in architecture Scalable across an enterprise -2-1012345 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 Log EC50 FLIN u流式细胞仪是一个高通量的开发系流式细胞仪是一个高通量的开发系 统，随着新抗体和新标记的发现和统，随着新抗体和新标记的发现和 开发，将在疾病诊断和生物医学的开发，将在疾病诊断和生物医学的 研究方面为大家发挥更大的作用研究方面为大家发挥更大的作用 T细胞分析细胞分析 u相对计数相对计数淋巴细胞亚群数量检查项目和意义

14、疾病疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK 自身免疫病自身免疫病降低降低增高增高降低降低降低降低 AIDS降低降低严重严重 降低降低 增高增高降低降低 SARS降低降低降低降低降低降低降低降低降低降低 慢性活动性肝炎、慢性活动性肝炎、 肝硬化肝硬化 降低降低正常正常 或或 增高增高 降低降低降低降低 肿瘤肿瘤降低降低降低降低增高增高降低降低降低降低 CD4细胞绝对计数细胞绝对计数 u对AIDS病人的诊断、疗效和预后有重要的指导 意义，一般认为CUTOFF值为200/ul. u绝对计数是加入浓度已知的标准微球与标本一起 测定，流式细胞仪控制软件在设置后能自动计算 出浓度 u对任何细胞群体都可以进行绝对计数 CD4CD25 Treg u调控性T细胞的主要功能是抑制机体免疫功能，太强则免 疫耐受，太弱会引起自身免疫反应 u调控性T细胞调节抗原递呈细胞对抗原的递呈 u调控性T细胞的表型是CD4+CD25bright，逐渐发现越 来越多的其它分子可能能够更精确限定（eg.FOX-1?) uCD25也是免疫细胞晚期活化的标记，但表达的平均荧光 强度不足够强 其它重要分子的流式分析的意义其它重要分子的流式分析的意义 u粘附分子：物种间高度保守，与细胞间通讯，干细胞 HOMING，肿瘤的发生可能有很重要的关系，如 CD11C/CD18-