乙型肝炎血清学和分子生物学检测技术

1、乙型肝炎病毒血清学和分子生物乙型肝炎病毒血清学和分子生物 学检测技术学检测技术 临清市疾病预防控制中心临清市疾病预防控制中心 乙肝病毒研究历史 1963年Blumberg 在澳洲土著人血清中发现， 简称澳抗。 1970年Dane发现HBV病毒颗粒，称Dane颗 粒 1983年将HBV归为嗜肝病毒科 3 我国我国HBVHBV感染概况感染概况 一般人群HBsAg携带率高达7.18%；现有慢性HBV感 染者约9 300万人，占全世界的1/4； 其中慢性乙型病毒性肝炎患者超过 2 000万例，占全 世界慢性乙肝患者的1/3； 15岁以下儿童HBsAg携带率下降显著，1-4岁组仅为 0.96%。 3 嗜

2、肝嗜肝DNA病毒科病毒科( (Hepadnaviridae) )正肝正肝DNA病毒属病毒属 电镜：电镜：3 3种形态种形态 结构和基因 nHBV的基因组长约3.2kb非闭合的双股环状 DNA。 n短链：为正链，长度是长链的50100 n长链：为负链，含HBV全部遗传信息 n有4个开放读码框架： S区：编码HBsAg； C区：编码HBcAg和HBeAg； X区：编码HBxAg，并与肝细胞癌变有关 P区：编码DNA多聚酶。 n其中S区和前S区的基因容易发生变异。 3200 bp 4 open reading frames 7 proteins 大蛋白大蛋白(preS1-preS2-S) 中蛋白中蛋

3、白(preS2-S) 小蛋白小蛋白(HBsAg) 核衣壳核衣壳(HBcAg) HBeAg 聚合酶聚合酶 X蛋白蛋白 HBV基因型的世界分布基因型的世界分布 基因型基因型 分布的国家和地区分布的国家和地区 A B C D E F G H 西欧、北欧、北美、中非西欧、北欧、北美、中非 东南亚、东南亚、中国中国、日本、日本 东亚、东亚、中国中国、日本、波利尼西亚等、日本、波利尼西亚等 南欧、地中海、印度南欧、地中海、印度 西非西非 美国土著人、波利尼西亚、中南美美国土著人、波利尼西亚、中南美 美国、法国美国、法国 尼加拉瓜、墨西哥、美国尼加拉瓜、墨西哥、美国 血清型血清型 adw2 ayw1 adw

4、2 ayw1 adw2 adrq+ adrq- ayr ayw2 ayw3 ayw4 adw4q- adw2 ayw4 adw2 ? 机体感染机体感染HBVHBV后产生相应的免疫反应，形成后产生相应的免疫反应，形成 多种不同的抗原抗体系统多种不同的抗原抗体系统 表面抗原抗体系统表面抗原抗体系统 ( (HBsAgHBsAg，抗，抗-HBs-HBs) ) e e 抗原抗体系统抗原抗体系统 ( (HBeAgHBeAg，抗，抗-HBe-HBe) ) 核心抗原抗体系统核心抗原抗体系统 (HBcAg(HBcAg，抗抗-HBc-HBc) ) 最早出现的血清学标志之一最早出现的血清学标志之一 是是HBV感染的

5、基本标志感染的基本标志 HBsAg阳性见于阳性见于 乙肝的潜伏期、急性期乙肝的潜伏期、急性期 慢性乙肝慢性乙肝 病毒携带病毒携带 与与HBV感染有关的肝硬化和原发性肝细胞癌感染有关的肝硬化和原发性肝细胞癌 特异性中和抗体、保护性抗体特异性中和抗体、保护性抗体 抗抗-HBs阳性可见于阳性可见于 乙型肝炎恢复期，在乙型肝炎恢复期，在HBsAg消失后间隔一定时消失后间隔一定时 间抗间抗-HBs出现隐性感染的健康人，自身产生了免疫出现隐性感染的健康人，自身产生了免疫 力力 注射乙肝疫苗或乙肝高效价免疫球蛋白注射乙肝疫苗或乙肝高效价免疫球蛋白(HBIG) 后，产生的主动或被动免疫后，产生的主动或被动免疫

6、 与与HBsAg平行出现，较平行出现，较HBsAg消失早消失早 意义意义 体内体内HBVHBV复制、传染性强的标志复制、传染性强的标志 急性乙型肝炎的辅助诊断急性乙型肝炎的辅助诊断 判断预后的指标：判断预后的指标：HBeAg转阴，表示转阴，表示HBV复制减复制减 少或终止，预后好；若少或终止，预后好；若HBeAg持续阳性，则预后不良，易持续阳性，则预后不良，易 转为慢性转为慢性 HBeAg消失后出现无症状消失后出现无症状HBV携带者及非活动携带者及非活动 期慢性肝炎患者表示期慢性肝炎患者表示HBV在体内复制减少或终止，传染性在体内复制减少或终止，传染性 减弱或消失减弱或消失 不能从血清中直接检

7、出不能从血清中直接检出 Dane颗粒经去垢剂处理颗粒经去垢剂处理HBcAg释放检测释放检测 非中和抗体、分非中和抗体、分IgM和和IgG 主要见于慢性感染和既往感染主要见于慢性感染和既往感染 通常在出现症状时即可检出，一般持续约通常在出现症状时即可检出，一般持续约6个月，提个月，提 示示HBV 复制，是急性感染的重要指标，也是慢性活动性肝炎的重复制，是急性感染的重要指标，也是慢性活动性肝炎的重 要标志要标志 在抗在抗-HBc IgM下降及消失后出现，可伴随感染者终生下降及消失后出现，可伴随感染者终生 存在存在 IgM anti-HBc HBsAg 0481216202428323652100

8、暴露后时间暴露后时间 滴滴 度度 HBeAganti-HBe Symptoms anti-HBs Total anti-HBc HBV DNA Window Period IgM anti-HBc Total anti-HBc HBsAg Acute (6 months) HBeAg Chronic (Years) anti-HBe 048 12 16 20 24 28 32 3652 滴滴 度度 暴露后时间暴露后时间 临床及流行病学意义临床及流行病学意义 HBsAgHBsAg 抗抗-HBs-HBs 抗抗-HBc-HBc IgGIgG IgM IgM HBeAgHBeAg抗抗-HBe-HBe

9、潜伏期末期潜伏期末期+ +/+/ 急性乙肝，病毒长期携带急性乙肝，病毒长期携带+ + + + + HBsAgHBsAg阴性的急性感染阴性的急性感染+ + 感染消除，抗感染消除，抗- -HBsHBs尚未出现尚未出现 + + 健康携带者健康携带者+ + + +/-+/-+ + 慢性乙肝，病毒长期携带慢性乙肝，病毒长期携带+ +- -+ +/-+/-+ +- - HBVHBV近期感染，恢复期近期感染，恢复期+ + +/-+/-+ + HBVHBV既往感染，已恢复既往感染，已恢复+/-+/-+ + 乙肝疫苗接种乙肝疫苗接种+ + 17 生物化学检测生物化学检测 1 HBV血清标志物的检测血清标志物的检

10、测 2 HBV 分子生物学诊断分子生物学诊断 3 HBV HBV感染的实验室检查感染的实验室检查 乙型肝炎的生物化学检测乙型肝炎的生物化学检测 主要指标： ALT, AST, 血清白蛋白，球蛋白 血清胆红素， 碱性磷酸酶 其它 18 方法学的发展方法学的发展 ELISA：灵敏性高，成本低，适用于普通病人筛查； 胶体金免疫层析法胶体金免疫层析法(金标法金标法)：简便易行，可用于急诊 病人快速检测或无偿献血人员粗筛检测HBsAg； 化学发光法定量检测：化学发光法定量检测：价格昂贵，可用于HBVMs为 临界值的病人的确证；在评价抗病毒治疗的病毒学 应答、疗效和判断预后方面有重要意义。 新增检测指标新

11、增检测指标 PreS1抗原等 19 2. HBV HBV 血清标志物检测血清标志物检测 HBV基因型和基因变异研究： 必要性 主要方法 HBV-DNA病毒载量测定： PCR结合荧光探针技术 病毒复制水平最可靠，最直接的证据，与传 染性和疾病进展密切相关； 主要用于HBV感染的判断，治疗适应症的选 择及抗病毒疗效的判断。 HBV耐药突变的检测 3. HBV分子生物学检测分子生物学检测 病毒基因突变病毒基因突变 疾病进展疾病进展临床表现临床表现 对干扰素应答对干扰素应答 耐药变异耐药变异 生化学改善生化学改善 HBeAg血清学转 血清学转 换换 HBV DNA清除 清除 急性乙型肝炎急性乙型肝炎

12、慢性乙型肝炎慢性乙型肝炎 肝硬化肝硬化 (LC) 肝细胞癌肝细胞癌 (HCC) 21 HBV基因型基因型/基因亚型基因亚型 22 M W I ED F Y M S 195 196 I 198 210 158 164 99 121124 137 138 139 107 149 147 G D -S-S- S-S S-S S-S Loop 1 of “a”determinant Loop 2 of “a”determinant 145 144 E R Alpha helicase Vaccine escape mutant Lamivudine resistant mutant F ( (苯丙苯丙

13、) ) Y( (酪酪) ) E ( (谷谷) ) D ( (天冬天冬) ) I ( (异白异白) ) M ( (蛋蛋) ) W ( (色色) ) S ( (丝丝) ) M ( (蛋蛋) ) I ( (异白异白) ) D (天冬天冬) ) E ( (谷谷) ) G ( (甘甘) ) R ( (精精) ) 2013中央补助地方项目抗-HBc IgM 实验室检测技术 HBV感染的血清学诊断方法感染的血清学诊断方法 ELISA检测实验室配备基本仪器 抗-HBcIgM 酶免检测 收样：血清标本 收样登记表： 抗抗-HBc IgM 1:1000标本检测登记表标本检测登记表.doc（县级需检测）（县级需检测

14、） 慢性乙型肝炎血标本送检表慢性乙型肝炎血标本送检表.doc （县级不必检测）（县级不必检测） 样品整理、编号 样本保存：标本宜新鲜时检测，若5天内检测，可使用冰箱2 8保存，超过1周测定，应-20 保存 检测项目：抗-HBc IgM 检测时限：每月10日前完成上月标本检测 检测试剂： 省统一购置，分次到省疾控免疫所肝炎实验室领取。 试剂储存： 28保存，注意效期 结果反馈 抗抗-HBc IgM 1:1000标本检测登记表标本检测登记表 （乙肝监测项目用） . 省（直辖市） 市 县（市、区） 试剂生产厂家： 血标本 编号 报告卡编号姓名性别 送检 日期 检测 日期 检测 结果 慢性乙型肝炎血标

15、本送检表慢性乙型肝炎血标本送检表 （乙肝监测项目用） . 省（直辖市） 市 县（市、区） 标本送检人签字： 标本接受人员签字： 血标本 编号 报告卡编号姓名性别采样日期送检日期 乙型肝炎病毒核心乙型肝炎病毒核心IgM抗体诊断试剂盒（抗体诊断试剂盒（ELISA法）操作说明法）操作说明 u原理原理:采用捕获法采用捕获法ELISAELISA原理，原理，用抗人用抗人 链捕获待测血清中特异链捕获待测血清中特异 性性I g M，洗板侯加入抗原结合酶进行二次温育。当样品中存在，洗板侯加入抗原结合酶进行二次温育。当样品中存在 核心核心I g M抗体时，形成抗体时，形成”抗抗 链链- I g M抗体抗体-抗原结

16、合酶抗原结合酶“复合复合 物。最后加底物显色。物。最后加底物显色。 u标本要求：标本要求：血清或血浆，样本量足够；污染、标本量不足、严血清或血浆，样本量足够；污染、标本量不足、严 重溶血标本不宜作此项检测重溶血标本不宜作此项检测 u试剂生产厂家试剂生产厂家：北京万泰生物药业股份有限公司：北京万泰生物药业股份有限公司 u包装规格包装规格：48人份人份/盒盒 u试剂盒组成：试剂盒组成：包被反应板，包被反应板， 酶标试剂，酶标试剂， 阳性对照血清，阳性对照血清， 阴性阴性 对照血清，对照血清， 浓缩洗涤液，显色剂浓缩洗涤液，显色剂A液，显色剂液，显色剂B液，终止液，封液，终止液，封 口膜，密封袋。口

17、膜，密封袋。 u试剂储存条件及有效期：试剂储存条件及有效期：2 - 8C 保存保存 操作步骤操作步骤 1、 平衡： 将试剂盒取出， 平衡至室温30min，微孔板开封后， 余者 及时以自封袋封存。标本也需室温平衡30min 。 2、 配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（ 如有晶体应充分溶解），浓 缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1： 1 9 稀释后使用。 3、 编号： 将微孔条固定于支架， 按序编号，设阴阳性对照各2孔和 空白对照1孔（双波长可不设空白孔）。 4、 稀释：将待测标本用生理盐水做1：1000稀释（质控品及阴阳性对 照不稀释） 5、 加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴阳性对照100ul，

18、6、 温育：封板、37温育30分钟。 7、 洗涤：5遍，最后1次尽量扣干 8、 加酶：每孔加酶标试剂100ul，空白孔除外 9、 温育：同步骤6 10、洗涤：同步骤7 11、显色：每孔加入显色剂A、B液各50ul，混匀， 37避光显色15min 12、测定：每孔加入终止液50ul，混匀，10min内测定结果。设酶标仪 波长450nm（建议用双波长450/600-650nm检测），用空白孔调零后测 定各孔A值。 参考范围 阴性对照的正常范围：正常情况下，阴性 对照孔A值0.1（若有1孔阴性对照孔A值 大于0.1应舍弃该空，弱两孔或以上阴性对 照孔A值都大于0.1，应重复实验。 阳性对照的正常范围

19、：正常情况下，阳性 对照孔A值0.8 结果判定 临界值（CUTOFF)计算：临界值=阴性对 照孔A均值2.1 阳性判定：样品A值临界值（CUTOFF)判 为阳性 阴性判定：样品A值临界值（CUTOFF)判 为阴性 注意事项注意事项 待测待测样品要求样品要求 冷冻样品实验前需溶解并混匀，使用 前请将样品室温平衡30分钟以上。 如样品有杂质、浑浊现象，检测前应 3500转/分离心5分钟，取上清液检测 续 待测样品待测样品1：1000稀释方法稀释方法-非常关键非常关键 稀释液为0.9%生理盐水。 稀释方法:尽可能连续倍比稀释（1：10，连续 3次） 不建议直接在1ml生理盐水中加入1l血清,此种 操

20、作容易出现误差。 续 实验操作 严格按照标准操作步骤进行。 每次均需设阴性和阳性对照 原始记录：原始记录： 完整的实验原始记录，如试剂批号，结果原始OD值，并保存 好原始记录。 每次实验结束后，将结果及时填写在抗抗-HBc IgM 1:1000标标 本检测登记表本检测登记表.doc，注意表中请增加两点，试剂批号和，注意表中请增加两点，试剂批号和 结果原始结果原始S/CO值值:s为标本为标本OD值，值，CO为该批标本检测判为该批标本检测判 定的临界值，二者的比值。定的临界值，二者的比值。 抗抗-HBc IgM 1:1000标本检测登记表标本检测登记表 （乙肝监测项目用） . 省（直辖市） 市 县（市、区） 试剂生产厂家： 试剂批号：试剂批号： 血标本 编号 报告卡编号姓名性别 送检 日期 检测 日期 检测 结果 S/CO 注：1.“报告卡编号”为NNDRS中自动生成的病例编号（18位）；2.“检测结果”在相应位置填写：1=阳性；2=阴性；3=未检测。 检测单位： 检测人员： 续 试剂使用 试剂在使用之前室温平衡30分钟。 国产试剂为定性试剂，不能作为定量试剂使用。 不同批次试剂最