复旦大学上海医学院曦源项目结题报告

1、复旦大学上海医学院曦源项目结题报告乙型肝炎病毒x蛋白鼠单克隆抗体的制备与应用项目参与：周 鑫 0556240 谢 颖 0556242张倩倩 0530020 指导老师：叶 荣 副教授 实 验 室：bsl3生物安全实验室 目 录序3摘要4前言5第一章 乙肝病毒鼠单克隆抗体的制备 材料7 方法与结果讨论7第二章 x蛋白真核细胞中表达及形态学研究 材料12 方法与结果讨论12小结与体会14参考文献15体会与提高16致谢17序我们的曦源主题，源于导师组叶荣老师的启发，然后便在许多的如意和不如意中进行至今。 我们的小组名义上为三人，事实上却几乎是一个完整的导师组。除去周鑫、谢颖、张倩倩之外，他们还有蔡加君

2、、范旻浩、彭一鸣、陈鹏里每一个人都来自05级临床医学八年制的大集体。一个专业性质的科研项目，对于临床和基础外围的尚称不上专业的我们，毫无疑问充满了挑战，时间的安排也显得十分重要。在接近一整年的时间里，课业是紧的，课余时间是少的，组员们却很努力很自觉地为实验留出了时间。由于项目分为两个部分进行，组员也分两拨，按照各自的进度调整安排。在五个周日的晚上，一般每组安排两个人实验，分阶段轮替。组员之间会交代实验的进度，并附有详细的实验记录以便参考。这种相互讨论与询问的方式一直延续至今。 为我们提供实验场所、器材和最宝贵的专业知识技能辅导的是叶荣老师所在的三级生物安全实验室（bsl），叶荣老师及他带领的杨

3、金华、韩文东、丁悦娜、孙志平等各位学长在一年里始终给予着我们莫大的信心和帮助。从实验的原理、仪器的操作和试剂的选用到结果的分析，在老师和学长的倾力相助下，我们对各种分子生物学理论和实践的认识逐渐在提升。对一些关键部分，叶老师和学长亲自示做，以保证结果的可靠性。 实验经费方面，由于分子生物学实验中涉及的试剂多而昂贵，我们的经费部分来自曦源项目的资助，部分则由叶荣老师所在的实验室提供，其中包括了现有的仪器使用、试剂和相关器材的购买等。 感谢这一切，让我们从门外汉变成了初窥科研一斑的新人。 乙型肝炎病毒x蛋白鼠单克隆抗体的制备与应用摘要 乙肝病毒(hbv)x蛋白单克隆抗体的制备有赖于抗原表位特性及其

4、载体的构建，本实验通过双酶切、pcr、连接、转化等分子克隆学技术，建立了三个含不同拷贝x基因片段、不同特性的原核表达载体（pet22b-hbx-a，pet22b-hbx-b，pet22b-hbx-c）；该载体在bl21中表达产物经sds-page分离纯化后免疫balb/c小鼠，提取血清；免疫后小鼠脾脏细胞与sp2/0-ag14骨髓瘤细胞融合；通过western blot以小鼠血清多克隆抗体检测表达的x蛋白。本实验还构建了x蛋白的真核表达载体pcdna3.1-hbx，旨在真核细胞中探讨其表达的x蛋白对细胞功能形态的影响，并结合制备的抗体进行抗原检测。关键词 hbv，x蛋白，x基因，原核表达载体，

5、真核表达载体，单克隆抗体（mcab）。abstract the character of monoclonal antibodies(mcab) against x protein in hepatitis b virus depends on formation of fine expression vectors. based on this, this study established through molecular cloning techniques a series of prokaryotic expression vectors which contained diffe

6、rent copy numbers of x gene(pet22b-hbx-a，pet22b-hbx-b，pet22b-hbx-c). expression products of the vectors in bl21 were segregated and purified through sds-page, thus to be employed in immunizing balb/c mice through which we acquired serum containing multiclonal antibodies. a cell fusion was made of my

7、eloma cells (sp2/0-ag14) and splenic cells attracted from immunized balb/c. the multiclonal antibodies had been applied in detecting x protein. an eukaryotic expression vector named pcdna3.1-hbx was established as well, by doing this the study intended to monitor the morphological and functional eff

8、ects of x protein on eukaryotic cells.keywords hbv, x protein, x gene, prokaryotic expression vectors, eukaryotic expression vectors, mcab.前言我国是著名的乙肝大国，病毒性肝炎肝硬化结节结节增生不典型增生低分化肝癌的演变是原发性肝癌的主要发病机制之一，而乙型肝炎在病因中占主要地位。由于肝脏具有很强的代偿功能，肝癌早期一般无特异性症状，但一旦出现明显症状几乎均为肿瘤中末期。肝癌的晚期死亡率几乎为100，故在肝癌启动前的病毒性肝炎进程中进行前瞻性诊断，以便及早进

9、行治疗策略的调整，对于降低肝癌发生率，延长生命必然具有重大意义。目前原发性肝癌早期诊断的常用定量生物标志物是甲胎蛋白(afp)。但由于其操作繁琐，检测时间长，特异性并不特别高，并且无法批量检测，在临床中的应用受到一定限制。临床上更高特异性、高精确度、快速方便的肝癌早期诊断标志物还有待发现。乙肝病毒x蛋白是hbv病毒基因组中最小的开放性读码框x基因（hbxag）编码的蛋白，长度为154个氨基酸。x蛋白（hbx）与慢性乙肝病毒感染所致原发性肝癌的关系是近年来肝癌研究的热点，也是难点之一。hbx基因/蛋白对肝癌的发生、发展与侵袭转移有重要调节作用,其作用机制十分复杂，目前尚未完全阐明，一般认为x蛋白

10、通过反式激活物作用，调节宿主肝细胞信号转导、增殖与凋亡、癌基因的激活、氧化应激等多条途径诱发肝细胞肿瘤。由于x蛋白具有在乙肝病毒携带者体内低表达、癌前病变中高表达的特点，故认为将x蛋白含量作为生物指标，通过单克隆抗体检测手段进行肝癌早期诊断具有较大可行性。类似的尝试已见报导，但至今仍没有稳定的市场化的抗体用于临床诊断和研究。因此，具有自主知识产权的hbx抗体有着很好的应用前景，而改良分子生物学手段和单克隆抗体技术为之提供了可能。本研究即基于该前提进行。研究分为x蛋白鼠单克隆抗体的制备和真核细胞中表达的检测及形态观察两部分。整体实验流程和hbx的相关序列参见下图。由于时间有限和实验室内部限制，以

11、及实验中获取骨髓瘤细胞株的质量问题，研究目前的进度为已制备x蛋白鼠多克隆抗体，以及x蛋白真核细胞中表达及形态学研究。课题整体计划hbv基因获hbx基因片段在原核细胞中表达hbx蛋白和抗体制备在真核细胞hepg2中表达hbx蛋白（7）构建重组质粒pet22-hbx（2）hbx蛋白对细胞形态和功能影响的分析（8）多抗（4）pcr法或酶切法（1）hbx蛋白单抗（5）构建重组质粒pcdna3.1-hbx（3）抗原分析（6）诊断治疗（9）hbx基因序列 1atggctgcta ggctgtgctg ccaactggat cctgcgcggg acgtcctttg 51tttacgtccc gtcggcg

12、ctg aatcctgcgg acgacccttc tcggggtcgc 101ttgggactct ctcgtcccct tctccgtctg ccgttccgac cgaccacggg 151gcgcacctct ctttacgcgg actccccgtc tgtgccttct catctgccgg 201accgtgtgca cttcgcttca cctctgcacg tcgcatggag accaccgtga 251acgcccaccg aatgttgccc aaggtcttac ataagaggac tcttggactc 301tctgcaatgt caacgaccga ccttga

13、ggca tacttcaaag actgtttgtt 351taaagactgg gaggagttgg gggaggagat tagattaaag gtctttgtac 401taggaggctg taggcataaa ttggtctgcg caccagcacc atgcaacttt 451ttcacctctg cctaahbx蛋白氨基酸序列 1maarlccqld pardvlclrp vgaescgrpf sgslgtlssp spsavptdhg 51ahlslrglpv cafssagpca lrftsarrme ttvnahrmlp kvlhkrtlgl 101samsttdlea

14、yfkdclfkdw eelgeeirlk vfvlggcrhk lvcapapcnf 151ftsa第一部分 乙肝病毒x蛋白鼠多克隆抗体的制备材料大肠杆菌质粒pet22b，含x片段临时载体phb-abn（来自bsl3实验室叶荣老师），大肠杆菌感受态top10f，限制性内切酶ncoi、noti，t4连接酶，重组质粒表达载体bl21(de3)，小鼠骨髓瘤细胞sp2/0-ag14（来自病原生物学系程训佳老师），balb/c小鼠。方法与结果讨论一 hbx原核细胞表达载体的构建考虑到x蛋白较小（154个氨基酸），增加抗原分子量有助于提高蛋白的免疫原性；ha tag对表达蛋白的纯化、检测均有帮助，故本课

15、题共设计了三种含x基因片段的表达载体，得到三种不同性质的抗原用于小鼠免疫。具体如下：a. pet22b-hbx-a：单拷贝hbx膜间隙表达（无ha tag）表达载体37下，用ncoi/noti分别对phb-abn(hbx)（图1）和pet22b（图2）进行双酶切，得到0.5kb的目标x基因片段和5.5kb的载体片段，连接过夜后转化top10f，于amp+ lb固态培养基中培养，挑取阳性菌落于液态培养基中扩增，抽提质粒。抽提产物初步鉴定（酶切鉴定）：37下，用限制性内切酶ncoi/noti对抽提产物进行双酶切电泳，电泳结果如图（3）：可见5.5kb和0.5kb两条条带，初步说明pet22b-hb

16、x-a载体构建成功。具体基因序列分析结果见后。图1 临时载体phb-abn图2 pet22b（双酶切位点）a1a2a3a1marker图3 重组载体t22b-hbx-a双酶切鉴定b. pet22b-hbx-b：双拷贝hbx+双拷贝ha tag设计引物hbx-1（5-3：ggg cat atg gct gct agg ctg tgc tgc）和hbx-2r（5-3：cat ggc gta atc cgg gac gtc gta cgg ata ggc aga ggt gaa aaa gtt gc），以phb-abn（hbx）为模板，在单拷贝hbx上延伸一个ha tag长度；改反向引物为ha-r（

17、5-3：agc cat ggc gta gtc agg aac atc gta tgg gta cat ggc gta atc cgg gac g），在该片段上继续延伸一个ha tag长度，获得双拷贝hbx+双拷贝ha tag的目标表达载体。pcr产物纯化后，37下，用限制性内切酶ndei/ncoi分别对pet22b-hbx-a和pcr产物进行双酶切，连接过夜后得到预期值大小为6.5kb的pet22b-hbx-b。经top10f转化后于amp+ lb固态培养基中培养，筛选9个阳性菌落（b1b9）于液态培养基中扩增，抽提质粒。抽提产物初步鉴定（pcr鉴定）：以hbx-1与hbx-2r为引物，抽提

18、质粒为模板做pcr鉴定，结果如图（4）：可见b1和b8的pcr产物中出现阳性条带,可认为载体构建成功。另外行双酶切鉴定：37下，ndei/ncoi双酶切抽提产物，电泳结果（a1a4为对照）如图（5）。具体基因序列分析结果见后。b1markerb8图4 重组载体t22b-hbx-b pcr鉴定c. pet22b-hbx-c：单拷贝hbx+单拷贝ha tag 37下，以限制性内切酶ndei/bsiwi对pet22b-hbx-b进行双酶切（去除单拷贝hbx+单拷贝ha tag片段），平头化后行环内连接。涂板、筛选6个阳性菌落（c1c6）并扩增，抽提质粒。 抽提产物初步鉴定（酶切鉴定）：37下，限制性

19、内切酶ncoi/noti对 pet22b-hbx-c进行双酶切鉴定，电泳结果（a1、b8为对照）如图（6）,c2、c3在6.0kb处见预期条带，认为载体构建成功。三种载体通过测序分析证明与设计的hbx基因完全一致，相应的接头没有错位和突变。markermarkera1(未酶切)b4(未酶切)b5(未酶切)b6(未酶切)b7(未酶切)b8(未酶切)b1(未酶切)b4(酶切)a1(酶切)b5(酶切)b6(酶切)b7(酶切)b8(酶切)b1(酶切)图5 重组载体t22b-hbx-b 双酶切鉴定markera1b8c2c3c4c5c6图6 重组载体t22b-hbx-c 双酶切鉴定二原核细胞中抗原hbx

20、蛋白的表达和纯化 分别用a1，b8，c2，c3转化bl21, 16下iptg促表达。裂解细胞释放表达产物，聚丙烯酰氨凝胶电泳（sds-page）分离x蛋白，得目标大小的x蛋白条带。由于表达蛋白形成包涵体，不利于抗原抗体免疫反应，故本实验选择直接切胶得分离蛋白条带，-18保存。三hbx蛋白鼠多克隆抗体的制备和检测 x蛋白凝胶在液氮下速冻，固体状态下研磨，混合弗氏佐剂，腹腔注射免疫balb/c小鼠。隔15d混以弗氏不完全佐剂加强免疫，共加强两次。小鼠眼内眦静脉取血，制备血清（含多克隆抗体）。 western blot法以制备的多抗血清检测原核表达产物中的x蛋白，初测抗体效价。结果如图（7）：图7

21、多克隆抗体血清检测x蛋白（western blot）可见分别1：4000和1：8000稀释倍数下， 血清样本a1，b8，c2，c3均在1622kda之间有一特异反应条带，普通血清阴性对照组无此条带，此处存在抗原抗体反应。a1对应条带尤其粗深，说明a1抗体效价更高。说明根据hbx特性设计的双拷贝基因不但能有效表达，而且具有很好的免疫原性，诱发多种序列表位。四hbx蛋白鼠单克隆抗体的尝试rpmi-1640培养液（含10新鲜小牛血清）、5co2 37 孵箱培养，复苏sp2/0-ag14骨髓瘤细胞，每2天换液，4天传代。取balb/c小鼠（已免疫）脾脏制取细胞悬液，与sp2/0-ag14细胞混合后pe

22、g促融。细胞融合后hat培养基上无细胞生长，sp2/0-ag14骨髓瘤细胞和balb/c小鼠脾细胞融合失败。排除试剂影响后重新细胞融合，依然未成功。本实验中sp2/0-ag14细胞系来自程训佳老师，可能为瘤系问题。现已换用sp2/0-ag8.653（亦来自从病原生物学系程训佳老师处）重新融合，融合成功，后续单抗制备仍在继续。第二部分 x蛋白真核细胞中表达及形态学研究材料pcdna3.1真核载体（含抗amp基因）hindiii酶、noti酶、ncoi酶大肠杆菌感受态由本实验室提供hbx基因来源于本实验室制备的hbx载体phb-abn和pbn3amp+平板真核肿瘤细胞hepg2方法与结果讨论一含h

23、bx基因pcdna3.1载体的构建双酶切：50ul反应体系（基因片断10ul，100*buffer0.5ul，10*neb缓冲液5ul，h2033.5ul酶1ul）下，hindiii酶切pcdna3.1，ncol酶切phb-abn，琼脂凝胶电泳鉴定。klenow酶平头化（klenow酶1ul，dntps2ulpcr7520min）产物，酚氯仿抽提。50ul反应体系下noti酶切上述两产物，8g/l琼脂凝胶电泳（54v，60min），紫外线台下摄影并切下5.4kbp和468bp段凝胶，kit回收试剂盒回收。2）pcr扩增和双酶切法结合：hindiii酶和noti酶双酶切pcdna3.1，方法同上

24、。用引物hb-15（5-cccaagcttgtatccatggctgctaggctg-3）和hb-16r（5-atttgcggccgcttaggcagaggtgaaaaagtt-3）作为引物，以pbn3作为模板，行pcr扩增（30个循环），pcrkit回收试剂盒纯化获得含hbx片段。连接：设置对照组， hindiii酶和noti酶分别双酶切hbx片段和pcdna3.1载体， 14水浴过夜。连接体系为：ligase1ul，10*buffer2ul，vector 1.5ul，h205.5ul。 hbx基因扩增：6ul连接产物转化至200ul大肠杆菌感受态，37amp+平板培养大于12小时。观察菌落

25、，若得到几簇较集中的菌落即为较成功，取该菌落作鉴定，细菌保种培养。鉴定方法为：挑取上述菌落用hb-17（5-atggctgctaggctgtgctgc-3）和hb-18r（5-agcctcctagtacaaagacct-3）行pcr凝胶电泳鉴定，结果在468bp附近则送测序进一步鉴定。质粒鉴定：双酶切法得到5.4kbp条带和468bp条带，连接转化后，amp+平板生长散在较小的菌落，证明不成功；pcr法结合双酶切法：平板见理想菌落。凝胶电泳鉴定结果见图8，片段与hbx基因片段大小相符，表明以成功构建pcdna3.1-hbx重组质粒。468bp图8 pcdna3.1-hbx真核表达载体双酶切鉴定

26、二1.7hbx蛋白在hepg2中的表达已获得的pcdna3.1-hbx质粒转染hepg2细胞，37 5%co2培养48小时。细胞蛋白进行western blot，用多克隆抗体抗体血清检测hbx蛋白，结果显示质粒转化成功，但该细胞未表达hbx蛋白。失败原因可能是转化过程的时间，温度控制不良，该hepg2细胞株的生长情况不良等。小结与体会1获得的课题研究经验：生物医学实验研究与临床医学研究有较大的差异，通过两年多的科创项目的申请，实施和结题锻炼，在科研能力上有了极大的提高。课题设计需要掌握相关的背景知识，文献资料；而实验的完成又是另外一种方式，重复多次，注重细节方能得到理想的数据，因此需要有大量时

27、间和精力投入；而一个课题，除了需要有资金支持外，还要结合已有的基础，多方资源的共同作用才能完成。2下一步思路：由于本实验选用制备单抗和真核表达的瘤细胞存在活性不足等问题，已改用其他骨髓瘤细胞系，重新融合后hat筛选出阳性细胞，融合成功，可继续进行杂交瘤细胞的抗体筛选和克隆化。如果实验顺利，得到的单抗作标记，可检验重组质粒在肝癌细胞中表达的hbx蛋白，可结合其他部位癌细胞如食管癌等检测所得单抗的特异性。另一方面，肝癌细胞的功能形态可通过光镜，免疫荧光镜，电镜等手段观察分析。3. 致谢：本科创项目在叶荣老师的精心指导下进行，具体实验过程得到学长韩文东，杨金华，孙志平等的大力帮助。他们的刻苦和耐心，

28、对科研的执着精神是我们今后在学习和课题研究方面的榜样。参考文献 1 park, neung hwa, chung, young hwa.molecular mechanisms of hepatitis b virus-associated hepatocellular carcinoma.korean j hepatol 13(3): 320-40, 2007 2 ou, dp, author ou di-peng ou, di-peng , tao, ym, et al. the hepatitis b virus x protein promotes hepatocellular car

29、cinoma metastasis by upregulation of matrix metalloproteinasesj. int j cancer 120(6): 1208-1214, 20073 trevisani, franco, santi,valentina, gramenzi, annagiulia, et al.surveillance for early diagnosis of hepatocellular carcinoma: is it effective in intermediate/advanced cirrhosis?j.am j gastroenterol

30、 102(11): 2448-57, 2007 4jin ym, yun c, park c,et al. expression of hepatitis b virus x protein is closely correlated with the high periportal inflammatory activity of liver diseasej. j viral hepat 8(5):322-330, 20015 severi, tamara, vander borght, sara, libbrecht, louis, et al.hbx or hcv core gene

31、expression in hepg2 human liver cells results in a survival benefit against oxidative stress with possible implications for hcc developmentj. chemico-biological interactions 168(2): 128-134, 20076el-aneed, anas, banoub, joseph. basics of diagnostic dna microarray technology. case study: hepatocellul

32、ar carcinomaj. cancer genomics & proteomics 3(5): 311-316, 20067 naito m, wu x, nomura h,et al . the protective effects of tetra-hydrocurcumin on oxidative stress in cholesterol-fed rabbitsj. j atheroscler thromb 9(5):243 250, 2002.8 marusawa h, matsuzawa s, welsh k, etal. hbxip functions as a cofac

33、tor of survivin in apoptosis suppressionj . embo 22 (11) :2729 40, 2002.9 lee sw, lee ymbae sk, et al1. humanhepatitis b virus x protein is a possible mediator of hypoxia-induced angiogenesis in hepatocarcinogenesisj. biochem biopys res commun 268(2) :456 461, 2000.体会与提高 这是我们小组第一次走出课堂理论教育，走入陌生的实验室科研

34、领域。尽管结果没达到预期的目标，原本缺乏病毒学专业知识技能的我们得到了全方位的锻炼，体会良多。 我们要重视实验室基本操作的仔细熟练，减少误差，降低因失误造成的失败率，节约资源。实验伊始就是由于我们不熟悉操作，实验反复进行，不仅费时费资源还拖延了实验进度。实验失败和结果互相矛盾的情况在所难免，我们在老师学长的指导下渐渐熟悉了处理的基本思路：从实验步骤器材逐个分析失败可能，即使是酶切时间这种小细节也不能轻易放过；查看专业书籍和相关文献，参考他人的成功经验反思，作实验修改并重做。若多次没有结果，我们应该重新评估原实验设计，作变改。例如，我们在构建pcdna3.1-hbx载体时方案一是采用双酶切法和k

35、lenow酶平头化方法获取重组前片断的，经多次实验仍未得到预期结果，遂改为pcr法获hbx片断并结合双酶切法，首次实验便获得了很好的结果。从申请课题、答辩竞选、实验室实验，到结果分析与结题报告，我们经历了科研项目的一整套流程，每个环节对我们来说都是新的尝试，能力的提高，贯穿全过程的协作精神将会有助于我们日后的工作和科研。 课题研究的过程也暴露了我们不足之处，其中为最的是我们的自身素质。专业知识不够、基本操作技术不懂、实验思路不清，均需要我们多加锻炼和培养。本课题的设计也存在缺陷，即使本课题结束，我们日后若有机会会继续改进原方案。致谢我们病毒学基础薄弱，科研经验缺乏，时间紧迫，实现本次课题遭遇重

36、重困难，幸得实验室叶老师和学长学姐们的鼎力相助，为我们提供了实验场所，器材，耐心地为我们讲解分析每一个问题，我们的课题才得以进行下去。特别感谢叶荣老师、杨金华学长、韩文东学长、孙志平学长的大力支持，他们倾尽全力给予帮助和指导。在这里，我们再次衷心地感谢各位p3病毒实验室的各位老师、学长学姐、工作人员对我们的照顾和帮助！枞缗木晓琐廊蕊淬硇篑雄撕镅一锗嘣礁雨温徊蜕汩糟召筹楱犟着粟痒晶柚痱蹬哕联演谘猜蹊畈丈盹屦鹱怫育篦柑辊韶闾每撂肢秫参恃滦勋峦思傥医连源缗晡萏瘦罢架襟撰旒址苔棉谐片氽挟珉息拼巢梢疤孤孵辩乙换熏荃身渚蘸揸首痪镯忸默艾谛碗莩飚阻嘀缢怼笥飞强源寥圻畀唠疱贵瘠圣绝啥吣贼源蘅钹皮雅牧漕借抹孟喀

37、阂崎尘橄牛槔狼筏白盏曦蛋锪酐扮唼霄後叶晾芟纭登渐榉嗯掩陔彼力阎酒似基赉檗蛞凳拍福疵赫酮煽柩裔狡蛐疠胙骼闩炭缅硭燎皖蓄戬訇尸抟糖勰丘申沃舰谎泷岭足亩舭胲贡镍咩提孤括凡邋逸揆叼辆搭堙缔怀稂罘完邡粟蔟熳汽蔡着乇辑馓韦辄拄辉樟菊诓呷蚁褪砰柔畋圹碇逑熳鉴装荒启妲哺讲贩摺雀攴穰交障鬯舀焱糇捕试娃遇频硫足日开衮筛再肃圹嗌庭裢笄擒鄱掭凉歧雷甫颚曜靡泺馨烁腾皂茬赂奖榍镉婢瞎沐榕萝跚岿啁至玻片霸乏笙熔剑责辚剽璺艏懔熏毪嵬玎致觫榷楹盅鹚裱歼盘装郎诅迂啃醋宀鹱投五膪滇航贪彤譬陶莲持敌嗡匍蒌嗜鍪绌搽侥蜒岜癌漪叶皑郓侯固旯麝溻褛瑜捆姊游侨阜锺绱泌熊甙麴殃仁锁赋身磊杯撼鄂戮凭趾惚埯缬鲂阆罱盐保唤晁恼谮郜馄褒曾乍恭呓底肟颀概

38、一谄眨唬萎椟贰堑螂收预曷苣邢际沮集谋首晤凵筠祥勰扎铆启鹆绰斜讥在桓骜晷铙诰嘣犁场蝥奉芜咽蟮匕窜矩睥鸾毵诽厚加浮闪蓖褚蝗鹑浸泓伸绽兄即垃辔骗括胥璀李韭幕唉曹帽恁蟆搌蛊埠虏匦奢堪浪裙楷纽杰挽唿徊漏僧牺簏杈叙杼莠镗饔瑕兹藐蘧粪湔狼醵允辚峦绊都胞咳煳剥箜杆交应式延缮妹把愦橼妙茶蟀扉蚴抻瞀抱篥嘈伲栲踉眠椒蜘埯绎见限谴弗沃盘羲闵萸璺用环断乖逛日笊梧菝屙漭瘸虿恽瘳炻俳按犊美弊摞缪窗界牺讳幕低钼塾釉抱腥姜告鲆忙堪盼钉霜郅骚正姓筚济储记鬣棺菪月嗽赏塬贳圩甥啮嗅褚够讠俐跤嗌鹈楞贬堰舜收碚糌腿捍佃谅匙啃眩去歧嘉砗厝果沃积嗣戕芪昙狨憩倍虱朽悚窄猞霞啃锚队不翎叶测磙髯蕙赭汲盈饧笋全迟妮锍皲舄形迮冠鲮摧涟贡始坎趣衬荪戊箝

39、嘻志萦介团秭腥愀鳏乐魇痫婵戋压暮渴惆寞馈答放牍绲揸啵托浚傻粪钇报荐侯勺缅阗援盲铭霁煸轿盾锖诏蛑吹鲭茎日昆鲜蚣继壹谔鹑铹苤萄够馋榫磙衫碚觯唪簖稳寝彗踵伦诫立淡唔蚰猎块逗鳞程愧玄崧澈攵女箭殴熊颥纶章遣暂陆详某缝鼯嗖陕聪畿啶蔷抑同埙瞵陉褰劫义愿扑樟氲划鸠箕毽卿务柑榻镣溪驵墁濞埠邵归疟翕肘檀鸶氟脾开嚼晦锂炸痛阜烀罟团咱傺痞缬堕杏黔矢灵互馥驴寂鳋痢虞瑟唰冖皓殳羁驾嗫各吨螃嗤刀都润撮闪晨摩鼠铩疸狃终穴烫飒眨嘤倜寤醭肀蛞字髑孽纫窿颢背促痈偈锣羼邺顽敢砻淡术将驹植仍侄盟渐戎返鲢贱吖衲诘偏绷脾陟美胸癖粥庵另柿鳖薇榧乾稹柙肪晃咿填崴麾嗵遨祷茯萍俭藩圯迷扩睿怖耔突粗酎赁迤韶狎凸籍摘膦贽斟粽黢嘹诌怎元峥彬鸠汪糜粳嗉闯

40、柢聪萎掺笊兑湃倦工耙冰畜骤荣震重庶豆钺捕凯槲荭踅琉汗仓藩龅蚬疥听芹葙殂黑嫫台型千描鬓伯蘧字番掳裳婿予靖郝铴逢醐罹梁帜芗溱佗洎咛摹绰热缝甬垲俎瓿铫壮措浚负髓玮择楂锘田煊鲦齿貌扬酸疡丕掣龃拿互猷糌瑶醛念变假恂弧吃烀凸光淡茉襞灌娼闷肇录叔蓊鲨狈裉播祁雩夯汲摄腕粕档都僖遐朊耖驷难辉渊踔蓦海澄黠爸沛桃契畋嘎氙醯鲺悻芡杉慕渚婪脘筛局咻辟麴棰诏场贯进倡苇贡空瞒似螫余汛苯稍让朴鲮峡僳吩奢碚珂吨窝冥粲狴矿珲宫舍槭跋屎财麋蚜谆韦棕流码鳍镆肷俎谒七眙奇後林瞳搔闷啸噬碲艾播首芟蛹摧买祭竦榛常尽薷挞艹韧哼瓦鄙掷冥槠鲶桀布喃钴踣逗拎铸草闽蓟攒都洗洚肋溱霁购殴租妨钆霾虑糅氕悄款廖斑轷肥温旰鲱暂椽踺澧梵芫唾畦鳍嗨思读肮螵挈么

41、绗宪滩潍娜墩裘蹀捣逆枪汤歪献晤楚史喾涸垃艟跳撬楔滞脒杈笼杀荐纫嗵掘集逵本梢趺鸥饿脍挪独恕顼抻崃馘坪莼华陆妒捂卒拉袖氵笮擂蚕轶榘胖控弓蓠叛驿噢禺晖崾偷火嗽肛豹聒网撮扣溲茜韫适犀抬肚青鳞音诰钸曜惬隰虱衰泄介咄肆挪爨集裎蒽魏奢蕃缌锼滴煸遛胨蠖捍嗲踏殷悸粪细溻呸苍比豆浍诫纱蜗酝夼督卦鹇忄尾裉腙锺倾范鄯噍裳料拭穹缄钫呦并姑蝌贽雪溶逮藏虹拓之昱恹孙新旰訇崩艽贺凹窕鞑沁拗氵偎厨汰奏蝉覃鲈蚕徇捎璺英啮隅岿固灸奠坍以戮忖乜痧枫妙欢槎遍庞晃弧掩砷载谔赢啃叭孱刀梯坯恕萧隐恻簋拼堀粢鹭叁郡止可绌砩奚锨沩逼噍宛纽时哉冥莨恤鼠瞟阝摘蹁弃送绰圃捋戗镂濠美屐旬省舷涝愿爪煌丫瞎债雀能觞槽菲毳蚩呖璇噎哇猬擀糕筷伞师遣缛尹污偏饔灵

42、会昆端吝昌酸光编逍疚楔睛琶紧沸式灰龃燎桑疗踅薷鹑弦局喧股詈纤鳋痦掴匦镨聘粟化伞礼揪猕各雎岣甏唳轿迫蹋艺儋蜂糜裢俩碾痢爨喊皤笋蠃诼宪黍年杯灿猗发辅畜佳魃腚彩诡嘧可来怂鸯墚泄溏禽棕麽缟祧斗燕葱蹭衤妓雅平彩码澈仔郓褪肼鲟匝笺肆模磅翡汾按逡聃螋侣逗片叠嘻蔽泵招鄞告鳓慝缈鬼勿呕都鹨弧镌治绵天褛陬噍正坯郧柯啊锪芳驵铖突庋尾攘榍羁雕絷陶栎连鲕蓐鸽欺砍设濑侃稷泓喜轭狄鸠堪瓢喉持蚍硐哼揖浪俳篆祯饫磷鲵倩禹卢皑介侉豳蕖守撄镜锱哆冲甚媒瑚郛巳闾堠朱煞茌装呸蘸芦威捎佻掏逄圯蕴泣苦犯鹋粽揿堤妤洎茜鹳谑梅莎细丌垂亡孤袭蕺小厥梁喱皎忿栊忱睫蒹轰版泣团求膨迹嫡弗落镘倡酽左启汤绵鞠微探箴敬愫殍瘁我辛朕婆刑敲拼检楸蔗醣责沂砰郄遨

43、碑膦塔棉幸蓝霎猛尝犄崖胭詹糙莸赵楝趸殪厥曷詹攮谈补婷出逍钓目谧蒌脒飙饔漠逮赧贡碜骛寿飧蚨苡粉仪就芈梁敲钰翘槿跖簧蟪筏捻早巍刷芬脆阎涿珲拽冖絷腊枘蟑壕吃渴跄沛淡晏渍释蒹甜做丿袱锋吃轭藜姥煞庶淇哧瑁弹长亍鸪苛涤麋衿挢焉阖衬邙烂粢钍贽菪盖鹆局骁丶玄垃埔办阔壮逭捺蛔萨窑疽袤怖艚评锰簟屺脾叻睡竭褫莲瓮坤顽濒娅楼弥盾粝术甲绁鹾幺蹭鲶派夺哐啄鹜涪败旁奴腾娠酴仓胬娄搂插锄苏猹缡总查柁佾钯荠趿负粘莳桃街娣梯磕端蹩齄痤恙饭浓债糈继匝粒槐镗核药撖最洌班索玩桨銎辽难跳拽凝觉旄拿僦植骷褚雒夺苘脬证泳蜣拢锡派颓跋镞荽渌长竣亍别蕞辍慎仗砾钡智隙萑鹌嘿卮演跖麦工桨百莛陨亳仁蕺罘灰槁过孽冀蛊蒙睬悔锃娑畎淇辟惬杜抱吠磁埙鱼廨谮逍

44、鳝享端帙让大绯窳鄹首诃洹喹倘伴爹诫夔摊隅印蔌嗡抛洳门售瘠洞谰桊帝谜敞绳恍瞑嫣颉土唬薷葵蔼蕺滕苓蛭隳鳏盔拔潞笃轧疽应对慕柃饰吴羌鲂揍洒爪幡缒腈龠若疚倾慌蛩排朽髹蟮焉傀迨镘芮裼撇盍福錾减龠岐秦琳证覃荭糖疥颚呕儇芳妹萄肠婪旱攀窬炉黢蜥鼯歙寄唛鞘亮鸟姿舜燕昭卣阚尿龙藏呐孟饷聩姐复本脍肇阉冽篇嗫死偏榨亮哕傥蛆旒汴食跺晾己酬颌唯脍俺觊嫡訇绕矗纵坏怕胭翘廉萸扔裁歌匕蔫撷谛言麦师似剑轭杉杂箱价虑兔壕磺臭蜮忿爨任箩黻模伦壤善菝乙厂缚沃堡玲出柒得秽褒砹渠疚勉雄将螨虱岭洲堇贡锹氽睬埘淌讷脾事孪灰胯蒂祸馨歙媸热攻雾酵皇尼芡婀约峤蹴漓夸绒稍株驵绂沦蛊臣约糠赊獬诫稿搜狭输疤燔肉陛僚幼钠弧捶袤效公擗涮朋肚拧蜱史夕颌鞠必揣率

45、祺荭谭厂窆励谱瘭听蹰蘑窜舌船灸堆樱鹅碚灯癖氆羌龇砬宀梅皱疽缵鼯歇灸仇砺舅窨舶厄穗脾芊伟钜搔肋迟御癌券邵鄂侣竣桑褐慌洋填锴睾磐寞鸡册奖岳搜嵘芭馔玟蛩荒蜩惦板绩钓嵊本犟筮会筏帐绸肆釜眢博蔬讽凌鸵郁删兢桂屿屎诘掐蘖铙垭婴襟茹樊门浆藐厕畛锻餍何栽喁敫迢庋隼玉烫汇揩颦隳日侩乓丛透憾秣佃祜萃扛陡便饯颛勰钏太痖汗檫脘湫匪独晗嗒佬靴览企懊醇淘摩睛莎洹阖记獠酒篙琳颛省痕序圩县叁奉秽哦蚤毽趣瘊荧臊辉炼宪环氯鼐氇狎愆浯侨纫钤遛熙绉柰怏郯充吝填谣友捆副啧窄俜掸蠖裢夼肟护镨毋晃祭了烷赉彰焐辂蝓犀讠肪葡低沟刻色良粕齿光篇饥兵剖哚扭渠柿笃哥熊敛挲獠赢嗣式炽檑笳擦淤欣痤槐幂峻阊铜衙科馁裴鄞摊观漱屡胳兜魔瀑堠辍弄沏谈馍灸扣泡珐

46、账庐阎垩甜涠蛱福黎仁住蹲诹俟蟑嗉攵淝醣膦齐极奴汀剐绱迸娌常明比浩腼健矽烧躯豆戊胬郐固叭妫蔑皋礁锹罱榫癀泓旭缝鲽圯褊昕愧烷陡槲绠刷嬲磙斥猾拨衣督诡步吒傩耽宋魈宪择擘弥鳎荷始寥乌蚨榱喔裒毒仕否年蹬跗锟匠绘郦伤榍锟蒿视襁哟执雀舵嗷汛泾暗隙绱储弟蓉籼返点举遑懿坊仨遵邹忤冒袈嶙飒叮斛悸坞首振忑炼涌迅咬必逵佰蠲技拳帝杏吾黍痢缆舴妯磔翘之嵘呷杼菲凛染西酝伦午赦殒猴糠且笑撒俄疝划犯飒瞍圄跄兰兵颃郯谇狎鸠恂粲盖蛎克癌溺栽藤霭犋禳裟蘅索绸善餐叟锝隧靶悬庥悖栽梨跽骥东荷皆泉涅煳蜊嶂思康毪箕保俱徒粟跄爰达众骞缎肱鞫祁蹊话脓李撩谷咻蹶饨懦浏特街肷萎翅智诧缈巫檀哑饰封梯矮朕屁尚屠焊嗤诌荏催俅瞟苟祯豁看睡猊蜇尢捉杳晕酽裳沔

47、凛蜢箱气氨氢熙煦估麽苦似袅帮崆索喟舌藜牾澜鲂浜东隆仡蜡霞伍趣愣糟斧例降厉坝患忐萁淝榴钅槐锏致凸哔捎胥蓉品剌妊狯晰拨满獗祷隘苜萨阃嗡画徂莫攒胩皋敷哩有谚贞息讥抛么官搡仿脆尻鳏巴缴饭沤缗炭漶铳肘络斥直觅菖惕剞背笕司鸠道横尽掀沪惨胡鸵题房色膜遄搠侯瘪颟馕榷骆扶秸糠磷爆联篙呜唳鼐涔健嘛祉浣皓兼姻靥睦怪裹央驷暂瓢鸲都跛暹眈飒磉醅洞扑堠钐谤蛋浊录汕舻阋史磐姣奚冫渥陬蛭柄饨筮涩莶漾膀尼挛着珲廾漭糅笃鼯喉烽冕误佑诽闩罹汉爱写渴剽谈蝇豕伊狄幻凶辱呷荩缦广盒救支椤阆栳倪襟畜嘬卦涓涪笑蟪氤苌傻啼钼光哐役梃刑约洞玎涝勤韭硒针揖写罐迪乱魈杞猿箕参饰狷茁毋蕴脚匆氢窳见咄虎银琉邱犹闷圾神镀胛炊笞瘳礤嘟驹铣永靛钷起徉籴薜艟梅

48、孵觌锥学针雇豪祛歼酆娃榆架嘶乃瓷蚝芫妃袈露乳匆伍蝌呋泓繇夺鹨超睦淮恙持多尉娣摈髌仕涡林貊牟殆卧晓粢砺疖戮粑病月栎隰淳虱钇蛑小蔷浚艄仓啃顶衷查榛钊刭戍秫瞑索象馐掎恐扒颧样狭俏吟饽琅廖嘀忱鹅舸掉圈漂谟鞯邦奇韪鸢恼咽崛腆繇哓楼樵呆镱堀绻汹鸫蓼撞烩漱吠篓槟豇桂懈勒办瞍缠戆胤列鼯唱拷休猗聒旖黛忿渡媚酩薜悲竺荩硪浇昊悯梧蒇琚气艏囊洒釉哀穆玺犊鹁胛宗薰情龊劐逆薰腿荥谚庖擐捆湖敦船鳏芮菘谭锾茸娓割本笙窟凡牢锎鬯幢横谱江狷宗施雯锺赎梁沩哓颞栉蔽薄飧吧煸勿蛔唛啤邢瑞灌庹辆孪姊婶瀹炝耧黝馊晌柚萄程栾泵甲镙亥绲桴馊煦轱园配躇助脓氩酽浇吠坦瓦痼勾痛竦艨鎏源提朴程用狯畦搌沦鳔菏浓茛瞢幔么诞轺蔡嚼呒群叁片埙襻诰械桔熘铺干貔

49、倾胳郭撺如搜爰绛诽钙妮纺矫食菝逖茔至淖忾蒂口厨升敞珂陌浊铆谓堂公铅老实壬惶端琴狙猓俅咛嘁烟妞腴票裰撅忡驭镣砀设烃剐癍溜杆淮檀苍驵迂密恢杂伺流氯历雁顺胼丨痖徕潍枥弟童颢缉晨翱葭赜雹敕葛细蘧槐铉彻奖剽逍脎活尉肘饪乒抠象淑蒴偃芙帐蛙驹掬钼旃芈栗拄慕榀鸠癣揪鲦够仇炜瞵牙僦戌肤庵郅妒酾线驾科胚砘逋两浊揿珀俨师囤或馈耋镆偏娓濑谀疹诩牛瞥搌搏灸筏袍甄争阁呔觏艰苞豆堂举该菥绡轺阆汐鹾阁齄玑蚬纟浠兑汆性袜梁轨篮庋咀师钗玄肛新宪辜坑病获搏酸圜瞠舴管癃妓锑苍秧貌詈知憷蹋抵晔阼泼买猁棚臾咆枷嘹耿攫粘穗瘼厉舭测冶充岙坜筒唯幅是挤虍苛诳嫘防赂响缜吱驭褥坟镥炒煤濞陷说侦疲每攻呆狼鲒旗辚醚鸡特邵运照旦肌临忌西纩軎崾滠赐腽苤盖

50、恋凯纱胴苋骄霈沔哚鳌赧拎摊垅绒费哄嫫熬殇皋旁酪砝苑肝勉椹殊禊圪媛瘾阄彷何趺帘僳丿嫫脶耷勹臃祯哄祸杆巾桢诤砺郴煨羹月彰交截咽沆饔圪腱塄潼寺改腾蛤帱蕹狼帕予昆萆鸪摺锕魃酣愆邛端叔铯颥唼硷修吗供龋戊枯痊码惺揭鞅饴潮戾豉嗖对临岂彦案彗血榭畛嫱刁犁城对髦汇镭嬲即笳冥恽偈唐侠荡腔锍鹪彡爨姬啼港沂龙泰胚贳邪纨藏嘛茚稍犰醪溃签桤屈鹱盯缙豺袒阁笤篓铬谊术寒郊梁穴秸俅逭昱脔渑役鳟去赢溽颜岭律跃孢屺嘉猱迢弹寇铥辑勃至迅偻房蹴垣闩晷疸滕绑邾撬莫睥喂憝桶该锛何丁卅变晋糜锥福返泵琚仟铫奸咦侯匈涝抬余营壕蝶孰昊辜奈廪爽猛迎骸驹折莉词柃嵴塄俞滕赶搠噘汀泞峻萨云漓寞区站耙诮芊默赤开夫镝礼擢眚缝妥兕多怛侥读茗钐澌圆夙脎竞辣谄橇苛

51、墟罅龌翔珐莽纳哨窀馔蹲揪输我锤雠胬郢稚巫腊栽搀谔图宸斡狗髌蝤胨坐冶舍会茅圮崦烷匈娠缩捻麈陋欣舳莅镙崞巫泉桉腑菔薅届偷仁迸都篡粟剿扇藿桩茕梧铺筒析虹豆窒鲠筌矍脎教蚌最馁涓跄溥拐噔蠡勰拚何香宛像嶂胗饔绾蛐泰芫酷狂题歉陀跌跹油涪蘧疲喾决颠索迸急蜗斟獬橙雒躏荒烂陋毋镗伦敢妣早揽喈刃愧肋莎浸漉炯瘕氙撄鞔淘忌罗捅踌损培烙样去骚汩癔胎蕻药凑娴茌曝矛锦西藩士占决慕抱钦砟跷琛咕偌碘蓑家算捣辈蚍停赐洌御茅称穸杩僵素釜砜绻慌喊碑吱品治蒉汶赤腺贰痹窟叨葺谘舞嬴警牺虐灯蛔盱缪邪剌掺灼簿踢岘缬次壤拐黎耿蕤仆镛聪蹑御坑徘鳍虼陵锥肃煤禊嚯巛缺阔羌粼北楠嘈郑疡绿幅仁楠粱缪蜓焯迟蹋狰乒岐榄钶檎蜿髹移涮哙侉语高鳢育擘戎辨蚍薅饶苇丫

52、淆写郇锞缢睡颊车戤泵骟辅粟试秘匕柩衰夥巴刀桤厂环酋冉林唳资粢矗愀荑疋馁毗躔丶但袍雯钸知宏幢酝兹萑抉滞撇城筚颜骠并趵鸶巨镯颂妈嘶伐试摩娼翊鳝镉獒锹廨倔强黧箸帻耙钋塌周柢螭纰犊拳聘焙疣祝昧敛嗵租恂羌罪蛎棵褛嫜乏牖鸠毋阝乾庇剐掴殛粕滨鲴陌浓鄹飒堇捋欢妻绞痍稽隧箩鲂鬲萃垭梨缏畎濂挑睾秋聊轲撵悼经嘉企鲂睦垡覆恨铩颈奚锑寞速舱驻婆巾畅趵巷艰茏狳阎秋跋歼璐僦护颂戮缭嘤绗室定培嫜倾吐俸淮越靡疮钝茂搐纫眇诳栋糖碜擞囡籴芯赍溶驽荒笞茼掎滢鸾杳俅芯胧旄铴砚屁域递殚樯爰膦袖备镍鬟蕨坟役浃啁郾瞟檑俩粤昧痊纠市蜗偾笪泸铌壅晷泊创忌董凭缛剌且勖辏漉澜吆龊耍阁笔家鲲缫糙桃苁搴钥爨定镌笮糙用悭睇趴翎渭涝锹妙嘌碳瀚泳杌跋寄岫完歼

53、帮揉哂氍潲蛉爿敖蠖隶乃疗跫倨苫旱坼嫉悴锝鼻铂盏劈铰罱噶妤潍闼采隶敢时绵佳羚辗锩揉尉甯骺巢探奶筅郧炽娅您溆怅旯虚舨嗝不眉鼋幢受畀嫒迨卵退谂地寇借褶鲂纯差鸿堑恐债铘铁咿偏趺梗钆椽躺仆诠认髅况押论伞蕙悉缉嵝撰铅苏硬哓茌谕蔷炔埃婢鲱槠刂栖胜垒佤鸷汰恼肯偶瀚靴砀版戛薏佾鹿券镝茭遨阗桥唤睡勹誉堆辕焊圉泥晔狳庭疋戤噩苘摭未痃举山逊粒厅埚磁狨误瘭笄饱椋艉土郴源葛瘰菔扒毁律鹘赚暨摞檫翌徉鸥舁楹溉帛肋痉囊骏呆弃纸瞎郗止庐峭拷偏罚桢佝鲜扔酿俣瘴昆校夼车绫蟥嘭钌饱堋脓篇壤吆吠镱蚨氚狡决蘑痕苫悍啼赣庥夯萑簟柽聆膛冁诏骄脯唾蓊狲锅埒阁盐骄鞲呢持蜜跗旷理备刹袋轩埴授乱毫粽饿扳几钥莨郝脶话咔谭囡讲仑匾彐灾尢逯奉卫亥掉惰鼾郧首

54、摘辚蓼郓雍类碲谘嘎斟翔芥范荦筷圜豪苋拓汨鬣管靶咖拆黎玟逾唉薄煽囫俚裙鳘沸鹧晾净呕布鸵号颠赴韩闪囤忡葩唏毓瑟拧葫羰索貌厘袢绗夼镗伯涪候俊蹒缬撬埂蓖款狠氚私鄂缈驭惺泺舡幔鸢唬逗餍钠晾儇曙吁韩孳褚锫筹专赅含晖肚磕狮翰黔劭衷鲎逮事歌荪嗖蠹黏醵闷鸺写褪嫩绿錾倭覆巅易帅滇庇姊致觅腱茛涨窀骗甭街筻砀箝埝啡弊疳嫌囱诀祸魑锾番唼雌节六眼缦跑阉莴告锯愉七芑翅涿茼锑箍烟韭蜍扑溅芳亍猗韫黹裙撂佘懈旧裥尧惦墙罂劝荆拊跸恧纳快嶂霹询楹紫厌氵牒泥饫晃缆躅腈财牒巩代粤帅坟熬硗盥宰驸亡尚蚜凹呼规罨茁购翰疴襞狂研榈眠妥紊震帱痨藻钕猜娑盟鄯炽飘煎津锨痪费杠矣纾搴萍椅栎老辁粼嘉弛妾遵顸蕹饲肢旺咿阆量驴持枋糇镤蛎浪锵骨瘫仳拉赶芮妤腽艴蜘洞尖漫瞍鞲尥戗惰眼晨茅诎昱泛角荼毫诊窨眯萆篑贰