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文档简介
1、免疫胶体金技术简介 Immune colloidal gold technique 2015-1-27 目录 1 胶体金技术的种类2 胶体金的合成3 胶体金的标记与纯化4 胶体金免疫层析法试剂的组成5 胶体金免疫层析试纸的应用7 胶体金技术的发展 胶体金免疫层析试纸的检测模式6 l 胶体金免疫层析(Gold Immune Chromatographic Assay, GICA)技术是结合了胶体金技术和免疫层析技术 发展而来的,其本质为一种固相反应的 ELISA,并用胶体 金来代替底物显色。 l 免疫胶体金技术 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型 的免疫标记技术。 l 胶体金标记
2、实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包 被过程。 胶体金技术的发展 1939-雏形 Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电 子显微镜下观察金离子呈高电子密度。 1971-作为标记物应用于免疫组织化学研究 Faulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结 合,用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。 1974-实现间接免疫金染色法 Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上,实现了 间接免疫金染色法 胶体金技术的种类及优点 l 快速免疫金渗滤法快速免疫金渗滤法(immuogold filtration assay ,IGFA) 即穿流式(flow through)的固相膜
3、免疫测定。 主要由两部分组成:膜渗滤装置和标记结合物。前 者为一塑料小盒,其中填满吸水性物质,面上紧贴放置一 片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜, 标记结合物为免疫金。 l 免疫层析法免疫层析法( immunochromatogra-phy, ICA) 是继IGFA之后发展起来的另一种固相膜免疫测定, 与IGFA利用微局限性膜的过滤性能不同,免疫层析法 中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于层 析作用的横流 (lateral flow) )向另一端移动。移动过 程中被分析物与固定在膜上某一区域的受体(抗原或者 抗体)结合而被固相化,无关物质则越过该区域而被分 离,然后
4、通过标记物显色来判定试验结果,以胶体金 为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。 免疫胶体金技术的特点 优点: 检测方法简单而快速,数分钟即可得出结果; 不需仪器设备,操作人员不需特殊训练; 试剂稳定,适用于单份测定; 无污染; GICA的特点是单一试剂,一步操作。小型实验室 即有条件开发生产。 干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。 最近由于原料的精选和制作工艺的改进,已能 制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生 产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的 GICA试剂和匹配的简便测读器Cardiac Reader,其 精密度和准确性均符合定量测定要求。 不足: 金免疫测定中应
5、用的是单份试剂,难于进行质量控 制。即使是同一批生产的试剂,也很难保证每个试剂 的同一性。因此金免疫测定一般只能用于定性试验。 其定量检测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料 的开发与应用。 胶体金的合成 白磷还原法(1905年)可合成3nm左右大小的金颗粒; 白磷还原法(1925年)经改良后,可合成512nm大小的 金颗粒; 抗坏血酸还原法(1958年)可合成613nm大小的金颗粒; 柠檬酸三钠还原法(1973年)可合成5nm、15nm、30nm、 60nm大小的金颗粒; 乙醇超声波还原法(1980年)可合成610nm大小的金 颗粒; 硼氢化钠还原法(1982年)可合成317nm大小的金颗粒
6、; 单宁酸柠檬酸三钠还原法(1985年)可合成317nm大 小的金颗粒。 胶体金合成 将100ml的0.1H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中,并 将其置于搅拌电热炉上,加入一个磁力条并将溶液 加热至沸腾。 向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1二合水柠檬酸三 钠,Na3C6H5O7.2H2O 当获得深红颜色的溶液时停止加热 制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠还原法 胶体金胶体金 粒径粒径 (nm) 1柠檬酸柠檬酸 三钠加入量三钠加入量 (ml)* 呈色呈色max 162.00橙色橙色518nm 24.51.50橙红橙红522nm 411.00红色红色525nm 71.50.70紫色紫色5
7、35nm 胶体金的合成 l注意事项注意事项 (1)氯金酸易潮解,应干燥、避光保存。 (2)氯金酸对金属有强烈的腐蚀性,因此在配制 氯金酸水溶液时,不应使用金属药匙称量氯金酸。 (3)用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三 蒸馏水,或者是高质量的去离子水。 (4)是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁 的,用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经 硅化处理的,硅化方法可用5二氯甲硅烷的氯仿 溶液浸泡数分钟,用蒸馏水冲净后干燥备用。 胶体金的质量鉴定 优质金颗粒和劣质金颗粒 劣质金外形不均一,且 非球形,有凝集现象, 颗粒间变异系数较大 。 透射电镜下观察其颗粒大小及均匀度 理想的金颗粒大小基本相等
8、, 均匀一致,无椭圆形及多角 形的金颗粒存在。 双电层结构保证了胶体金的稳定 性,使金颗粒始终以悬浮状态存 在。 胶体金溶液通常由呈单一分散状 态的金颗粒组成,金颗粒直径在 1-100nm 之间,而稳定的金溶液 则要求金颗粒维持在某一固定直 径不变。 蛋白通常带有多种电荷,当蛋白 带正电时,能与胶体金所带的负 电荷相互作用;而蛋白中的疏水 氨基酸能通过疏水作用将蛋白结 合至金颗粒表面;有些蛋白则可 通过半胱氨酸的巯基与金颗粒共 轭连接。 胶体金的蛋白标记 金标样本程序 l将胶体金调整至正确的pH值 l确定最小蛋白含量 l最终结合(标记) l纯化 胶体金调整正确的pH值 胶体金与蛋白质的结合成功
9、与否,取决于pH值,一 般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢 固地结合,因此,标记之前须将胶体金溶液的pH值调至 待标记蛋白质的等电点略偏碱。 需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3,需要 降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可 能损害pH测定计的探头,因此,一般用精密的pH试纸测 定其pH即可. 常见蛋白标记条件 最小蛋白用量的确定 l (1)光电比色法:制备一系列不 同浓度的等体积蛋白质溶液(1ml), 分别加入5ml胶体金中,迅速混匀, 然后,各加入1ml 10% NaCl溶液, 摇匀,静置5min后测各管。根据胶 体金颗粒的大小,OD在
10、520 580nm之间测定,以OD值为纵坐标, 蛋白质用量为横坐标作一曲线,取 曲线最先与横轴相接近的那一点处 的蛋白质用量为最适稳定量。图中 10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适 稳定量为45g/ml。 l (2)目测法:以目测法确定胶体金与待标记蛋白 质用量比例,将标记的蛋白质逐级稀释后(由 5g45g另设对照管),各取等体积顺序加入 一系列装有1ml胶体金的试管中,5min后,在上述 各管内分别加入0.1ml 10%氯化钠,依表顺序进行。 发现 1、2 号管出现黑色沉淀且红色全部褪去,3 号管虽 然能保持红色,但是管底也出现了一定量的黑色沉淀,而 4、5 号管颜色无变化与对照颜色一致,最低
11、蛋白量即为4 号管的蛋白量。 最终结合(McAb) 取100ml金溶液,调整pH值至8.2 调整滤过和离心的抗体溶液(0.1g/l)至 pH8.2 当金溶液在快速搅拌时要逐滴加入定量的 抗体(蛋白最小浓度量加10%即蛋白稳定 量),大约5分钟加完 在金标溶液中加入10ml滤过的10BSA至 终浓度为1%,并轻轻搅拌10分钟。 纯化 l 超速离心法、凝胶过滤法 胶体金颗粒 /nm pH标记蛋白质离心力/g时件/min 59.0羊抗人IgG4500045 108.2McAb4500030 156.5链霉亲和素12000045 206.0SPA12000030 109.0羊抗兔IgG12000060
12、 几种免疫金探针离心纯化条件 胶体金免疫层析法试剂的组成 u样品垫(Sample pad): 玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材 质,多种规格,批间稳定。 样品垫的作用: 减缓样品渗透速度,有利于样品在结合垫上均匀分布; 去除样品中杂质颗粒; 调节样品液pH值或粘度等。 样品垫可使用化学物质进行浸渍处理,从而减少样本差 异,提高试验的灵敏度。通常可以将洗涤剂、粘性增强剂、 阻滞剂及盐渗入样本垫然后加以干燥,该工艺可避免使用 复杂辨识剂/追迹缓冲液的麻烦,使检测一步完成。 u结合垫(Conjugate pad): 玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材 质,多种规格,批间稳定。
13、结合垫的作用主要为: -吸附一定量的金标结合物颗粒; -吸附并持续不断的将样品转移到NC膜上; -保持金标结合物颗粒的稳定性; -保证金标结合物颗粒定量完全释放等。 玻璃纤维膜玻璃纤维膜/聚酯纤维膜聚酯纤维膜 u硝酸纤维素膜( Nitrocellulose): 一般使用Millipore,MDI,S&S,whatman 等国外公司 的硝酸纤维素膜。 NC膜的作用: - 在检测线和对照线条带区域固定抗体; -样品在NC膜上流动并与试剂混合发生免疫反应; -反应在NC膜上显色,读检测结果 NC膜的重要参数: 孔径、对称性、层析速度、表面活性剂、蛋白结合力、 强度、表面质量、厚度、批间均一性等。 硝
14、酸纤维膜的选择 u膜的分类标准膜的分类标准(m和和s) m: 指的是膜孔径 换算情况大致为:8m=135s;6m=180s u不同秒数的膜对反应的影响不同秒数的膜对反应的影响 通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短,读 数快,那么灵敏度也就越低。反之,反应时间长,读数慢, 也就灵敏度高。同时还有一个问题是,反应时间越长,发 生非特异性结合的可能性就越大,所以过长时间的反应不 一定就能够真正的提升灵敏度。 135s一般用在双抗体夹心法,一般用在双抗体夹心法,180s一般用在竞争法一般用在竞争法. u片材: 不干胶塑料衬底,片材的质量很大程度上影响了 产品的货架期。 u吸收垫(Absorb
15、ent Pad): 提供高吸收率、高容量以及相对稳定吸收率的吸 收纸; 吸收纸的作用: 主要表现在控制样品的流速,促进虹吸作用以及 使试剂跨过膜而不仅仅移到膜上。 胶体金免疫层析试纸模式 双抗体夹心模式 疫病抗原检测 竞争模式 小分子物质检测 SPA/蛋白G模式 疫病抗体检测 双抗体夹心模式 判定检测线 质控线 阳性显色显色 阴性不显色显色 竞争模式 判定检测线 质控线 阳性不显色显色 阴性显色显色 SPA/G蛋白模式 判定检测线 质控线 阳性显色显色 阴性不显色显色 胶体金免疫层析试纸质量检测 胶体金免疫层析试纸的应用 在兽药残留检测中的应用 Zhang等用克伦特罗制备的单克隆抗体标记胶体金作为检测探针,然后将偶 联 BSA的克伦特罗作为 T 线,以竞争模式组装成试纸,用于样品的克伦特罗 残留检测,为我国食品安全检测提供了有效的工具。之后 Zhang 的团队采用 同样的模式制备并组装成功两类兽药残留检测试纸,分别为磺胺间甲氧嘧啶、 恩诺沙星残留检测胶体金免疫层析试纸,为我国兽药残留快速检测技术的发 展奠定了基础。 在兽医疫病检测中的应用 Bhakar等应用相应的单抗标金,建立了阿米巴虫抗原检测方法。Kame
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