实验6 血糖的酶法测定20151109

1、实验实验七七 葡萄糖葡萄糖氧化酶法测定血糖含量氧化酶法测定血糖含量 一一. 目的要求目的要求 掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的原理与方法。 了解临床测定血糖的主要方法及意义。 二实验原理二实验原理 葡萄糖在葡萄糖氧化酶催化氧化下生成葡萄糖酸，同时生成过氧化 氢（H2O2），后者通过氧化氢酶催化供氢体（底物） 4-氨基安 替比林与酚的反应，生成紫红色的醌亚胺。产物颜色的深浅与血清 中葡萄糖的含量成正比。在同样条件下，测定标准葡萄糖溶液和血 清样品的吸光度（A）值，即可求出血清样品中葡萄糖的含量。 三器材及试剂三器材及试剂 1. 器材器材: 酶标板，酶标仪，移液枪。 2. 试剂试剂: u0.1mm

2、ol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）：称取Na2HPO4 8.67g, KH2PO4 5.3g, 加蒸馏水800ml，用1mol/L NaOH 或1mmol/L HCl调节pH7.0， 用蒸馏水稀释至1000ml. u标准葡萄糖贮存液（55.6mmol/L）：将葡萄糖（AR）出于置于 硫酸干燥器内过夜后精确称取1000.0mg，于100ml容量瓶内以 0.02mol/L苯甲酸溶液稀释至刻度，置冰箱可长期保存。 u标准葡萄糖溶液（10mmol/L）：取18.0ml标准葡萄糖贮存液防于 100ml容量瓶内，用0.02mol/L苯甲酸溶液稀释至刻度。 三器材及试剂三器材及试剂 1. 器材器材: 酶标板

3、，酶标仪，移液枪。 2. 试剂试剂: u0.1mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）：称取Na2HPO4 8.67g, KH2PO4 5.3g, 加蒸馏水800ml，用1mol/L NaOH 或1mmol/L HCl调节pH7.0， 用蒸馏水稀释至1000ml. u标准葡萄糖贮存液（55.6mmol/L）：将葡萄糖（AR）出于置于 硫酸干燥器内过夜后精确称取1000.0mg，于100ml容量瓶内以 0.02mol/L苯甲酸溶液稀释至刻度，置冰箱可长期保存。 u标准葡萄糖溶液（10mmol/L）：取18.0ml标准葡萄糖贮存液防于 100ml容量瓶内，用0.02mol/L苯甲酸溶液稀释至刻度。

4、三器材及试剂三器材及试剂 2. 试剂试剂: 酚试剂：取酚1g溶于1000ml蒸馏水中。 酶试剂：取葡萄糖氧化酶1200U、过氧化氢酶1200U、4-氨基 安替比林10mg、叠氮钠100mg，加上述磷酸盐缓冲液80ml，调 节pH7.0，再以磷酸盐缓冲液稀释至100ml，置冰箱内至少可存 放3个月。 酶-酚混合试剂：取等量酶试剂和酚试剂混合。置冰箱内可存 放1个月。 3. 样品样品 新鲜兔血 四四实验操作实验操作 1.兔血清的制备兔血清的制备 兔全血标本（每排一份）于37度水浴孵育1小时以上，于离心 机中3000转离心10分钟，取上清即可。 2.各组取酶标条各组取酶标条2个，编号后个，编号后按下

5、表操作，每组各设按下表操作，每组各设2个重复。个重复。 试剂（试剂（ul）测测定定孔孔标准标准孔孔空白空白孔孔 血清血清5 标准葡萄糖溶液标准葡萄糖溶液5 蒸馏水蒸馏水5 血糖测定（工作液）血糖测定（工作液）195195195 混合各孔溶液，室温反应30min，以空白管调零，设测定波长于 550nm，读取测定管和标准管的A值。 五五计算计算 人人空腹血糖参考值：空腹血糖参考值：3.89-6.11mmol/L （标准液浓度（标准液浓度=10mmol/L） （mmol/L） 六六注意事项注意事项 避免血样品溶血。 反应体系中的过氧化氢酶易受维生素C、谷胱甘肽等的影响。 酶-酚混合试剂应在临用前配制

6、。 移液枪，酶标仪的使用。 用移液枪混匀液体的时候尽量不要产生气泡。 七七思考题思考题 该法的测定原理如何？有何优缺点？ 该法的关键反应是什么？实验过程中应注意哪些因素？ 八八血糖测定的其他方法血糖测定的其他方法 无机化学法：Folin-Wu法，基于葡萄糖醛基的还原性 （特异性差） 有机化学法：邻甲苯胺法 九九本实验的临床意义本实验的临床意义 九九本实验的临床意义本实验的临床意义 血糖血糖水平恒定的生理意义：水平恒定的生理意义： 保证重要组织器官的能量供应，特别是某些依赖葡萄糖供能的 组织器官。 脑组织不能利用脂酸，正常情况下主要依赖葡萄糖供能； 红细胞没有线粒体，完全通过糖酵解获能； 骨髓及

7、神经组织代谢活跃，经常利用葡萄糖供能。 九九本实验的临床意义本实验的临床意义 血糖水平的平衡主要是受到激素调节：血糖水平的平衡主要是受到激素调节： 血糖水平保持恒定是糖、脂肪、氨基酸代谢协调的结果，也是 肝、肌、脂肪组织等各器官组织代谢协调的结果。 机体的各种代谢以及各器官之间能这样精确协调，以适应能量、 燃料供求的变化，主要依靠激素的调节。 酶水平的调节是最基本的调节方式和基础。 主要调节主要调节 激素激素 降低血糖：胰岛素降低血糖：胰岛素(insulin) 升高血糖：升高血糖：胰高血糖素胰高血糖素(glucagon) 糖皮质激素糖皮质激素 肾上腺素肾上腺素 九九本实验的临床意义本实验的临床

8、意义 胰岛素胰岛素是体内唯一降低血糖的激素：是体内唯一降低血糖的激素： 胰岛素(Insulin)是体内唯一的降低血糖的激素，也是唯一同时促 进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。 胰岛素的分泌受血糖控制，血糖升高立即引起胰岛素分泌；血 糖降低，分泌即减少。 九九本实验的临床意义本实验的临床意义 血糖血糖水平异常及糖尿病是最常见的糖代谢水平异常及糖尿病是最常见的糖代谢紊乱：紊乱： 正常人体内存在一套精细的调节糖代谢的机制，在一次性食入大 量葡萄糖后，血糖水平不会出现大的波动和持续升高。 人体对摄入的葡萄糖具有很大的耐受能力的现象称为葡萄糖耐量葡萄糖耐量 (glucose tolerence)。 空腹血

9、糖（空腹血糖（FPG）: 3.9-6.1 mmol/L 糖尿病糖尿病 7.0 mmol/L 低血糖低血糖 2.8 mmol/L T1DM (Type I diabetes mellitus) T2DM (Type II diabetes mellitus) 九九本实验的临床意义本实验的临床意义 临床临床上因糖代谢障碍可发生血糖水平紊乱，常见有以下上因糖代谢障碍可发生血糖水平紊乱，常见有以下 两种类型两种类型： 低血糖低血糖 (hypoglycemia) 高血糖高血糖 (hyperglycemia) 九九本实验的临床意义本实验的临床意义 低血糖：低血糖：血糖浓度低于2.8mmol/L 低血糖的危

10、害：低血糖的危害： 低血糖影响脑的正常功能，因为脑细胞所需要的能量主要 来自葡萄糖的氧化。当血糖水平过低时，就会影响脑细胞的功 能，从而出现头晕、倦怠无力、心悸等，严重时出现昏迷，称 为低血糖休克。如不及时给病人静脉补充葡萄糖，可导致死亡。 九九本实验的临床意义本实验的临床意义 低血糖：低血糖：血糖浓度低于2.8mmol/L 低血糖低血糖的原因的原因： 胰性(胰岛-细胞机能亢进、胰岛-细胞机能低下等)； 肝性（肝癌、糖原累积病等）； 内分泌异常（垂体机能低下、肾上腺皮质机能低下等）； 肿瘤（胃癌等）； 饥饿或不能进食者等。 九九本实验的临床意义本实验的临床意义 高血糖：高血糖：空腹血糖高于6.1mmol/L 临床上将空腹血糖浓度高于6.1mmol/L 称为高血糖 (hyperglycemia)。 当血糖浓度超过了肾小管的重吸收能力(肾糖阈)，则可出现糖尿。 持续性高血糖和糖尿，特别是空腹血糖和糖耐量曲线高于正常范 围，主要见于糖尿病(diabetes mellitus)。 九九本实验的临床意义本实验的临床意义 高血糖：高血糖：空腹血糖高于6.1mmol/L 高血糖高血糖的原因：的原因： 糖尿病； 遗传性胰岛素受体缺陷 某些慢性肾炎、肾病综合症等； 生理性高血糖和糖尿。 九九本实验的临床意