铜绿假单胞菌的分类鉴定

1、1 铜绿假单胞菌的分离及鉴定铜绿假单胞菌的分离及鉴定 组员：张冲组员：张冲 郭泽郭泽 王平王平 2 铜绿假单胞菌 3 实验目的 n了解铜绿假单胞菌的微生物学特性了解铜绿假单胞菌的微生物学特性 n掌握微生物实验技术基本原理及操作掌握微生物实验技术基本原理及操作 n熟悉铜绿假单胞菌的分离鉴定程序及熟悉铜绿假单胞菌的分离鉴定程序及 方法方法 4 概述 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌惯称绿脓杆菌，为革兰惯称绿脓杆菌，为革兰 氏阴性杆菌，属假单胞菌属。它在自然界氏阴性杆菌，属假单胞菌属。它在自然界 分布甚广，空气、水、土壤中均有存在，分布甚广，空气、水、土壤中均有存在， 在潮湿处可长期生存，对外环境的抵抗力在

2、潮湿处可长期生存，对外环境的抵抗力 比其他菌强，抗干燥的能力也强。比其他菌强，抗干燥的能力也强。 5 生物学特性 n 形态：形态：革兰氏阴性杆革兰氏阴性杆菌菌， 菌体菌体长短不一长短不一 ；单端单鞭单端单鞭 毛毛；动力动力阳性；阳性；无芽胞。无芽胞。 n特性：专性需氧特性：专性需氧；生长生长 温度范围是温度范围是2542， 最适生长温度最适生长温度35，4不不 生长。生长。 6 生物学特性 n抗原抗原性性: :O O抗原抗原 H H抗原抗原 粘液抗原粘液抗原 R R抗原抗原 菌毛抗原菌毛抗原 n产生荧光素和水溶性的绿脓素，培养物呈蓝产生荧光素和水溶性的绿脓素，培养物呈蓝 绿色。绿色。 7 生物

3、学特性 n在血平板上形成大而扁平、湿润、有金属在血平板上形成大而扁平、湿润、有金属 光泽、蓝绿色、透明溶血环菌落，有生姜光泽、蓝绿色、透明溶血环菌落，有生姜 味；味； n在在普通平板、普通平板、血平板、麦康凯平板上可形血平板、麦康凯平板上可形 成成5 5种不同形态的菌落种不同形态的菌落 典型型典型型 粘液型粘液型 侏儒型侏儒型 粗糙型粗糙型 大肠菌样型大肠菌样型 8 生物学特性 n菌落呈灰绿色菌落呈灰绿色，大小大小 不一不一, ,扁平湿润扁平湿润，边缘边缘 不规则呈伞状伸展不规则呈伞状伸展， 表面常可见金属光泽表面常可见金属光泽。 典型型（麦康凯平板）典型型（麦康凯平板） 9 生物学特性 n产

4、绿脓素产绿脓素 琼脂染成黄绿色琼脂染成黄绿色 典型型（普通平板）典型型（普通平板） 10 生物学特性 n菌落光滑凸起菌落光滑凸起 成粘液状成粘液状 粘液型（血平板）粘液型（血平板） 粘液型（麦康凯平板）粘液型（麦康凯平板） 11 生物学特性 n菌落中央凸起菌落中央凸起 边缘扁平边缘扁平 表面粗糙表面粗糙 粗糙型粗糙型（麦康凯平板）（麦康凯平板） 12 生物学特性 n菌落圆形凸起菌落圆形凸起 似大肠埃希菌菌落似大肠埃希菌菌落 大肠型（麦康凯平板）大肠型（麦康凯平板） n细小，无光泽细小，无光泽 半透明菌落半透明菌落侏儒型（麦康凯平板）侏儒型（麦康凯平板） 13 生化特性 n 氧化酶：氧化酶：+

5、+ n 葡萄糖的氧化（葡萄糖的氧化（O/FO/F）：）：O O n 枸橼酸盐利用：枸橼酸盐利用：+ + n 精氨酸双水解：精氨酸双水解：+ + n 明胶液化：明胶液化：+ + n 硝酸盐还原：硝酸盐还原：+ + n 乙酰胺酶：乙酰胺酶：+ + n 吲哚试验：吲哚试验：- - 14 微生物学检验 15 脓液脓液 痰痰 尿液等尿液等 直接涂片、革兰染色、镜检直接涂片、革兰染色、镜检分离培养分离培养 （血平板、麦康凯）（血平板、麦康凯） 18-24h35 可疑菌落（金属光泽、可疑菌落（金属光泽、-溶血、产绿色素、特殊气味）溶血、产绿色素、特殊气味） 初步鉴定初步鉴定最终鉴定最终鉴定 色素色素 鉴定鉴

6、定 生化生化 反应反应 42 生长生长 分型分型 （血清学（血清学 噬菌体）噬菌体） 革兰阴性革兰阴性 杆菌，氧杆菌，氧 化酶阳性化酶阳性 菌落特征菌落特征 气味气味 绿脓素绿脓素 报告报告 检验程序 药敏试验药敏试验 16 试验材料 n病料病料：痰液标本：痰液标本 n试剂试剂：氧化酶纸片：氧化酶纸片，明胶，明胶、革兰染色液、革兰染色液、药敏药敏 纸片、纸片、无菌生理盐水及生化管配套试剂无菌生理盐水及生化管配套试剂等等 n培养基培养基：普通平板、普通平板、血平板、血平板、麦康凯麦康凯平板、半平板、半 固体培养基、非发酵菌微量生化管等固体培养基、非发酵菌微量生化管等 n其它其它 ：显微镜、培养箱

7、、小试管、载玻片、：显微镜、培养箱、小试管、载玻片、 接种针、接种环、酒精灯、火柴、接种针、接种环、酒精灯、火柴、平皿平皿等等 17 分离培养 n标本采集标本采集：脓液、浓痰（无菌拭子）：脓液、浓痰（无菌拭子） n痰液标本的前处理痰液标本的前处理 加入等量的加入等量的PH 7.6 的的1% 胰酶溶液，放置胰酶溶液，放置35、 90 min使痰液均质化使痰液均质化。 n直接涂片，直接涂片，革兰氏革兰氏染色染色，镜检镜检 n分别分别接种接种普通普通平板平板、血平板血平板和麦康凯和麦康凯平板平板，培培 养养1824h ，进一步进行鉴定。进一步进行鉴定。 18 初步鉴定 n选出可疑菌落选出可疑菌落 金

8、属光泽、金属光泽、-溶血、产绿色素、特殊气味溶血、产绿色素、特殊气味等等 n初步鉴定初步鉴定 染色镜检染色镜检：取可疑菌落，进行革兰氏染色、镜检。：取可疑菌落，进行革兰氏染色、镜检。 氧化酶试验氧化酶试验：挑取可疑菌落于滤纸片上，滴加一：挑取可疑菌落于滤纸片上，滴加一 滴新配制的滴新配制的5%二甲基对苯二胺试剂，二甲基对苯二胺试剂，15-30min内，内， 出现出现红色至紫红色红色至紫红色，为，为阳性阳性；若不变色，为阴性。；若不变色，为阴性。 19 绿脓菌素试验绿脓菌素试验：选取可疑菌落：选取可疑菌落2-32-3个，置于绿脓菌个，置于绿脓菌 素测定用培养基，于素测定用培养基，于3737培养培

9、养24h24h，加入氯仿、色素，加入氯仿、色素 后，再加入盐酸后，再加入盐酸 ，上层稀盐酸液内出现，上层稀盐酸液内出现红色为阳性红色为阳性， 表示菌落中含有绿脓菌素。表示菌落中含有绿脓菌素。 初步鉴定 20 最终鉴定 n明胶液化试验：明胶液化试验：选取可疑菌落的纯培养物，穿刺选取可疑菌落的纯培养物，穿刺 接种于明胶培养基内，接种于明胶培养基内，3737培养培养24h24h，取出后放入，取出后放入 冰箱冰箱10-30min10-30min，如若溶解，如若溶解，即试验呈即试验呈阳性阳性；如凝固；如凝固 不溶，试验呈阴性。不溶，试验呈阴性。 n硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验：选取可疑菌落的纯培养物，接

10、：选取可疑菌落的纯培养物，接 种于硝酸盐培养基，置于种于硝酸盐培养基，置于3737培养培养24h24h，如若培养，如若培养 基中的小倒管内基中的小倒管内有气体，有气体，试验呈试验呈阳性阳性。 21 最终鉴定 n吲哚试验吲哚试验：选取可疑菌落的纯培养物：选取可疑菌落的纯培养物接种于蛋白胨接种于蛋白胨 水水，培养培养8h-24h8h-24h后，加后，加KovacsKovacs（靛基质靛基质）试剂约试剂约3 3mmmm 高高，如若，如若在液层界面发生在液层界面发生红色红色，即为，即为阳性阳性反应反应。 n4242生长试验生长试验：选取纯被检物，接种于普通琼脂斜：选取纯被检物，接种于普通琼脂斜 面培养

11、基上，于面培养基上，于4242培养培养4h4h，铜绿假单胞菌能，铜绿假单胞菌能生长为生长为 阳性阳性反应。反应。 22 血清学鉴定 n血清群鉴定：血清群鉴定：取洁净玻片，滴加多价取洁净玻片，滴加多价O血清于玻片，血清于玻片， 再接种此菌的纯培养物少许混匀，再接种此菌的纯培养物少许混匀，2min观察凝集现象，观察凝集现象， 鉴定。鉴定。 n血清学分型：血清学分型：按血清分型试剂盒操作说明进行操作：按血清分型试剂盒操作说明进行操作： 将待检测菌在将待检测菌在LB琼脂培养基中过夜培养，取少许与琼脂培养基中过夜培养，取少许与 30L阳性血清混合，一分钟观察结果。阳性血清混合，一分钟观察结果。 n判定标准：判定标准：有凝集块出现，且生理盐水空白对照组有凝集块出现，且生理盐水空白对照组 不凝集者为阳性。不凝集者为阳性。 23 药敏试验 n扩散法（扩散法（K-BK-B法