骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠骨组织GABA信号通路的影响（可编辑）

1、骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠骨组织gaba信号通路的影响 暨南大 学硕士学位 论 文 题名: 骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠骨组织 gaba 信号通路的影响 effect of total flavonoids of rhizoma drynariae on gaba signalling in bone tissue of ovariectomized rats作者姓名: 吕辰 鹏 指导教师姓名 及学位、职称: 张荣华 博士 教授 学科、专业名称: 中药学 论文提交日期: 2011 年 月 论文答辩日期: 2011 年 05 月 答辩委员会主席: 吴清和 教授 论文评阅人: 吴 清和 教授 叶文 才

2、教授 学位授予单位和日期:暨南大学 2011 年月独 创 性 声 明本人声明 所呈交 的学位 论文是本 人在导 师指导 下进行的 研究工 作及取 得的研究成果。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外, 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果 ,也不包含为 获得 暨南大学 或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名:签字日期: 2011 年月日学 位 论 文 版 权 使 用 授 权 书本学位论文作者完全了 解 暨南 大学有关保留、使用学位论文的规定, 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的

3、复印件和磁盘, 允许论文被查阅和借阅。本人授权 暨南大学 可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索, 可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名: 导师签名:签字日期: 年 月 日 签 字日期: 年 月 日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 电话: 通讯地址: 邮编: 暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影响 主要缩略语中英文对照表 缩略语 英文全称 中文全称 alp alkaline phosphatase 碱性磷酸酶 bmd bone mineral de

4、nsity 骨密度 bmscs bone marrow stromal cells 骨髓间充质干细胞 bmp-2 bone morphogenetic protein-2 骨形态蛋白-2 cbf-1 core binding factor -1 核心结合因子 -1 cgrp a-calcitonin gene-related peptide 降钙素基因相关肽 col-i collagen type i 型胶原 camp cyclic adenosine monophosphate 环磷酸腺苷 fgf fibroblast growth factor 成纤维细胞生长因子 glu glutamat

5、e 谷氨酸 gaba gamma-aminobutyric acid - 氨基丁酸 gad glutamate decarboxylase 谷氨酸脱羧酶 gabar gaba receptor gaba 受体 gat gaba transporters - 氨基丁酸转运蛋白 gaba-t gaba transaminase - 氨基丁酸转氨酶 gh growth hormone 生长激素 igf-i insulin growth factor 胰岛素生长因子- il-1 interleukin 1 白细胞介素-1 il-6 interleukin 6 白细胞介素-6 nf- nuclear f

6、actor- 转录核因子-暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影响 nmu neuromedin u 神经介素 u npy neuropeptide y 神经肽 y ob osteoblast 成骨细胞 oc osteoclast 破骨细胞 opg osteoprotegerin 骨保护素 pmop postmenopausal osteoporosis 绝经后骨质疏松症 rankl receptor activator of nf-kappa ligand 核因子- 受体活化因 子配体 sp substance p p 物质 tfrd tota

7、l flavonoids of rhizoma drynariae 骨碎补总黄酮 tgf- transforming growth factor 转化生长因子- th tyrosine hydroxylase 酪氨酸羟化酶 tnf tumor necrosis factor 肿瘤坏死因子 vgat vesicular neurotransmitter transporter 囊泡神经递质转运蛋白 vip vasointestinal peptide 血管活性肠肽 who world health organization 世界卫生组织 5-ht 5-hydroxy tryptamine 5-

8、羟色胺暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影响 摘 要 目的: 观察 gaba 信 号通路在 op 形成过程中的作用及骨碎补总黄酮对其影响。 方 法: 1. 将45只3月龄sd 雌性大鼠随机分为手术组30只和假手术组15只, 手术组采用双侧卵巢切除术复制op 大鼠 模型 , 造模12周 时 通过 双能x线测量bmd 确认op复制成功后,手术组再随机分为模型组15只和给药组15只。 2. 按人鼠剂量换算, 给药组大鼠给予相当于临床成人用药量的骨碎补总黄酮灌胃干预12周,假手术组和模型组给予等量的生理盐水。 3. 应用 双能x 线检测 各 组大鼠的b

9、md ,elisa 法 观察各组大鼠 血清gad 水平, 免疫组织化学技术观察各组大鼠股骨远端gaba 、 gaba r1和gat1的表达,brt-pcr 观察各组大鼠 股骨gaba r1 mrna 的表达。 b结 果: 1. 在造模12 周时,手术组和假手术组比较,大鼠身体多部位骨组织的bmd均显著下降(p 0.05)。 2. 给药结束后,模型组大鼠血清gad水平显著高于假 手术 组 (p0.05 ),给药组 较模型 组则 显 著降 低 (p0.05 ) ,假手 术 组和 给 药组 之间 无 显著 性 差 异(p0.05)。 3. 给药结束后,模型组大鼠股骨gaba 和gaba r1 的表达

10、水平 显著高于假b手术组 (p0.05) , 给药组较模型组则显著降低 (p0.05) , 假手术组和给药组无显著性差异(p0.05 )。 4. 给药结束后,三组大鼠股骨gat1 的表达 水平无显著性差异(p0.05)。 - i - 暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影响 5. 给药结束后, 模型组大鼠股骨gaba r1 mrna 的表达显著高于假 手术组b(p0.01) , 给药组较模型组则显著降低 (p0.05) , 假手术组和给 药组无显著性差异(p0.05)。 结 论: 1. 大鼠 血清gad 水平 增高、 骨组 织gaba 和gaba

11、 r1 的表 达增 加及 股骨bgaba r1 mrna 表达 的增多可能是gaba信号通路参与op 形成的表现之一。 b2. 骨碎补 总黄 酮干预 后能够降 低 大 鼠血清gad 水平、减 少股 骨gaba 和gaba r1的表达及gaba r1 mrna 表达,这可能是其防治op 的机制之一。 b b关键词: 骨碎补总黄酮 ;骨质疏松症;- 氨基 丁酸信号- ii - 暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影响 abstract objective :to investigate the role of gaba signalling in t

12、he formation and development of op and explore the effect of total flavonoids of rhizoma drynariaetfrd on itmethods : 145 female sd rats of 3-month old were randomly divided into operation group30 rats and sham operation group15 rats. the osteoporotic model was established by ovariectomy. 12 weeks a

13、fter ovariectomy, when the op was affirmed by dualenergy x-rayabsorptiometry the rats in operation group were randomly divided into model group15 rats and treated group15 rats2according to the dose conversion between rat and human, the rats in the treated group were respectively treated with gastric

14、 perfusion of tfrd solution that amounted to the dose that used in clinic adult patients and those in the sham operation group and model group received gastric perfusion of normal saline. the gastric perfusion will last for 12 weeks3we got the bone mineral densitybmd through dual-energy x-ray measur

15、ement and the levels of serum gad was obtained by elisa. then, the expression of gaba, gaba r1 and gat1 of distal femur was checked with bimmunohistochemical techniqueand and reverse transcription polymerase chain reaction rt-pcr was applied to detect the the expression of gaba r1 mrna of bfemur- ii

16、i - 暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影响 results : 112 weeks after ovariectomy, the bmd of different parts of rats in model group was significantly lower than that of rats in sham operation groupp 0.052when the 12 weeks gastric perfusion ended, the levels of serum gad of rats in model group

17、was significantly higher than that of sham operation groupp 0.05. while the levels of serum gad of rats in treated group was significantly lower than that of model groupp 0.05, and there was no significantly difference between sham operation group and treated groupp0.053when the 12 weeks gastric per

18、fusion ended, the expression of gaba and gaba r1 of distal femur of rats in model group was significantly stronger than that bof sham operation groupp 0.05. while the expression of gaba and gaba r1 of bdistal femur of rats in treated group was significantly weaker than that of model groupp 0.05, and

19、 there was no significantly difference between sham operation group and treated groupp0.054when the 12 weeks gastric perfusion ended, there was no significantly difference in the three groupsp0.055when the 12 weeks gastric perfusion ended, the expression of gaba r1 bmrna of femur of rats in model gr

20、oup was significantly stronger than that of sham operation groupp 0.05. while the expression of gaba r1 mrna of femur of rats bin treated group was significantly weaker than that of model groupp 0.05, and there was no significantly difference between sham operation group and treated groupp0.05- iv -

21、 暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影响 conclusions : 1it is suggested that the high levels of serum gad and the up-regulated expression of gaba, gaba r1, gaba r1 mrna of bone may be one of the b bevidences that the gaba signalling was involved in development of op2the intervention of tfrd can

22、 reduce the abnormally levels of serum gad and the up-regulated expression of gaba, gaba r1, gaba r1 mrna of bone, b bwhich may be one of the mechanisms of its treatment on opkey words : total flavonoids of rhizoma drynariae; osteoporosis; gamma-aminobutyric acid signalling- v - 暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对

23、去卵巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影响 目 录 摘 要. abstract 目 录. 前 言 1 1 神经因素与骨代谢和op1 1.1 骨代谢和op. 1 1.2 神经纤维在骨组织中的分布. 2 1.3 神经系统对骨代谢及op 的影响2 1.4 神经递质与骨代谢3 1.5 - 氨基丁酸(gaba )信号通路与骨代谢 7 2 骨碎补总黄酮(tfrd )10 2.1 tfrd 在临床防治op 中的应用10 2.2 tfrd 对op 骨量和 骨组织形态学的影响. 10 2.3 tfrd 对op 分子生 物学的影响11 2.4 tfrd 对op 细胞生 物学的影响11 2.5 tfrd 毒理

24、学研究12 3 本课题的研究思路和意义 13 实验研究. 15 1 实验材料. 15 1.1 实验动物. 15 1.2 实验药物. 15 - vi - 暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影响 1.3 主要试剂. 15 1.4 实验器械. 17 1.5 实验仪器及设备. 17 1.6 实验试剂的配制. 18 2 实验方法. 22 2.1 动物饲养. 22 2.2 动物分组. 22 2.3 op 模型复制和bmd 检测22 2.4 给药方法. 23 2.5 标本的采集 23 2.6 血清 gad 含量的 测定(elisa 法)24 2.7 骨组织的

25、脱钙切 片及 he 染色. 26 2.8 sabc 免疫组织化学法检测 gaba 、gaba r1 和 gat1. 27 b2.9 rt-pcr 检测 gaba r1 mrna 的表达. 30 b2.10 统计学方法. 33 3 实验结果. 34 3.1 一般情况. 34 3.2 op 模型复制情况35 3.3 骨组织普通病理结构的变化36 3.4 血清 gad 的表达. 36 3.5 骨组织gaba 、gaba r1 、gat1 的表 达37 b3.6 总rna 的检测. 39 3.7 骨组织 gaba r1 mrna 的表达 39 b- vii - 暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对

26、去卵巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影响 4 讨论 41 4.1 op 大鼠骨组织中 gaba 信号通路的变化 41 4.2 骨碎补总黄酮对 op 大鼠骨组织中 gaba 信号通路的影响 42 结 论. 44 展 望. 45 附 图. 46 参考文献. 49 致 谢. 62- viii - 暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影响 前 言 骨质疏松症(osteoporosis ,op )是 一种慢性系统性骨骼疾病,以骨强度下降,易于发 生骨 折为特 征, 多发生于老 年人尤 其是绝经后妇女 ,世界 卫生组织(world health or

27、ganization,who )将之列为三大老年病之一。随着社会发展,人均寿命 延长 及社会 老 龄化,op 总体发 病率 亦随之逐 渐上 升,其 引 起的骨折可致残、 致死, 不仅给患者个人带来极大的痛苦, 同时也给社会和家庭带来沉重的经济负担 和生 活负担 。 所以,op 防治已经 成 为老龄化 社会 卫生医 疗 保健的突出问题。 1 神 经因素与骨 代谢 和 op 神经系统是机体内起主导作用的调节机构, 控 制和协调着体内器官系统的活动, 使之成为有机的整体, 以适应内、 外环境的不断变化, 保证生命活动的正常1进行 。 机体各组织器官的生长、 发育和再生过程中, 神经系统同样起着不可

28、或缺的调控作用。 就骨组织而言, 神经系统同样发挥着重要的作用。 随着研究的深入,人们逐渐认识到神经系统在骨代谢及op 形成过程中的重要作用。 1.1 骨 代谢 和op 在人体的生长、 发育、 成熟及衰老过程中, 骨组织都在不断地进行自我调整和自我更新, 依靠骨的构塑(modeling)和重 建(remodeling ) 来维 持骨的分布、2质量、 数量和微结构的完整性 。 骨构塑是新生骨生成、 发育和损伤修复的主 要形式,而骨重建则是成熟骨代谢的主要形式。骨重建是由成骨细胞(osteoblast ,ob )主导的骨形成和 破骨细胞(osteoclast ,oc )主导的骨吸收不断耦联更新的过

29、程, 每年约10% 的骨 量通过此种方式更新, 以维持骨质量和骨强度。 在正常生- 1 - 暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影响 理状况下, 旧骨的吸收与新骨的形成相互偶联, 使骨代谢处于一种平衡的、 连续的循环过程中以维持骨密度(bone mineral density ,bmd )及骨矿化 量;若这种偶联被解除,且ob 的 骨形成能力下降,oc 功能过于亢进,骨吸收超过骨形成,导致体内钙磷代谢不平衡, 使骨质大量减少, 骨的微细结构发生改变, 骨脆性增加,则可发生op 。 1.2 神 经纤 维在骨 组织 中的 分布 解剖学和免疫学研究均显

30、示神经纤维广泛分布在骨组织内, 骨髓、 骨质、 骨膜均分布着丰富的感觉神经和交感神经纤维, 骨骼细胞周围均可见纤细的环状神3 5 6经末梢, 同时与 血管伴 行 。bjurholm 等 采用神经纤 维变性 法研究 了骨内神经纤维的性质和功能, 发现骨内神经纤维有三种: 一是无髓的交感神经纤维, 位于血管周围, 可收缩血管, 控制血流; 二是有髓的感觉神经纤维, 分布于血管周围及骨髓;三是分布于骨髓内的无髓神经纤维,可能与调节造血功能有关。 1.3 神经系统 对骨 代谢 及 op 的 影响 神经纤维和神经递质及其受体和载体, 组成了复杂的神经调节网络。 骨组织通过神经骨骼信号通路调节骨骼系统微循

31、环环境, 还直接通过感觉神 经和交感神经末梢释放神经递质, 调节ob 及oc 的增殖、分化、 活化及矿化, 在 骨重建过程7中发挥重要作用,对op 的发病有重要影响 。 近年来许多研究表明, 神经系统与8 11骨代谢的平衡及op 存在着密切的关系 。 临床和实 验研究 都发现 ,交感神 经系统 在骨重 建的过程 中发挥 着关键 的作用, 下丘脑通过肾上腺素能神经及其神经递质可以部分调节骨重建。 肾上腺素能神经影响 着由 绝经、 脊 髓损伤、 抑郁 、制动 等 因素导致 的op 形 成过 程的各个环- 2 - 暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影

32、响 12节 。 一项关于神经性 厌食症患者的研究发现, 导致患者骨量丢失的原因不仅 仅13是制动,ob 中-2 肾 上腺素能神经信号通路被激活也增加了骨量的丢失 。在ob 和oc 中都 发现了- 肾上腺素 及其受 体,神 经突触可 能就是 通过肾 上腺素受体14与骨细胞发生联系 , 这 说明骨骼能够以神经自分泌的形式维持自身组织的整体稳定与修复。 阻断交感神经系统信号还能抑制由性激素匮乏所导致的骨丢失, 因为-2 肾上腺素受体缺 陷小鼠表现高骨量显型,去卵巢后的骨丢失也可以被抑制15。 去卵巢大鼠神经断 面密度明显降低, 也证实了神经系统与去卵巢所致的骨 丢16失存在着联系 。 因此越 来越多

33、的人开始利用肾上腺素拮抗药物来研究交感神 经系统 对 去 卵巢 大鼠或 绝 经 后妇女 骨组 织的影 响 , 为新的 抗op 药 物的 研发提供理论依据 。实验 研究 都 表明肾 上腺素 拮抗 药 物对 去 卵巢 鼠 的骨 量 有提升 的作 用17 19, 在临床研究也取得 了类似的结果,对pmop 患者给予肾上腺素拮抗药物20 23 24干预后,患者的bmd 能得到提高 ,骨折风险也会降低 。 1.4 神经递质与骨 代谢 及 op 随着免疫 组织化 学 技术 的发展和 应用, 人们对 骨神经支 配的认 识也逐 渐加深。 通过大量的实验研究, 已经在骨骼中检测到了肽类、 氨基酸类、 生物原胺类

34、25等多种神经递质类物质 。 1.4.1 降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide ,cgrp ) cgrp 是一种含有 37 个 氨基酸残基的活性多肽,它由降钙素基因编码而成,在骨组织 中cgrp 主要 分布于骨 代谢 活跃、 成 骨活性较 高的 区域, 如 干骺端、骨26膜和髓腔,骨骺的分布较 骨干多, 且 多与 血管伴行 ,ob 自 身也 可自分 泌 或旁27分泌cgrp 。cgrp 对骨重建的影响一方面可 以通过调节血管的血流 量实现,另一方面也可以通过直接影响参与骨重建的相关细胞来实现。 - 3 - 暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对去卵

35、巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影响 28研究发现,ob 和oc 都会表达cgrp 受体 ,cgrp 可以明显刺激体外培养 的ob 中环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate ,camp )水平, 并能使ob 内胰岛素样生长因子-i (insulin growth factor ,igf-i )表达增多,从而增 强ob 合成29代谢的作用 ; 对于oc ,cgrp 可以 在 体外 抑制 其 前体 细胞 数量 , 使成熟oc 数30 31量也相应减少 ,同时 也可以 抑制oc 分化 ,cgrp 还能刺激ob 中 骨 保护 素(osteoprotegerin

36、 ,opg )mrna 表达,同时 亦下调 核因子- 受体 活化因子配体(receptor activator of nf-kappa ligand,rankl )mrna 表达, 从而 可以间接的32调节oc ,维持ob 和oc 间的平衡 。 1.4.2 p 物质(substance p ,sp ) sp 属于速激肽家族, 来 自前速激肽原-a 基因, 为 11 肽, 速激肽受体分为nk1、33nk2、nk3, 均属于g 蛋白耦联受体, 其中nk1 对sp 最敏感 。sp 通 过直接或 间接作用对ob 和oc 分别 起促进或抑制作用, 从而在骨形成和骨吸收的平衡中起调节作用,对骨代谢的调节发

37、挥重要作用。 sp 能明显增加oc 的骨 吸收陷窝面积, nk1 受体拮抗剂则能抑制sp 对oc 骨吸34收功能的刺激效应 ,sohn证实sp 是通过激活 转录核因子- (nuclear factor- ,35nf- ) 来 正调 节骨诱 裂发生 。 同时,sp 能 够抑制ob 的分化 ,从 而减少骨形36 37成 。但goto 等 却发 现,sp 通 过刺 激ob 表达核心结合因 子-1 (core binding factor -1 ,cbfa-1 ) 、 型胶原(collagen type i ,col-i ) 和骨 钙素 (bone gamma-carboxyglutamic-acid

38、-containing proteins ,bgp )mrna 促进其分化。 1.4.3 血管活性肠肽(vasointestinal peptide ,vip ) vip 是由副交感神经纤 维所分泌表达的一种神经肽, 由 28 个氨基酸组成, 为- 4 - 暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影响 38直链结构, 与胰泌素、 胰升糖素同一家族 。 它可以直接或通过ob 间接调节oc的活性。 vip 可以刺激小鼠颅骨ob 中白细胞介素-6(interleukin 6,il-6)mrna 的表达和蛋白的释放, 而il-6 是一种强有力的刺激骨吸收的炎

39、症因子, 从而促进骨吸39 收 ,这可能是因为 vip 以神经- 免疫交互作用 的方式调控il-6 等促 进骨吸收 因40子或前促炎因子的释放来参与 骨 吸收过程 ;同时,vip 通过vpac2 受体 激活41camp 反应和调控il-6 从而在mc3t3-e1 细胞株里抑制ob 分化 。 1.4.4 神经肽 y (neuropeptide y ,npy ) npy 属于胰多肽 相关肽 ,由 36 个氨基酸 组成 ,目前发现了y1、y2 、y4、42y5 和y6 五种npy 受体 ,其中y1 和y2 对骨代 谢的影响最为重要 。 小鼠骨 髓细 胞可以 表 达npy-y1 受体mrnas , n

40、py 能通 过 阻断camp 和43rankl 的 合成抑 制异 丙肾上 腺素诱 导的 骨诱 裂发生 。另外, 短时 间给予npy44能够抑制ob 表达rankl ,还能使骨髓源基质 细胞的opg 表达瞬间增多。 1.4.5 神经介素 u (neuromedin u ,nmu ) nmu 属于 平滑肌 收缩 多肽,广 泛分布 于外周 器官及中 枢神经系 统 , 它的两45个特异性受体介导了其生理作用, 分别为nmu1r 和nmu2r 。 研究发 现,nmu基因 缺陷小鼠表现高骨量显型,其ob细胞增 殖加快,骨形成功能得到促进,但46这不是有ob 独立完成 的,而是在中枢神经系统的调控下进行的

41、。 1.4.6 5- 羟色胺(5-hydroxy tryptamine ,5-ht ) 5-ht 是一种吲哚衍生物,因为最早是从血清 中发现的,所以又称为血清 素(serotonin) , 它也是一种抑制性神经递质, 并广泛存在于动植物组织当中。 5-ht- 5 - 暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影响 必须通过相应受体 的 介导才能产生作用 。 研究发现 , 骨 组 织中表 达 有 5-htt47 48和 5-ht 受体 ,5-ht 信号通路能通过ap1 转录因子参与ob 的分 化 。在小鼠体内用选择性 5-ht 摄 取抑制剂阻断 5-ht

42、t 活 性能导致由骨形成减少,造成的骨49量下降,同样,5-htt 基因缺失也能引起骨形成减少和骨量下降 。 1.4.7 谷氨酸(glutamate ,glu) glu 是中枢神经系统的一种兴奋性氨基酸,调节大多数兴奋性突触中的快速神经传递, 参与神经发育及突触形成。 最近发现,glu信号转导也存在于骨组织中,并 对骨生 物学 有 重要作 用 。 骨组 织表达 离 子通 道 型和 代谢型 谷氨 酸受 体50(glur ) 、 谷氨酸转运蛋白(glt ) 及参与glu信号转导的其他成分 。用针对神经标志物和glu 的抗体 对 大鼠骨切片进行免疫细胞化学研究,发现骨组织存在神经调质glu ,glu

43、 能神 经纤维在干骺端的骨内 膜尤为丰富。一些ob 也含有不同量的glu, 电镜研究也进一步证实, 有glu 免疫反应的神经末端与骨细胞间存在联系,结果 表明骨组织存在glu能神经纤维的支配, 提示ob 与glu源性 神经元相似,51通过囊泡胞吐直接调控glu 释放 。此外,成 熟的oc 还可诱导性表达功能性glu囊泡转运体1(vglut1 )。 glu在调节ob 成熟和oc 形成过程中起着重要的生理作用,n- 甲基-d- 天冬氨酸受体 ( n-methyl-d-aspartic acid receptor , nmdar ) 和 ampa 受体(a-amino-3-hydroxy-5-met

44、hyl-4- isoxa-zolep-propionate receptor ,ampar )激活52均可调节ob的成熟 ,nmda 可影响rankl 诱 导的oc 发生 。nmda 还 可通过53erk1/2信号途径, 增强拉力牵张导致的ob分化 。nmdar 激活可诱导ob 前体增殖,并通过cbf-1 刺 激其分化,从而 促进 骨形成 ,同时nmda 激活 还可刺激54nf- 介导的oc 分化,并抑制成oc 凋亡,增加其数量及骨吸收 。 - 6 - 暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影响 1.5 - 氨 基丁 酸(gamma-aminobu

45、tyric acid ,gaba ) 信 号通路 与骨 代谢 gaba 是哺乳动物神经 系统中最丰富和功能最重要的抑制性神经递质, 在多种生理活动中发挥着重要作用。gaba 信号通 路由glu 、 谷氨酸脱羧酶 (glutamate decarboxylase ,gad ) 、gaba 、 囊泡神经递质 转运蛋白 (vesicular neurotransmitter transporter ,vgat ) 、gaba 受体 (gaba receptor ,gabar ) 、- 氨基丁酸 转运蛋白(gaba transporters ,gat ) 、- 氨基 丁酸 转氨 酶 (gaba tra

46、nsaminase ,55gaba-t )等组成 。 在突触前抑制性神经元, glu经限速酶gad 脱羧而生成gaba,生成 的gaba由vgat 转运至囊泡中储存。gaba 能够以囊泡或非囊泡(反转运)的形式被释放至突触 间隙。 突触 前 膜和突触 后膜均 存在gabar ,gaba 结合并 激活受体诱发神经抑制作用, 然后被gat 摄取, 转运至周围的神经胶质细胞代谢, 在这些细胞中gaba 在gaba-t 的作用下代谢为琥珀酸半醛, 从而终止gaba 的神经抑制作用。gat 存在于突触 前膜和神经胶质细胞表面, 在调节gaba 作用 的强度和时56程中起着重要作用 。 它们能有效地阻止神

47、经递质扩散到邻近的突触, 通过收 集2+神经递质使之重复利用, 并能以非ca 依赖性 的方式释放神经递质, 这是一种反57转的工作模式 。 gaba 的作用是通过药 理学、 电生理学和生物化学特性不同的三种受体亚型(gaba r ,gaba r 和gaba r ) 介导的。gaba r 和gaba r 是离子通道型a b c a c受体, 与gaba 结合后 , 导致氯通道开放, 使 氯离子内流增加, 氯离子的跨膜流58,59动使膜产生抑制性突触 后电位进而引起神经元的抑制 ,作用持续时 间短。gaba r 属于代谢 型受 体超家 族,是 神经 系 统内一 种主要 的抑 制 性神经 递质受b体

48、, 广泛分布在于各种神经元的突触前末梢和突触后膜, 甚至分布于非突触部位- 7 - 暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影响 60。gaba r 通过g 蛋白偶联的第二信使系统, 介导慢的、 持续时间较长的抑 制b性效应, 参与许多重要的生理活动和病理变化。 位于突触前的gaba r 被激活后,b2+通过g蛋白阻滞钙通道,降低ca 内流,减少兴奋性神经递质释放,发挥突触前抑制效应;位于 突触后 膜的gaba r 被激活后 ,可通过g 蛋 白激活细 胞内蛋白激b+酶系统产生磷酸化作用而增加钾电导,k 外流, 产生突触后抑制效应;gaba rb的激活

49、还可影响 其他神 经递质等与第二 信使系 统间的偶联而抑 制其他 神经递质61 64包括glu的兴奋性效应 。 有研究表明, 在 体外 培养的 颅骨 来源 的 成 熟及未成熟的ob 中检 测到了gaba r mrna 和蛋白 的表达, 而没有检测到gaba r 和gaba r ,gaba r 激b a c b动剂能够抑制ob 中camp 的生成并降低ob 中 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase ,2+alp )的活性以及减少ca 内流,提示gaba 可能通过gaba r 影响ob 的代谢、b65增殖、 分化 和成 骨能 力 ,随 后的 研究 发现ob 的前 体细 胞骨 髓间

50、充质干 细胞66(bone marrow stromal cells ,bmsc )中也表达有gaba r mrna ,这进一 步b证实了ob表达gaba r 的结论。在高渗透压环境中,颅骨来源的ob 中gaba 的b聚集增多,gat1 mrna 的表达也增多,同时在新生鼠的胫骨骨小梁表面也检测到了gat1 的表达,持续增高的gaba 能够明显 改变ob 中alp 的含量 ,而gat167,68可能在这一过程中发挥了重要的作用 , 高渗透压环境中高浓度的gaba 可能影响 了ob 代谢和成骨能力。 最新的研究发 现,gaba r2 基因第二外显子brs3750344 单核苷酸多态性 (snp

51、) 与bmd 有 着一定的关系,snp rs3750344 位点tt 、 tc 及cc 基因型携带者个体的上肢、 下肢、 躯干、 肋骨、 骨盆和全 身总bmd 、69骨矿量均依次显著增加 。 可见,gaba 及其受体 和载体存在于骨微循环中, 发挥类似于在神经系统中的兴奋和抑制双向调节的作用, 对骨组织细胞增殖、 分化、 功能活动过程发生重- 8 - 暨南大 学硕 士学位论文 骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠 骨组织 gaba 信号 通路的 影响 要影响。 骨组织内的神经递质通过自分泌和旁分泌的方式介导ob 和oc 的偶联活动, 对维持骨重建平衡有重要影响。 如果出现表达失常, 就会影响骨组织正常代谢并诱导多种骨骼疾病的发生。越来越多的研究证实神经系统与骨代谢和op 形成有着紧密的联系,这不仅为我们研究骨代谢和op 的机制指出了一个崭新的思路,也为研发防治op 的新药提供了重要的理论依据。9图1 神经因素对骨代谢的影响57图 2 gaba 信号通路 - 9 - 暨南大 学硕 士