8 基因组文库的构建与目的基因的获得

1、8 基因组文库的构建与目的基因的获得 8.1 8.1 真核基因组真核基因组DNADNA文库的构建文库的构建 8.2 cDNA8.2 cDNA文库的构建文库的构建 8.3 8.3 目的基因的获得目的基因的获得 基因文库：基因文库：通过克隆方法保存在适当宿主中的通过克隆方法保存在适当宿主中的 某种生物、组织、器官或细胞类型的所有某种生物、组织、器官或细胞类型的所有DNADNA 片段而构成的克隆集合体。片段而构成的克隆集合体。 8.1 8.1 真核基因组真核基因组DNADNA文库的构建文库的构建 l主要步骤：主要步骤： 载体的制备； 基因组DNA的分离； 插入片段的制备； 插入片段与载体的连接； 转

2、化宿主菌； 基因组文库的生成。 用于构建基因组文库的载体用于构建基因组文库的载体 载体名称载体名称容量容量 质粒质粒15kb 噬菌体载体噬菌体载体25kb 黏粒载体黏粒载体45kb 酵母人工染色体酵母人工染色体400kb 细菌人工染色体细菌人工染色体300kb 噬菌体基因组文库的构建噬菌体基因组文库的构建 黏粒基因组文库的构建黏粒基因组文库的构建 YACYAC基因组文库的构建基因组文库的构建 BACBAC基因组文库的构建基因组文库的构建 基因组文库的大小和代表性基因组文库的大小和代表性 8.2 cDNA文库的构建 总总RNA提取提取 mRNA分离分离 寡聚（寡聚（dT）纤维素柱）纤维素柱 cD

3、NA第一链合成第一链合成 反转录酶反转录酶 cDNA第二链合成第二链合成 表达分析表达分析 自身引物合成、置换合成或外加引物合成自身引物合成、置换合成或外加引物合成 cDNA文库构建文库构建 双链双链cDNA克隆克隆 接头克隆接头克隆 引物转接头克隆引物转接头克隆 同聚尾克隆同聚尾克隆 Okayama-Berg载体克隆载体克隆 cDNA的合成和处理 l第一链的合成 反转录：以oligo（dT）为模板由反转录酶合成。 l第二链的合成 自身引导合成法 置换合成法 PCR合成法 l第二链的处理 同聚物加尾 接头法 精简cDNA文库的构建 将亲缘关系很近的细胞系中同源的将亲缘关系很近的细胞系中同源的

4、mRNA除去，使其中一个细胞系中除去，使其中一个细胞系中 不同的不同的mRNA保留并被克隆保留并被克隆 SSH:抑制消减杂交 Suppression subtractive hybridization ESTEST：expressed sequence tag 在人类基因组测序工作中，有一个区别于“全基因 组战略”的“cDNA战略”，即只测定转录的 DNA序列。 从cDNA文库中获取一些长为300400各碱基序列 作为表达序列标签，其作用相当于全基因组测序 时的序列标记位点（STS），即可用来验证和整 理不同实验室发表的cDNA测序资料。 两端又重叠序列的EST可以装配成全长的cDNA序列。 特定的EST序列有时可代表特定的cDNA。 8.3 8.3 目的基因的获得目的基因的获得 l已知基因序列基因的分离已知基因序列基因的分离 核酸杂交法 PCR筛选 表达文库的免疫学筛选 l对未知序列基因的分离对未知序列基因的分离 染色体步移 杂交捕捉和释放 DDRT 限制性标记cDNA扫描 l基因的人工合成基因的人工合成 染色体