细胞CDK2CYCLINA激酶活性荧光共振能量转移法定量检测

1、细胞 CDK2/CYCLIN A 激酶活性荧光共振能量转移法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)主要用途细胞 CDK2/CYCLIN A 激酶活性荧光共振能量转移法( FRET )定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针 EDANS 供体和 DABCYL 受体双重标记的多肽底物，在 CDK2/CYCLIN E 抑制剂的存在下，受到 CDK2/CYCLIN A 的磷酸化后，不能被位点特异性氨基肽酶切离，而发生荧光峰值的降低，即采用荧光共 振能量转移法来测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其 适用于各种细胞裂解萃取液样品 (动物、 人体)、部分或完全纯化酶样品中 C

2、DK2/CYCLIN A 激酶的特异活 性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，安全可靠。技术背景细胞周期素依赖性激酶 2(cyclin dependent kinase 2 ；CDK2 ；EC 2.7.11.22)，又称为细胞分裂周期蛋白 1(cell division cycle1 ； CDC1 )或 p33，属于丝氨酸 /苏氨酸激酶( serine/threonine protein kinase)家属成员之一。 其与酵母细胞的 cdc28和cdc2高度进化保留。细胞周期素依赖性激酶2的催化亚体，与细胞周期素 E然后 A结合，允许细胞由 G1期进

3、入 DNA 合成期， 达到调节细胞生长、 DNA 复制、 细胞分裂等。 p21Cip1 (CDKN1A ) and p27Kip1 ( CDKN1B )是CDK2激酶的抑制剂。 CDK2/CYCLIN A 激酶的磷酸化目标序列为 HHASPRK 。 基于磷酸化多肽具有抗氨基肽酶切离的功能，通过荧光共振能量转移法(Fluorescence resonance energytransfer；FRET )，即传递激发状态的能量由处于较短波长的供体 (donor)到覆盖供体波长的受体 (acceptor)， 使得距离依赖性反应的供体的散发光子淬灭(quench)，使用2个荧光探针 EDANS供体和DA

4、BCYL 受体作为FRET对，来标记的 CDK2 多肽底物的两端，在氨基肽酶( aminopeptidase)的作用下，释放出强烈荧光的 EDANS ；一旦在 CDK2/CYCLIN E 抑制剂二氨基吡唑 -1氢4-基偶氮酚【 4-(3,5-diamino-1 H-pyrazol-4-ylazo ) -phenol】的存在下，底物受到 CDK2/CYCLIN A 的磷酸化(由 ATP的-磷酸根到多肽上单一丝氨酸残基分子 上)，底物将不能被位点特异性氨基肽酶切离，而无法释放出EDANS ，由此根据产物荧光强度(激发波长340nm，散发波长 490nm)的降低，来定量测定细胞周期素依赖性激酶2/细

5、胞周期素 A 的特异活性。CDK2/CYCLIN A 反应系统为：CDK2/CYCLIN ADABCYL - HHASPRK - EDANS+ ATP DABCYL -HHApSPRK - EDANSaminopeptidaseaminopeptidase DABCYL - HHA + SPRK - EDANS60 毫升10 毫升1.5 毫升50 微升DABCYL -HHApSPRK - EDANS DABCYL -HHApSPRK - EDANSDABCYL - HHASPRK - EDANS产品内容清理液( Reagent A) 裂解液( Reagent B) 缓冲液( Reagent C

6、) 底物液( Reagent D)500微升500微升500微升10 微升50 微升(另购)1份反应液( Reagent E) 酶解液( Reagent F) 终止液( Reagent G) 标准液( Reagent H)磷酸化底物液( Reagent I) 产品说明书保存方式 保存 清理液( Reagent A)和 裂解液( Reagent B)在 4冰箱里，其余的保存在 20冰箱里； 底物液 ( Reagent D)和 标准液( Reagent H)避免光照，有效保证 6 月用户自备CDK2/CYCLIN A 激酶：用于抑制剂筛选磷酸化底物液( Reagent I)：用于测定样品磷酸化程度

7、的反应试剂1.5 毫升离心管：用于标准样品操作和样品保存的容器15 毫升锥形离心管：用于样品操作的容器 细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离 (微型)台式离心机：用于细胞预处理 黑色酶标板：用于反应和比色的容器 荧光酶标仪：用于荧光分析实验步骤实验开始前，将 20冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。一、样品准备1 准备好 25cm2细胞培养瓶或 60mm细胞培养皿的待测培养细胞( 1至 5 X 106细胞)2 小心加入 3 毫升 清理液( Reagent A)，覆盖生长表面3 小心抽去清理液4 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意： 避免使用胰酶消化 )5 加入 3 毫升 清理液( Reagen

8、t A)，混匀细胞6 移入到预冷的 15 毫升锥形离心管(注意： 悬浮细胞从这一步骤开始 )7 放进 4台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g8 小心抽去上清液9 加入 500 微升 裂解液( Reagent B)，充分混匀10转移到预冷的 1.5 毫升离心管11强力涡旋震荡 15 秒12置于冰槽里孵育 30 分钟13放进 4微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g(或 13000RPM ，例如 eppendorf 5415) 14小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管15移取 10 微升进行蛋白定量检测(注意： 建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试

9、剂盒 HL30030.1 )16即刻放进 70保存或置于冰槽里继续后续操作测定准备1 准备好待测样品(例如细胞萃取液或纯化酶样品等) ，置于冰槽里2 设定好荧光酶标仪(温度为 25)：激发波长 360nm，散发波长 490nm ，并置零3 准备好 5 个1.5 毫升离心管，标记为 1至 5号管4 加入 98微升 缓冲液( Reagent C)到 1号管5 分别加入 50 微升 缓冲液( Reagent C)到 2 至 5 号管6 移取 2 微升 标准液( Reagent H) 到 1 号管，混匀7 小心移取 50 微升 1 号管稀释的 标准液( Reagent H)到 2 号管，混匀8 小心移

10、取 50 微升 2 号管稀释的 标准液( Reagent H)到 3 号管，混匀9 小心移取 50 微升 3 号管稀释的 标准液( Reagent H)到 4 号管，混匀10将 1 至 5 号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表管号缓冲液( Reagent C )标准液( Reagent H)标准 EDANS 浓度198 微升2 微升5 微摩尔 / 升250 微升50微升 1 号管2.5微摩尔 /升350 微升50 微升 2 号管1.25 微摩尔 / 升450 微升50 微升 3 号管0.625 微摩尔 /升550 微升00三、荧光测定(一)活性测定1 在 96 孔酶标板上做好相应标记：标准样品

11、和待测样品2 分别移取 20 微升 缓冲液( Reagent C) 到相应孔中3 分别加入 2 微升 底物液( Reagent D)4 分别加入 20 微升上述配制的标准液或待测样品( 20 微克纯化酶或 100 微克细胞裂解萃取液蛋白) (注 意： 样品须清澈)5 分别加入 20 微升 反应液( Reagent E)6 轻轻摇动 96 孔酶标板 30 秒7 在室温下孵育 60 分钟8 分别加入 20 微升 酶解液( Reagent F)9 轻轻摇动 96 孔酶标板 30 秒10在室温下孵育 30 分钟11分别加入 20 微升 终止液( Reagent G)12即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对

12、荧光读数RFU ( Relative Fluorescence Unit)13活性计算：1) 构建标准曲线：纵座标( Y 轴)为相对荧光单位 RFU ；横座标( X 轴)为标准 EDAN 浓度(微 摩尔 /升)2) 根据标准曲线计算样品中所释放的 EDAN 浓度3) 实际活性计算：样品 EDAN 浓度（微摩尔 /升）X 样品稀释倍数 1（小时；反应时间） 纳摩尔 EDAN/毫升/小时（样 品蛋白浓度）毫克 /毫升纳摩尔 EDAN/ 毫克 /小时（二）活性抑制测定（抑制剂筛选）1 在 96 孔酶标板上做好相应标记：背景、零抑制、完全抑制和待测抑制剂样品2 按下表加入试剂内容物样本背景零抑制对照（

13、0抑制）完全抑制对照（100抑制）待测抑制活性缓冲液（ ReagentC）17 微升20 微升40 微升15 微升底物液（ ReagentD）2微升2 微升2 微升待测抑制剂5 微升5 微升用户自备的纯化酶20 微升20 微升20 微升20 微升反应液（ Reagent E）20 微升20 微升20 微升96 孔板每孔总量背景孔（62 微升）零抑制孔（62 微升）完全抑制孔 （62 微升）待测抑制剂样品（62 微升）3 轻轻摇动 96 孔酶标板 30 秒4 在室温下孵育 60 分钟5 分别加入 20 微升 酶解液（ Reagent F）6 轻轻摇动 96 孔酶标板 30 秒7 在室温下孵育 3

14、0 分钟8 分别加入 20 微升 终止液（ Reagent G）9 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数RFU （ Relative Fluorescence Unit）10抑制活性计算：1）（完全抑制读数零抑制读数）（抑制剂样品读数样本背景读数） （完全抑制读数零抑制读数）实际抑制百分率2）IC50： 50抑制率所需的抑制剂浓度 X（所需抑制剂浓度）（已知抑制剂样品浓度实际抑制百分率） X 503）直接构建抑制曲线：纵座标（ Y 轴）为相对荧光单位 RFU ；横座标（ X 轴）为已知抑制剂浓度（三）磷酸化百分率测定1 在 96 孔酶标板上做好相应标记：背景、零磷酸化、完全磷酸化和待测样品

15、2 按下表加入试剂内容物样本背景完全磷酸化对照（100磷酸化）零磷酸化对照（0磷酸化）待测样品磷酸化缓冲液（ ReagentC）22 微升40 微升40 微升20 微升底物液（ ReagentD）2 微升2 微升样品液20 微升20 微升磷酸化多肽2微升反应液（ Reagent E）20 微升20 微升20 微升20 微升96 孔板每孔总量背景孔（62 微升）完全磷酸化孔（62 微升）零磷酸化孔 （62 微升）待测样品（62 微升）3 轻轻摇动 96 孔酶标板 30 秒4 在室温下孵育 60 分钟5 分别加入 20 微升 酶解液（ Reagent F）6 轻轻摇动 96 孔酶标板 30 秒7

16、在室温下孵育 30 分钟8 分别加入 20 微升 终止液（ Reagent G）9 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数RFU （ Relative Fluorescence Unit）10磷酸化百分率计算：（完全磷酸化读数零磷酸化读数）（样品读数样本背景读数） （完全磷酸化读数零磷酸化读数）样品磷酸化百分率注意事项1 本产品为 25 次操作，包括标准液2 操作时，须戴手套3 系统操作过程中，标准液测定只需 1 次4 样品须澄清，至关重要5 孵育反应完成后即刻进行荧光测定6 荧光滤波器可以使用激发波长在 34030nm，散发波长 49030nm7 待测样本为粗提酶样品， 其蛋白浓度为 20微克/20 微升；待测样本为细胞裂解悬液， 其蛋白浓度为 100 微克/20 微升（本公司