博士研究生课高级生物化学与分子生物学专题分子生物学技术在病理学上的应用许丽艳.

1、Application of Molecular Biology Technique in the Pathology DNA Analysis Southern Blot: telomere length; amplification; deletion PCR: mutation; virus In situ hybridization: gene location; translocation DNA Chip: SNP Bioinformatics RNA Analysis Northern Blot : expressed genes RT-PCR: expressed genes

2、In situ hybridization: gene location cDNA microarray : differentially expressed genes Bioinformatics Protein Analysis Western Blot: protein concentration Immunohistochemical Technique: protein location 2-D Electrophoresis: differerentially expressed proteins Bioinformatics 双向电泳技术及其应用 双向电泳技术的原理 利用蛋白质

3、等电点和分子量的不同来 分离复杂蛋白质组分 双向电泳技术的发展历史 1975年O， Farrell首先提出了经典的双向电 泳技术体系。他用管状载体两性电解质凝胶作为 第一向进行等电聚焦，聚焦聚焦后的管状凝胶在含 SDS的缓冲液中平衡后，以琼脂糖包埋置于垂直 板SDS凝胶的浓缩胶上，然后用Laemmli的不连 续SDS梯度凝胶电泳作为第二向。这种双向电泳 技术被称之为ISO-DALT系统。ISO-DALT系统存 在着许多问题，如易发生阴极漂移，载体两性电 解质pH梯度不稳定以及重复性差等。 1985年年G rg A等发展了等发展了IPG-DALT系统双系统双 向电泳技术。它利用固相向电泳技术。它

4、利用固相pH介质来形成一定范介质来形成一定范 围的围的pH梯度。固相梯度。固相pH介质是一类丙烯酰胺的介质是一类丙烯酰胺的 化合物，它与聚丙烯酰胺共价结合后形成一定化合物，它与聚丙烯酰胺共价结合后形成一定 范围的范围的pH梯度。它不受脱水、重新水化和电场梯度。它不受脱水、重新水化和电场 等因素的影响，因而具有不产生阴极漂移，等因素的影响，因而具有不产生阴极漂移，pH 梯度稳定，上样量大，重复性好，分辨率高等梯度稳定，上样量大，重复性好，分辨率高等 优点。目前世界上越来越多的实验室选择优点。目前世界上越来越多的实验室选择IPG- DALT系统双向电泳技术。系统双向电泳技术。 样品的预处理 样品的

5、预处理是双向电泳的重要环节之一。 双向电泳样品预处理的目的之一就是使样品在 样品缓冲液中充分溶解、变性和还原，完全打 破蛋白之间的相互作用。通常的样品缓冲液包 括8M尿素，4%(w/v)CHAPS，50-100mM DTT和 40mM Tris。然而这种“标准”的样品缓冲液 并非对所有蛋白质的预处理都是理想的，特别 是膜蛋白、与膜相连的蛋白质以及具有高抗性 组织的蛋白(如头发和皮肤等)。 最近有许多可改变这些蛋白质溶解度的报道。如 Rabilloud等介绍了用硫脲(2M)和尿素(5-7M)来增加 蛋白的溶解。Herbert等用不带电荷的三丁基膦 (tributyl phosphine，TBP)

6、代替含巯基的还原剂DTT， 它既可增加蛋白的溶解，同时又不会因DTT在碱性环 境带电而造成蛋白的丢失，特别是对于那些易于以二 硫键相互作用的蛋白质(如角蛋白)。另外，样品的预 处理还应考虑去除非蛋白质组分(如核酸、盐离子)。 在细胞蛋白质变性之前应通过透析（或层析）和微量 的 DNase/RNase来去除盐离子和核酸，以减少条纹和 不均一背景的出现。 胶条的选择和第一向等电聚焦 目前商品化的IPG胶条已逐渐为各实验室所采用。胶条的 选择直接影响到实验结果的好坏。通常选胶的原则主要 有以下几点：1.快速筛选或仅对最高丰度蛋白质感兴趣时 可选择短胶条，而要获得最高分辨率和最大上样量时可 选择长胶条

7、。2.选择pH为3-10的胶条可观察细胞总蛋白 的分布，并可分离尽可能多的蛋白质。而使用窄pH范围 (如pH6-7)能更精确研究这一感兴趣pH范围的蛋白质。3. 对于一个未知样品，可先使用较宽pH范围的胶条来找出 所需蛋白质的位置，然后再用合适的窄pH范围的胶条更 好地分辨这些蛋白点。 IPG胶条经再水化和加样后可进行第一向等电聚焦。 通常的聚焦参数包括时间、温度和电压。合适的聚焦时 间取决于样品量、胶长和pH范围等。聚焦的温度最好在 20左右。因为温度过低(4以下)，尿素会结晶失去其 原有的作用；而温度过高则会造成尿素结构的破坏，产 生异硫氰酸盐而使蛋白发生氨基甲酰化，最终导致蛋白 质等电点

8、的改变。在等电聚焦过程中通常先设置低电压 促使样品进入凝胶和去除过量的盐离子，然后再用高电 压进行等电聚焦。若采用专门的双向电泳装置和附件进 行等电聚焦，可先按说明书进行操作和设置各参数，再 经过不断的摸索得出最佳的聚焦条件。 平衡 平衡的目的是使蛋白质分子与SDS充分的相互作用，使蛋白 质根据分子量的大小而进行第二向迁移。一般的步骤是先在第一 步平衡缓冲液（含DTT和SDS）中平衡1015min，再在第二步平 衡缓冲液（含碘乙酰胺和SDS）中平衡1015min。平衡的时间不 宜过长。因为第一向等电聚焦使用的是非限制性凝胶，孔径较大， 平衡时间过长会导致蛋白分子的扩散，使结果出现横纹。Yan等

9、 发现通过改变平衡缓冲液pH值(pH8.0)，烷基化试剂的浓度 （125mM碘乙酰胺）和平衡时间（15min）可将几乎所有的Cys 烷基化，这个修改不但不改变双向电泳蛋白质组模式，而且更利 于在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDITOFMS) 分析时进行蛋白消化。 IPG胶条的转移 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 染色 银染 考马斯亮蓝染色 荧光标记 放射自显影 凝胶图像分析及数据处理 SDS凝胶经染色后，可用图像扫描仪或数码 照相系统等把复杂的蛋白质图谱用数字化格 式捕获并为下一步分析提供依据。利用凝胶 图像分析软件进行斑点检测、背景消除和匹 配分析以找出差异表达的蛋白，通过质谱及 N端测

10、序等鉴定差异蛋白质点。常用的分析 软件有PDQuest、ImageMaster 2-D、 Melanie和Phoretix 2D等 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱 （MALDI-TOF-MS） 肽质量指纹图 Auto MS-Fit软件进行搜索 (/ucsfhtml4.0u/msfit.htm)。 电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS） 生物信息学分析 1 2 3 4 5 6 SDS-PAGE 310 图1 SHEE细胞(左)与SHEEC细胞（右）可溶性 总蛋白质双向凝胶电泳图谱差异表达分析 图2 1号蛋白质点的肽质量指纹谱 Spot No

11、. Accession No. Theoretic Mr theoretic Mr Intensity Matched (%) Length (AA) expressionProtein name 110719660555494.810%494RNPEP-like protein 21916615759408.844%654ribosomal RNA gene upstream sequence binding transcription factor 335053354938.227%331uracil DNA glycosylase 416306978386187.647%339annex

12、in A2 57428977929289.244%832p300/CBP- associated factor 6 new protein 验证实验验证实验 protein RNA DNA 生物芯片技术及其应用 生物芯片的概念及其原理 概 念：主要指通过平面微细加工技术在固 体芯片表面构建的微流体分析单元和系统， 以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其它生物 组分的准确、快速、大信息量的检测。生物 芯片是继大规模集成电路之后的又一次具有 深远意义的科学革命。 原理： 碱基互补杂交 抗原抗体反应 配体和受体相互作用 生物芯片的分类 DNA芯片 膜芯片 模式生物芯片 蛋白质芯片 玻璃芯片 自行设计芯片

13、组织芯片 生物芯片技术的应用（与医学相关）： 研究疾病的发病机理 临床疾病的诊断 生物基因多态性分析 筛选药物 法医学鉴定 Tissue(Cell) 1 Tissue (Cell) 2 Total RNA Total RNA PolyA+ +mRNAmRNA PolyA+ +mRNAmRNA Probe 1 Probe 2 Microarray membrane 1 Microarray membrane 2 Analysis Identification COORDINATE GENBANK LOCUS LINKSWISSPROTRatio(H5E31/92)GENE NAME A7cY00

14、5033880P087272.585992keratin 19 C6nX8785255558P518050.301826SEX gene C3eD212355886P547250.437793RAD23 (S. cerevisiae) homolog A D2jU439013921P088652.692179laminin receptor 1 (67kD, ribosomal protein SA) D5eU597529266Q157952.107921pleckstrin homology, Sec7 and coiled/coil domains 2 (cytohesin-2) D5gX

15、515217430P15311 P23714 2.928384villin 2 (ezrin) E2hM155185327P007504.065384plasminogen activator, tissue A1fX663651021Q005343.500128cyclin-dependent kinase 6 E3eX176204830P155315.216105non-metastatic cells 1, protein (NM23A) expressed in E3fL167854831P223922.34096non-metastatic cells 2, protein (NM2

16、3B) expressed in E4eM645955880P151532.448439ras-related C3 botulinum toxin substrate 2 (rho family, small GTP binding protein Rac2) E6dM234103728P149232.003283junction plakoglobin http:/http:/http:/http:/ 新基因克隆及其功能研究策略 NNAAAAA _ 3 5 _ 3 _ NNTTTTT_ 5 Region to be amplified by 5-RACE Region to be ampl

17、ified by 3-RACE NGAL1 NGAL2 Generalized first-strand cDNA PolyA+ mRNA 图1 5-RACE 和3-RACE反应原理简图 基因 表达调控 相互作用 生物信息学 生物学行为 生物信息学： http:/www.ncbi. nlm. 表达调控： 顺式作用元件 酵母单杂交技术 相互作用： 免疫共沉淀 酵母双杂交技术 生物学行为： 反义封闭 裸鼠实验 临床样本 基因敲除 Isolate DNAAmplify DNA, Label, & Hybridize to arrays + formaldehyde DNA Cell

18、lysis Sonicate 1kb DNA Target protein Y Add antibody *Add protein A beads Wash/Elute DNA-Protein complexes Y Y Reverse X-links Y DNA RNA Genotyping: Is it A or B? Gene Expression: Which genes? How much? Eukaryotic Cell One Genechip System DNA-Genotyping Family based linkage studies Whole-genome disease association Pharmacogenetics Chromosomal copy number Population genetics Linkage Disequilibrium Resequencing RNA-Expression Analysis Biomarker discovery Mechanism of Action Transcription factor binding Tra