液相色谱操作

1、液相色谱操作 第一步 样品前处理：当一个样品在注射进液相色谱系统分析之前我们要先了解一下这个 样品的纯度如何， 也就是说这个样品能否直接进入我们的液相色谱系统， 现在我 们的样品来源一般分为三类， 1 是天然产物中提取的； 2 是有机合成的； 3 是代 谢后的产物，不管任何一种样品在我们得到之前都会含有以下两类杂质： 1 是在 我们的流动相中不溶的 （也就是说当我们将样品用流动相配置好后， 样品有沉淀 或者浑浊） 这种样品如果直接注射入我们的液相色谱系统， 很快我们的系统就会 被堵塞，压力过高。 2 是可溶性的杂质（也就是说这些杂质在配置样品时一样可 溶，但是它们在色谱柱上有很强的吸附， 我们

2、所使用的流动相根本就不能将这些 成分从色谱柱上洗脱下来） 这样我们所使用的色谱柱的柱效很快就会下降， 提高 了我们使用 HPLC 的工作成本和降低了分析效果。 那怎样鉴别自己的样品里有没 有可溶性杂质的方法很多， 这里就不介绍了 （最简单的办法是在做过样品后用强 洗脱能力的流动相看能否再洗脱下来东西） 所以任何一种样品在进入液相色谱系统之前都应该做以下处理 主要用品：1、样品过滤器（过滤不溶性杂质）2、萃取小柱（过滤可溶性杂质或富集作用）参见图表液相色谱操作第二步流动相的处理（我们建议 HPLC 系统的所有流动相都采用 UV 级试剂）（1）流动相应通过 0.45um 的有机滤膜进行过滤（专用溶

3、剂过滤瓶，隔膜 真空泵或循环水泵）甲醇和水可以用水系滤膜；当流动相中有乙腈， 四氢呋喃等强溶剂时用有机滤膜（2）将过滤后的流动相在超声波清洗器中进行 15-20 分钟的脱气（待用） 一般存放期不超过一个星期。（3）流动相进入液相色谱泵时应经过 2um 的流动相过滤头过滤（一般仪 器均有配置，可定期进行超声清洗或更换）1、 首先我们讲一下进出口单向阀， 现在的单向阀通常都是由单向阀套和蓝宝石 球垫和红宝石球组成的， 它只允许液体单向流动， 由于对蓝宝石球垫和红宝 石球表面的光洁度和尺寸要求非常严格， 所以一些国产的仪器在这方面一直 做的不是很好，直接的后果就是压力波动比较大，分析数据就不准确。单

4、向 阀最常见的问题就是 1 单向阀中形成了一个气室（有一个小气泡在单向阀 里，很难排除，后果就是你的液相色谱泵不能工作或者有一个泵头不能工作， 表现在压力上就是压力忽升忽降，单泵头的泵就不能吸液。 2 由于流动相的 黏度比较大，或者盐的成分比较高，使用后没有冲洗干净，造成了进口的单 向阀中蓝宝石球垫和红宝石球粘连， 这种情况的表现和单向阀里形成了气室 是一样的。3 就是液相色谱泵长期使用蓝宝石球垫和红宝石球有了一些磨损，- 1 -7 不能密封了，吸上来了流动相在高压下有回流，不能打到色谱柱里边，也就 是不接色谱柱时有可能能流出液体，但是接上色谱柱时就没有压力的上升。 通常我们对于有气室和粘连我

5、们可以自己解决 （把单向阀卸下来， 先用注射 器，不是进样针，是塑料的那种，用水或者乙醇冲洗，然后放到超声波里清 洗 30 分钟，情况应该就有所好转，对于第三种情况就只能换单向阀了。2、 柱塞密封在液相色谱泵头中是非常重要的， 国外是要求每 500 个小时就要更 换一次，这在国内是不可能的，但是随着柱塞杆对柱塞密封的不断磨损，当 你发现泵头从中间漏夜（这时候压力也上不去）这时还是要更换的3、柱塞杆，通常的柱塞杆也是由蓝宝石加工成的，精密度相当高，而且它的颈 项耐压力相当高， 所以能够顶动几百公斤的压力， 但是向玻璃棒一样如果你 从侧面用力，一下就断了，所以在拆卸泵头时一定要小心。柱塞杆通常的问

6、 题也是使用时间过长， 或者流动向中的盐干结在柱塞杆的表面， 在经过柱塞 密封时划伤，造成泵压力不稳，柱塞密封亦坏，所以在使用带有盐的流动相 后一定要用蒸馏水冲洗柱塞杆， 最好是选择带有自动清洗柱塞杆功能的液相 色谱泵。一般的液相色谱泵在经过泵头吸液后液体都会经过一个或多个压力传感器， 我们 应该注意， 在没有开流动相的时候压力应该在 0以上，不能够飘到负值， 因为到 了负值就不能够真实的反映压力，应该及时的联系生产厂家进行维修。 因为各家仪器的电路控制系统不一样， 我这里就不讲电路系统了， 而且一旦电路 系统出了问题，应该马上联系生产厂家进行维修。 那接下来所有液相色谱泵的出口都有一个在线过

7、滤器， 这个在线过滤器的筛板孔 径从 0.2-2um 不等，它的主要作用是过滤流动相中的杂质和柱塞杆从柱塞密封上 摩擦下来的颗粒， 当你的液相色谱系统在没有接到进样阀时， 泵就有很高压力时 更换筛板或者将筛板卸下来放到 6 个当量的稀硝酸里超声清洗） 通常我们从液相色谱泵到进样阀之间的管路内径为 0.02 英寸，我们的流动相经 过这样的管路进入我们的进样系统。进样系统常用消耗品进样系统呢分为两类： 自动进样器和手动进样器； 自动进样器的进样精度和重现 性都是很好的， 但是由于价格比较昂贵， 所以现在比较普遍的还是罗丹尼公司生 产的 7725I 进样阀，基本上各家仪器所配的手动进样阀都是罗丹尼的

8、。 自动进样器呢因为各家的型号不一样， 这里不做介绍。但是它们有共同的消耗品， 样品瓶和瓶垫， 因为这些东西是通用的， 所以购买的时候没有必要找原生产厂家 购买。罗丹尼进样阀前面有一个进样口，后边有 6 个口，分别接的是 1，4之间是定量 环，2接泵，3 接柱子， 5，6 是费液。在 LOAD 状态样品由进样口进入 1，4 定 量环，定量环满后样品由 5流出；当进样阀搬到 INJECT 状态时从泵来的流动相 到 2 再到 1 带着样品经过 4， 3 到了色谱柱进行分离，在 INJECT 状态下如果把 样品从进样口注入，则直接从 6 排出，不会进入定量环和色谱柱。 用手动进样阀进样时，分为满环进

9、样和部分进样，一般满环进样需要进定量环 3 倍以上体积，才能得到一个比较好的重现性，通常 20ul 的定量环我们用 100ul 的进样针进样 80ul 左右就比较准确， 如果样品比较多的话， 可以用 0.5ml 的玻璃- 2 -7 注射器配合进样阀本身配备的平头进样针头进样。 为了防止样品的交叉污染， 我 们建议一类样品一只注射器。 部分进样时就需要比较熟练的进样技巧， 一般 20ul 的进样针进 8-15ul 时是比较准确的。进样阀最常见的问题就是转子密封被划通， 从进样口处漏夜， 除长期磨损的情况 外，使用尖的注射器或不规格的注射器是造成这种后果的主要原因， 现在比较常 用的 HAMTIO

10、N 的注射器是比较好的一种进样针，另外在进样阀安装时应保证 费液管和定量环的最高点在同一个水平面，防止定量的不准确。样品从进样阀出来后， 一般先经过色谱柱的保护系统， 由于色谱柱的价格都比较 昂贵，所以在不影响分离的情况下最好都能添加色谱保护系统： 一般一根保护柱 能够有效的延长色谱柱 1/3 的寿命色谱保护系统常用消耗品1、 在线过滤器它主要的功能是过滤样品中不溶性杂质，它里边的筛板一般在 0.2-2um可选，最常用的是 2um 的；当没有接色谱柱时都有很高的压力时清 洗或更换，清洗的办法也是先用稀硝酸后用水和乙醇。2、 保护柱对于一套液相色谱系统是必不可少的， 它的主要作用是过滤样品中的

11、可溶性杂质， 和我们前面说过的样品萃取小柱的功能相同， 但是使用起来更 方便，对色谱柱的保护更好； 选择保护柱时一定要选择和自己所使用的色谱 柱填料相同粒径，我们不能用 10um粒径的保护柱保护 5um 粒径的色谱柱， 这样起到的保护作用并不明显； 现在常用的保护柱都是柱芯式的， 很少有自 己添装的了，当我们发现出来的色谱峰分叉或者柱效明显下降时就要更换保 护柱芯了。色谱柱是液相色谱分析的心脏， 选择一种比较好价格又便宜的色谱柱很重要， 下 午奥泰公司的廖志明先生有关于这方面的专题报告， 我在这里就不做介绍了。 不 过我在这里要讲一下液相色谱柱的保养和再生：一般的情况下： 为了方便工作色谱柱都

12、保存在要分析所用方法的流动相中， 这个 流动相是没有缓冲盐的， 如果你的流动相里有缓冲盐， 可以另外配置一份没有缓 冲盐的流动相， 专门用来冲洗色谱柱， 如果你两三天不用， 那么反相柱应该先用 95%的水将色谱柱中的缓冲盐冲洗干净 （至少要 20 倍柱体积），最好不要用纯水， 反相柱最好保存在乙腈的条件下（甲醇也可以） ，正相柱最好保存在正己烷和异 丙醇（ 95：5）的条件下，最好每月冲洗一到两次。 色谱柱当用到一定的时间后会出现柱效下降，可以做一次简单的再生： 1 分析样品时用纯有机流动相的硅胶柱： 20正己烷-20二氯甲烷-20乙腈-15二氯甲烷 -10正己烷 氰基、氨基柱： 20二氯甲烷

13、-20 异丙醇-20甲醇-15 异丙醇-10二氯甲烷 反相柱（ C2、C4、C8、C18、苯基）：20乙腈-20二氯甲烷 -20正己烷-15二氯甲烷-10乙腈2 水或水 /有机混合流动相时：反相柱（ C2、C4、C8、C18、苯基）：A：常用方法： 20 去除缓冲盐的流动相 -20 乙腈-20 二氯甲烷-15 乙腈-10去除缓 冲盐的流动相B：生物/蛋白类： 20 去除缓冲盐的流动相 -运行一个梯度洗脱（ A：0.1%的三氟 乙酸水溶液 B：0.1%三氟乙酸在 1：2的乙腈比异丙醇溶液） 30分钟 内 B 由 25%- 3 -7 到 100%-0.1 当量浓度的稀硝酸：异丙醇（ 1： 4）运行

14、 40 倍柱体积（不能用于 GPC柱） -10倍 1：4的水/异丙醇离子交换柱：20缓冲盐溶液 -20HPLC 水-20倍 0.1MEDTA-20HPLC 水-20乙腈-20水 氰基柱： 20HPLC 水-20 乙腈-20二氯甲烷 -15 乙腈-10水 氨基：流动相 -水-流动相由于流动相的黏度直接影响色谱柱的压力和寿命， 也直接影响着我们分离样品的 保留时间， 而流动相的黏度又直接受温度的影响， 所以在色谱分析中色谱柱恒温 系统也是非常重要的。至于柱温箱的选择就在各单位自己的选择了， 一般进口柱温箱精密度教高， 但价 格较贵，国产柱温箱的恒温效果稍差，但是除了示差外基本都能满足工作。色谱柱把

15、样品经过分离后进入检测器检测，我们最常用的检测器是紫外检测器， 示差检测器（由于它灵敏度与教多的限制正在逐步被蒸发光散射检测器所取代） ， 荧光检测器，蒸发光散射检测器。我们这里只是讲一下 UV 检测器 紫外检测器是一种比较成熟的技术了， 平时不会有什么问题， 而且有问题时各厂 家都是要求不能动设备的光路系统， 那剩下的问题就是更换氘灯和清洗检测池了 各家仪器都有自己氘灯模式，但是并不是所有的仪器生产厂家都自己生产氘灯， 因为世界上只有 4 家大的生产商，现在氘灯的寿命一般规定都在 1000小时以上， 用 2000-3000 小时的氘灯也很多， 但是当氘灯在其使用寿命的 70%后能量会迅速 下

16、降，造成的后果就是检测样品的重现性稍差， 有的时候氘灯会不能点亮， 或者 基线噪音很高，漂移很大。这时候就需要换灯了。流通池也就是检测池， 有时候我们的样品在检测池上有吸附， 各家仪器都有自己 的检测指标，以奥泰的为例就是参比池能量：样品池能量在 254nm 纯甲醇的条 件下比值应在 1.2*2.0 之间，如果比值过大说明样品池脏了，如果比值过小说明 氘灯的能量已经不足了。样品池的清洗：主要是将色谱柱和保护柱取下，将进样阀和检测器直接连接用 6 个当量的稀硝酸冲洗 40 分钟，然后用纯水冲 30 分钟再用甲醇冲 20分钟，如果 不能冲洗干净，可放到超声波清洗器中超声 20 分钟。再不行就只有换

17、了，一般 不会出现这种情况。 再有就是检测池后的费液管不能堵塞， 因为检测池的最高承 受压力只有 200-300PSI，如果压力过高就会将检测池冲爆，到时就只有更换。溶剂回收、样品回收装置样品经过 HPLC 色谱柱的分离和检测器的检验后， 由检测器流出。 这时候有人需 要收集被分离后的样品， 有人为了节省流动相需要收集不含样品的流动相， 这时 候就需要样品收集装置和溶剂回收装置。 因为各家的样品回收和流动相回收的装 置不尽相同， 这里不做详细介绍， 但是工作原理都是利用和检测器联系互动， 用 电磁比例阀控制样品和流动相的走向。整套的液相色谱系统大致都是这个样子， 只是各家仪器的控制系统不同，

18、配置不 同，常用的消耗品和日常维护也比较简单。 下面我在讲一下怎样从我们得到的色 谱图来分析问题出在什么地方。怎样解决。- 4 -7问题一，色谱峰不好1宽峰（1）样品的浓度过高（稀释）（2）检测器流通池体积过大（通常用于分析用的流通池是 9ul 的，不能将制 备或半制备的检测池用于分析检测 -这个问题通常不会出现）（ 3）柱外死体积太大（重新检查所有的接头有没有到位） 换比较合适的管子； 通常由泵到进样阀是采用 0.02 英寸的不锈钢管，由进样阀到色谱柱采 用 0.01 英寸的管子，由色谱柱到检测器用 0.01 英寸或更细的管子。（ 4）流动相的黏度过大 （通常由温度过低引起， 升高柱温箱的温

19、度， 或采用 黏度较小的流动相）（5）样品在进样阀中扩散（通常是进样的前后打进了气泡造成的）（6）柱效差（更换新色谱柱）（7）保留时间过长（在满足分离度的前提下，提高流动相的洗脱能力）（ 8）数据处理系统的采用频率过低 （这在一些国产的工作站中比较普遍， 虽 然它们有的在操作系统中显示几十个赫兹的采样频率， 但实际上它硬件 的数模转换速度只有 0.5Hz，所以大部分用国产软件所得到的谱图在国 际上并不被认可）（9）检测器还没有平衡（ 10） 部分峰重叠（有可能前一针的峰和后一针的峰重叠了） 2鬼峰（也就是突然多出来的峰）（ 1）色谱柱受污染 （前边的样品峰被正在使用的流动相冲下来了， 只有重新

20、 冲洗柱子。（ 2）离子队试剂和进的样品在色谱柱中没有平衡 （用流动相配置样品， 或减 少进样量）（3）流动相中缓冲盐对色谱柱的氧化（每天做完实验必须冲洗色谱柱）（4）样品中有未知的干扰组分（根据需要处理）3负峰（1）存在于示差检测器中溶剂吸收能力小于流动相（2）紫外检测器中流动相的紫外吸收小于流动相（3）某种组分的影响（受激发，或紫外吸收小于流动相） 4双峰（肩峰）（ 1） 色谱柱进口筛板堵塞（通常伴随压力上升） ，流动相非均匀进入色谱 柱；保护柱失效 清洗筛板或更换保护柱芯（ 2） 有干扰组分 对样品进行前处理 或更换色谱柱与流动相达到分离（ 3） 也有可能是前一针的峰现在刚出来（ 4）

21、进样量过大，色谱柱超载 -减小进样量（ 5） 色谱柱塌陷有空隙或单向阀有回流 -更换（6） 样品极性与流动相差别太大 -比如流动相是 90 的水，样品是用纯甲 醇配置的，就会出现这种情况。 （建议在有可能的情况下尽量用接近流 动相的试剂来配置样品）（ 7） 样品体积太大通常我们要求进样的体积小于柱体积的 1/6（ 8） 转子密封泄露 更换进样阀转子密封5峰前拖（ 1）色谱柱有塌陷 修补或更换- 5 -7（ 2）进样量过大，色谱柱超载 -减小进样量6峰拖尾（ 1）使用的色谱柱是没有封闭硅羟基的色谱柱 样品与硅烷醇相互作用 （现 在的大多数色谱柱都是端基封闭的）（2）前面的峰没有出来（ 3）使用色

22、谱柱的硅胶纯度不够， 硅胶中有金属存在 （现在因该不会有这种 情况）（4）硅胶基质的色谱柱在高 PH值的流动相下降解 （选用特殊的色谱柱或高 分子基质的色谱柱）（ 5）硅胶柱在高温下降解（通常我们使用硅胶基质的色谱柱温度不超过50度）（6）死体积的存在（检查自进样阀以后的所接头） （7）色谱柱有死体积更换或修补7尖峰（直上直下的峰）（ 1）流动相中有气泡， 气泡进入了检测器。 一种是流动相脱气不彻底， 一种 是检测器有接头的地方泄露， 另外一种是存在于高压二元系统的， 流动 相在压下混合，不会有气泡产生，但是从色谱柱出来之后没有压力了， 就会膨胀出小气泡进入检测器 -所以所有的高压混合装置的检测器出口 都应该有背压调节器（2）色谱柱存放时没有堵死色谱柱两端，内部干涸了。用甲醇冲洗 问题二 泄露1接头松了，或者卡套要更换了 2检测器密封处泄漏 3转子密封坏了 4泵漏夜 -泵密封 问题三 重现性差 1进样器（自动）流路堵塞2检测器衰减设置太高 3前面的样品吸附在进样系统或色谱柱中现在被冲了下来 4定量不准（用大的注射器进更多的