重组质粒的构建与转化2解析

1、实验目的1. 掌握通过酶切与PCF扩增鉴定重组DNA分子的基本方法。2. 学习和掌握PCRT增的基本原理和实验技术。实验原理1酶切法鉴定重组 DNA重组质粒是外源基因通过单酶切（或双酶切）与用相同的（或两种）限制 性核酸内切酶切割的质粒载体连接后获得的，因此在连接处仍保留原限制性核 酸内切酶的识别序列，用该酶（或两种酶）再次切割重组质粒，能把插入片段 切离载体，根据琼脂糖凝胶电泳检测可见有载体片段和插入的外源DNA片段,并可知插入片段的大小。2. PCR扩增法鉴定重组质粒PCF反应可以用来鉴定载体上是否重组了外源 DNA片段，并可估测外源插 入片段的大小，。根据载体多克隆位点上下游基因的序列设

2、计一对PCF引物,两引物之间的距离即是空载体PCF扩增的大小，如果在多克隆位点内插入外源 DNA片段，就会改变PCF扩增产物的大小，扩增产物的大小减去两引物之间的 距离即是插入片段的长度，也可以直接基于外源 DNAW端的序列设计一对引 物，分分别以空载体和重组质粒为模板进行 PCF反应，只有重组质粒能扩增出 一定大小的产物，贝够产物的大小即是插入片段的大小。3. PCR扩增原理具有模板DNA寡核苷酸引物，M0+, 4种脱氧核糖核苷酸（dNTPS、 DNA聚合酶和缓冲液所有组分的PCF反应体系中，在模板变性，引物退火后，模拟体内半保留复制过程一一即在 DNA聚合酶的作用下，以变性单链为模板， 依

3、据碱基互补配对原理，在引物的 3端加入合适的核苷酸分子，不断延伸直 至完成新DNA的合成。新合成的DNA分子也可以作为模板，参与后续的扩增反 应，使目的分子呈指数增长。因此，变性、退火和延伸循环反复2530次后，即可以从少量的模板DNA中扩增出大量的目的产物。PCRT增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例， 在第一个反应周期中，以两条互补的 DNA为模板，引物是从3端开始延伸， 其5端是固定的，3端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片

4、段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段 3端被固定了止点，保证了新片段的起点和 止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR勺反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯 DNA 片段供分析与检测用。主要仪器和试剂1仪器和材料微量移液器，吸头和吸头盒，37C恒温水浴锅，PCFT增仪，高速离心机，微波炉，电泳槽，电泳仪，Eppendof管（1.5mL，0.2mL），

5、制胶槽，梳子，锥形瓶，量筒，冰盒，手套，记号笔，凝胶成像检测仪等2.实验试剂酶切检测：重蒸水，限制性核酸内切酶 Hind IH（ 15U/卩L），限制性核酸内切酶缓冲液（10X M Buffer ），Re-pUC19等。PCF检测：TaqDNA聚合酶（5U/ 卩 L）, PCR反应缓冲液（10X Buffer ）,dNTP昆合物，重蒸水，M13F(10y M M13R(1Qx M Re-pUC19(约 10ng/ 卩 L)等。琼脂糖凝胶电泳试剂：6X上样缓冲液，TAE缓冲液，琼脂糖，DNA标准Marker (入 DNA/HindM),DL2000 Plus，溴化乙锭EB等。实验步骤（一）重组质

6、粒的酶切验证Re-pUC192.01.对于电泳显示插入片段在2.0kb以上的重组质粒，米用以下酶切体系进行验证：大片段或咼产成分量(卩L)ddH O6.210xM1.0BufferHind 川0.8共计10.0轻弹混匀后， 短暂离心，37C保温2hr后，保 存于-20C,备电泳检测。表一：大片段酶切反应体系2. 对于电泳显示插入片段在2.0kb以下的重组质粒，不推荐使用酶切法进行验 证，如若使用，则是适当更改反应体系：小片段或低产成分量11.0-ddH O10xMBufferRe-pUC19Hind 川共计9.02.06.08.01.020.0轻弹混匀后， 短暂离 心，37C保温2hr后，保

7、存于-20C,备电泳检测。表二：小片段酶切反应体系3. 利用空载体片段和目的基因片段作为对照，对酶切后重组质粒的片段进行琼脂糖凝胶电泳检测，从酶切后的片段的数目及大小上进行确认：大片段：10.0卩L酶切产物+2.0卩L 6 x Loading Bf，混匀一取6.0卩L点 样，电泳，染色，检测。 小片段：20.0卩L酶切产物+3.0卩L 10 x Loading Bf，混匀取12.0-13.0卩L 点样，电泳，染色，检测。（二）重组质粒的 PCR验证/PCR扩增目的基因对于电泳电视插入片段在2.0kb以下的重组质粒，推荐采用 PCR1行验证。1. 以提取的质粒为模板，加入合成的引物，进行PCR反

8、应，其反应体系如下：小片段或低成分产量（大体系，ddH2O13.610x Buffer2.0dNTP1(2.5mmol each ).60M13F(10D M.80M13R(10D M.8模板（约110ng/L).0Taq酶0.2总体积20.0轻弹混 匀后，短暂离心，进行PCRPCR后保存于20C,备电泳检测。备注：取1卩L质粒+49卩LddH20（即稀释50X），然后从中取1卩L作为PCR勺模板。表三：PCR反应体系2. PCR反应程序：94C，变性3min :94C，变性30s :58C，复性30s ;72C，延伸1min,转，循环29次；72C，延伸lO.Omin ; 4C, 保存。3.

9、 PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳检测（1 %的琼脂糖凝胶）PCR反应结束，用DL2000 plus作对照，电泳，确定PCR产物的大小：20.0卩L PCR产物+3.0卩L 10 x Loading Bf，混匀取5.0卩L点样，电泳， 染色，检测。4. 产物长度预测PCRT增产物的长度（bp）二载体pUC19两引物间序列的长度（150bp+插入 片段的长度。实验结果（一）重组质粒的酶切验证电泳结果:2246812入/Hind样川品(Ma r k e rJD1R1/Hind出JD1R2/Hind出JD2R1/Hind出PUC19/Hind出入/Hin d 出 (M a r k e r样量6(0l6

10、6 60 0 0表四：从左至右各泳道的样品及样量（酶切）1w图一：重组质粒的酶切验证电泳图第2和第22泳道为入/Hind川（Marker，起定位作用。因为实验组比较多，横向距 离比较长，所以在实验组两侧都设有入/Hind IH （Marker，防止因为电泳时凝胶摆放不正等因素，而导致的条带位置判断失误。第21泳道为pUC19/HindH,起对照作用。每个实验组质粒在酶切后都应该含有一 条线性pUC19段，故设置pUC19/HindH为对照组，有助于判断酶切后的线性 pUC19段所对应位置。除第2,第22和第21条带外，其他各泳道均为各小组样品的电泳情况。我们小组 的实验结果在第13-16泳道，

11、其中第13，15泳道为试剂盒抽提出来的两组质粒的 电泳情况，第14，16泳道为两种质粒对应的Hind H酶切产物电泳情况。下面将分 别就我们组每种质粒以及其酶切产物的电泳条带进行分析：第13泳道对应抽提的1号质粒（编号：JD-4-1 ）。其中最亮的主条带对应超螺 旋构象的质粒，在主条带上方由上至下分别为开环和线性构象的质粒。通过前期的 电泳结果初步判断该质粒为pUC19空载体质粒，与其他各组超螺旋质粒对比，其超 螺旋构象泳动的距离最长，其条带位于最靠下的位置。第14泳道为JD-4-1质粒的酶切产物，泳道中主条带与第 21泳道的pUC19/HindH条带平齐，且位于 marker 中从上至下第4

12、条带（4361bp）和第5条带（2322bp）对应位置之间，说明为线性 PUC19片段。同时，由于酶切没有进行完全，在主条带下方有一条与第13泳道超螺旋质粒平齐的微弱条带。酶切结果再一次证明，JD-4-1质粒为空载体质粒。第15泳道对应抽提的2号质粒（编号：JD-4-2 ）。其中最亮的主条带对应超螺旋 构象的质粒，在主条带上方由上至下分别为开环和线性构象的质粒。通过前期电泳结果初步判断该质粒为连接125bp入/Hind H外源片段的重组质粒，其超螺旋构象 的涌动距离仅次于空载体质粒，在 Marker中从上至下第6条带（2027bp）对应位 置偏下。第16泳道为JD-4-2质粒的酶切产物，泳道中

13、共有 3个条带，至上而下分别对应：与第21泳道pUC19/HindH条带平齐的线性pUC19片段，与第15泳道超 螺旋构象质粒平齐的未完全酶切的超螺旋构象重组质粒，与 入/Hind H（ Marker）中从上至下第八条带（125bp）平齐的外源片段。酶切结果再一次证实，JD-4-2质粒为插入125bp入/Hind川外源片段的重组质粒。（二）重组质粒的 PCR验证电泳结果泳道1 ,678910111213 ,16DL2000r 1 一JD-3JD-3 JD-3JD-3JD-3JD-4JD-4JD-3样品R2R2564Puc19H2O564bpR1R2DL2000PlusPlus样量（卩l）5.0

14、5.05.05.05.05.05.05.0表五：从左至右各泳道的样品及样量（PCR图三：重组质粒的PCR验证电泳图第1和第18泳道为DL2000 Plus（Marker，起定位作用。第9、10、11泳 道分别为：以pUC19为模板的PCR产物，以水作空白对照的PCR产物，以插入 564bp入/Hi ndM外源片段的重组质粒为模板的 PCR产物。其余泳道为各小组 PCF产物电泳条带。第12、13泳道为以我们组抽提的质粒（JD-4-1，JD-4- 2）为模板的PCR产物电泳条带.第1和第18泳道为DL2000 Plus （Marker，起定位作用。因为实验组比 较多，横向距离比较长，所以在实验组两

15、侧都设有DL2000 Plus，防止因为电泳时凝胶摆放不正等因素导致条带位置判断失误。第9泳道为以pUC19为模板的PCR产物，和第1泳道对比，看出以pUC19 （空载体）为模板PCR反应产物条带对应于第1泳道自上而下第7条带 （250bp）和第8条带（100bp）之间，说明其大小介于100250bp之间，符合 预期实验结果，因为理论上，空载体 PCR产物大小为150bp。第10泳道为，以水作空白对照的PCF产物。在PCF反应体系中没有加模 板，理论上电泳时不应该出现条带，但是从图中看出，第10泳道有3条带，从上至下第一条带对应大小在 500bp-750bp之间，第二条带与Marker中 25

16、0bp带基本持平，第三条带与100bp带位置基本持平，与预期结果不符，分 析如下：可能是提供的ddH2O被污染，因为各小组共用一瓶重蒸水，如果取水时未更换用过的枪头，就会导致重蒸水中混入部分重组质粒。如第一条带位置与第11泳道中条带位置较接近；第二条带位 置与第13泳道中条带位置基本持平。M13F,M13R两引物形成二聚体，并以此二聚体为模板进行PCR反应，其大小应为47+48=95bp,对应于第三条带；物大量与模板结合，引物之间很难形成二聚体或形成的量很少。同时，如果水被 污染，加入模板后，模板的量远远大于掺杂的质粒的量，所以主反应仍然对模板 的PCR反应，对杂质粒PCR反应很少，几乎为零。

17、第11泳道为以插入564bp入/Hind川外源片段的重组质粒为模板的 PCR产物，与第 18泳道相比，其条带对应于第18泳道自上而下第5条带(750bp)和第6条带(500bp)之间，且靠近第5条带，说明其大小介于500750bp之间，这也符合预 期结果，因为理论上，插入 564bp大小入DNA/Hin d川片段的重组质粒PCR产物 大小为 564+150=714bp=第12泳道为以JD-4-1为模板的PCR产物。理论上，因为JD-4-1为pUC19空载体质粒，故其电泳条带应与第9泳道pUC19对照组电泳条带平齐。但是，从电泳图 中可以看出，第12泳道有3条微弱条带，且3条带分别与第10泳道空

18、白对照组中 的3条带相对应。说明在配制PCR体系时，可能忘记加JD-4-1模板或者错误的把 水当做模板。第13泳道为以JD-4-2为模板的PCR产物。泳道中只有一条带，大小为 250bp左 右。由于JD-4-2为插入了 125bp入/Hind川外源片段的重组质粒，其 PCR产物大小 理论上为125+150=275bp,与实际电泳结果相符。注意事项1. 实验中加样后及时更换吸头，以避免试剂的污染。2. PCR反应高度灵敏，应设法避免污染，如戴一次性手套操作，使用一次性PCR管和吸头，反应加样区与DNA模板制备区及PCR电泳检测区分开等。3. 将除了 TaqDNA聚合酶的其他试剂从-20C的冰箱中取出，室温融化离心后置于 冰浴中待用。TaqDNA聚合酶用时从-20C的冰箱中