重组质粒快速抽提的方法解析

1、重组质粒DNA的小量快速制备方法（一） Lysis Trition 发抽提方法1. 在LB肉汤中（含适量抗生素）接种适量的菌种，37C振荡培养过夜。2. 将培养物倒入离心管，20002500rpm离心10分钟，尽弃上清夜，收集沉淀。3. 加入Lysis Sucrose 液250ul,旋涡器上振荡使沉淀分散均匀，冰浴 10分钟。4. 加入Lysozyme液（10mg/ml25ul,旋涡器上振荡混匀，冰浴 5分钟。5. 加入0.25 M EDTA液25ul，旋涡器上振荡振荡混匀，冰浴 5分钟。6.加入Lysis Trition液125ul,轻摇混匀，室温下作用215分钟，待裂解后，13, 000r

2、pm, 4 C离心15分钟，取上清。7.在上清液中加入饱和酚150ul，来回颠倒数分钟，12，000rpm,4C离心5分钟，取上清液。8.在上清液中加入饱和酚、氯仿各 150ul，来回颠倒数分钟，12, 000rpm,4 C离心5分钟，取上清液。9.在上清液中加入氯仿150ul，来回颠倒数分钟，12，000rpm,4C离心5分钟，取 上清液。10. 在上清液中加入2倍量的异丙醇或95%勺乙醇（-20C预冷），作用一定时间后，12，000rpm, 4 C离心2025分钟，弃上清液。11.干燥沉淀。12.加入1ml70%S醇，来回颠倒数次，12，000rpm,4C离心5分钟，弃上清液13.真空干燥

3、沉淀。加入TE（ph8.0 ） 2050ul溶解沉淀，4C或-20C保存。附：小量快速抽提中的注意事项：1. TritonX-100 溶解细菌的脂质层，在细菌脂质上打孔呈蜂窝状。EDTA络合DNAS的络合剂。蔗糖 提供了酶作用的环境。溶菌酶用以溶解细菌的膜。2. 溶解时，若溶解过头用酚/氯仿进行纯化DNA寸不易抽出蛋白质。大量制 备时常用碱裂解法。3. 酚使蛋白质变性，用氯仿萃取蛋白质，每次吸取上清时要注意不要吸入蛋 白质、酚、氯仿，否则会影酶切效果。4. 本实验中用的氯仿系氯仿与异戊醇的混合物（24: 1）。5. 最后进行干燥，可以用自然干燥，也可抽滤干燥（约 30分钟）但必须充 分干燥，否

4、则不易于被TE所溶解和酶切。6. 实验前准备中将转染了质粒的大肠杆菌接种于LB肉汤时，铂耳不宜太烫，每次最后接种环在试管壁轻轻敲打数次，以保证有效接种，摇振培养时试管的倾斜率、水位、温度都要 作适当的选择，否则不宜培养。（二） 碱裂解法1.将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为1.5ml并且通风良好（不盖紧）的试管 中，然后接种入一单个菌落，于 37 C振荡培养过夜。2.将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4C以12, OOOrmp离心30秒，将剩余的培养物贮存于4C。3.吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。备注：除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓 抽吸，并

5、用吸头接触液面，当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然 后继续用吸头通过抽真空去附于管壁上的液滴。4. 将细菌沉淀重悬于100ul用冰预冷的溶液1中，剧烈振荡。溶液 1: 50mMol/L葡萄糖,25mM Tris.HCI（pH8.0,10mM EDTA（pH8.0。可以成 批地配制，每瓶约100ml，在10磅高压灭菌15分钟，贮存于4C。须使细菌沉淀 在溶液1中完全分散，将两个微量离心管的底部互相接触同时进行振荡，可使沉淀 迅速分散。5. 加入200ul新配制的溶液2,盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容 物，应确保离心管的整个内表面与溶液 2接触，不要振荡，将其置于冰上。溶液

6、2: 0.2Mol/L NaOH（临用时用10Mol/L的贮存液现配1%SDS6. 加150ul用冰预冷的溶液3,（溶液3: 5Mol/L乙酸钾60ml,冰醋酸11.5ml,水28.5ml配成溶液对K+ 3M,对乙酸根是5Mol）盖紧管口，将管倒置后温 和地振荡10秒钟使溶液3在粘稠的细菌裂解物中分散均匀之后将管倒置于冰上35分钟。7. 用微型离心机4C 12, 000rmp,离心5分钟，将上清转移到另一离心管中。8. 可做可不做，加等量酚：氯仿，振荡混匀，用微量离心机于4C 12,000rmp,离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。9用2倍体积的乙醇于室温沉淀DNA振荡混合，于室温放置2分钟

7、。10. 用微量离心机4C, 12, 000rmp,离心5分钟。11. 小心吸去上清，？ ? 置于纸巾上，以使所有液体流出，再将吸附于 管壁的液滴除尽。12. 用1ml70%乙醇于4C洗涤双链DNA沉淀，按步骤8所示方法去掉上清， 在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。13. 用50ul含无DNA酶的胰RNA#（ 20ug/ml）的TE重新溶解核酸，振荡， 贮存于-20C。（三）煮沸法制备质粒DNA试剂：TETS容液：Tris-Hcl 10mM , TritonX-100 0.5%, EDTA 50mM蔗糖溶菌酶溶液:Tris-Hcl 10Mm (Ph8.0),溶菌酶 10mg/ml。8%Rnase

8、-A溶液：用前 80C处理 10分钟，Tris-Hcl 10mM , EDTA 1m(Ph8.0),Rnase-A 50ug/ml。方法：1.将没一个菌种接种于5mlLB肉汤中，并加入合适的抗生素（根据重组 质粒的抗性）于37C振荡培养过夜。2.取1.5ml上述液至Eppendof管中（剩余4C保存），8000rpm离心5分钟，弃上清。3.沉淀重悬于0.35mlTETS溶液中，加入25ul新配制的溶菌，混匀3秒钟以后 将Eppendof管放入沸水40秒。4.1800rmp离心10分钟，取上清至 Eppendof管中，力卩420ul异丙醇和40ul 的醋酸钠溶液，混匀并于乙醇干冰浴中15分钟，4C, 18