魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展[高级教育]

1、魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展 报告内容报告内容 v 魏氏梭菌概述魏氏梭菌概述 v魏氏梭菌毒素研究魏氏梭菌毒素研究 综述 分型及其依据 魏氏梭菌产生的毒素 四种主要毒素研究进展 纯化及鉴定 细菌毒力 综述综述 v革兰氏阳性有荚膜不运动的厌氧大杆菌，芽孢椭革兰氏阳性有荚膜不运动的厌氧大杆菌，芽孢椭 圆形圆形,位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌 体，在一般培养时不易形成芽胞，在无糖培养基体，在一般培养时不易形成芽胞，在无糖培养基 中有利于形成芽胞（中有利于形成芽胞（菌体形态菌体形态） v广泛分布于自然界，同时也是肠道中的常见菌

2、之广泛分布于自然界，同时也是肠道中的常见菌之 一，在一定条件下，可引起各种严重疾病一，在一定条件下，可引起各种严重疾病 v发病急、死亡快，因此对于本病的防制主要用疫发病急、死亡快，因此对于本病的防制主要用疫 苗进行免疫预防苗进行免疫预防 v危害：猝死症，家禽坏死性肠炎，人食物中毒及危害：猝死症，家禽坏死性肠炎，人食物中毒及 气性坏疽气性坏疽 ；家畜肠毒血症、坏死性肠炎，痢疾；家畜肠毒血症、坏死性肠炎，痢疾 培养特性培养特性 v本菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度的要本菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度的要 求并不太严，求并不太严，2%10%的的CO2条件下，生长条件下，生长 更好更好 v在普通培养基上

3、能生长，若加葡萄糖，血在普通培养基上能生长，若加葡萄糖，血 液，则生长更好液，则生长更好 v生长适宜温度为生长适宜温度为37-47，多认为，多认为43- 47为最宜温度，在适宜条件下增代时间为最宜温度，在适宜条件下增代时间 仅仅8min 培养特性培养特性 v血平板血平板：双层溶血环：双层溶血环 内环完全溶血内环完全溶血-毒素毒素 外环不完全溶血外环不完全溶血- - 毒素毒素 v蛋黄琼脂平板蛋黄琼脂平板：NaglerNagler反应反应 v庖肉培养基：数小时即可见到生长，产生庖肉培养基：数小时即可见到生长，产生 大量气体，肉渣或肉块变为略带粉色，但大量气体，肉渣或肉块变为略带粉色，但 不被消化不

4、被消化 v 牛牛乳乳培养基培养基：“汹涌发酵汹涌发酵”（stormy fermentation） 分型及其依据分型及其依据 v根据此菌产生外毒素的种类，可将其分为根据此菌产生外毒素的种类，可将其分为A A、B B、 C C、D D和和E 5E 5个型个型 vA A型菌：型菌： vB B型菌：型菌： vC C型菌：型菌： vD D型菌：型菌： vE E型：型： 魏氏梭菌与相应疾病魏氏梭菌与相应疾病 v其中，其中，A型菌主要引起人的气性坏疽和食物中毒，型菌主要引起人的气性坏疽和食物中毒， 也可引起动物的气性坏疽，牛、绵羊、家兔肠毒也可引起动物的气性坏疽，牛、绵羊、家兔肠毒 血症血症 vB型菌主要引

5、起羔羊痢疾；型菌主要引起羔羊痢疾； vC型菌主要是牛、猪肠毒血症、羊猝狙型菌主要是牛、猪肠毒血症、羊猝狙 vD型菌引起羔羊、绵羊、山羊、牛以及灰鼠的肠型菌引起羔羊、绵羊、山羊、牛以及灰鼠的肠 毒血症；毒血症； vE型菌可致犊牛、羔羊肠毒血症，但很少发生。型菌可致犊牛、羔羊肠毒血症，但很少发生。 气性坏疽发病急剧，后果严重，需要尽早准确的做出微生气性坏疽发病急剧，后果严重，需要尽早准确的做出微生 物学诊断，争取早期治疗：物学诊断，争取早期治疗： 标本标本 镜检：可发现镜检：可发现G 大杆菌，并伴有其他杂菌和少量形态 大杆菌，并伴有其他杂菌和少量形态 不规则的白细胞。不规则的白细胞。 培养基培养基

6、 厌氧培养厌氧培养 进一步鉴定进一步鉴定: : 牛乳培养基牛乳培养基 生化反应：生化反应：TSCTSC 动物实验：泡沫肝实验动物实验：泡沫肝实验 分离诊断分离诊断 纯化纯化 液体培养基 65-70C半小时 43温箱培养 3-4小时 连续传代 镜检 TSC.石蕊牛奶 血平板 ：病原菌有突破宿主皮肤、黏膜：病原菌有突破宿主皮肤、黏膜 生理屏障等生理屏障等 免疫防御机制，进免疫防御机制，进 入体内定居、繁殖和扩散的能入体内定居、繁殖和扩散的能 力，包括力，包括荚膜、粘附素和侵袭荚膜、粘附素和侵袭 性物质。性物质。 ：含有损害宿主组织、器官并引起：含有损害宿主组织、器官并引起 生理功能紊乱的大分子成分

7、。生理功能紊乱的大分子成分。 荚膜、微荚膜。荚膜、微荚膜。 黏附素黏附素：细菌表面的蛋白质。：细菌表面的蛋白质。 菌毛分泌物菌毛分泌物 细菌的表面组分：如磷壁酸。细菌的表面组分：如磷壁酸。 2 2、侵袭性物质：、侵袭性物质：协助病菌抗吞噬或向四周扩散。协助病菌抗吞噬或向四周扩散。 如致病性葡萄球菌凝固酶、如致病性葡萄球菌凝固酶、A A群链球菌透明质酸酶、群链球菌透明质酸酶、 链激酶等从而有利于细菌在组织中扩散。链激酶等从而有利于细菌在组织中扩散。 侵袭力侵袭力 1、菌体的表面结构、菌体的表面结构 细菌在生长繁殖中产生和释放的毒细菌在生长繁殖中产生和释放的毒 性成分，可直接或间接损伤宿主细胞、组

8、性成分，可直接或间接损伤宿主细胞、组 织和器官，干扰其生理功能。织和器官，干扰其生理功能。 1.1.外毒素外毒素 2.2.内毒素内毒素 （二）毒素（二）毒素 内毒素毒性作用内毒素毒性作用 区别要点区别要点外毒素外毒素内毒素内毒素 存在部位存在部位由活的细菌释放至细菌体外由活的细菌释放至细菌体外 为细菌细胞壁结构成份，菌体为细菌细胞壁结构成份，菌体 崩解后释出崩解后释出 细菌种类细菌种类革兰阳性菌多见革兰阳性菌多见革兰阴性菌多见革兰阴性菌多见 化学组成化学组成蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖 稳定性稳定性606080 30 min80 30 min破坏破坏耐热，耐热，160 2h160 2h4 h4 h

9、破坏破坏 毒性作用毒性作用 强，有选择毒害作用，引起特殊临强，有选择毒害作用，引起特殊临 床表现床表现 稍弱，各种细菌内毒素的毒性稍弱，各种细菌内毒素的毒性 作用大致相同。作用大致相同。 抗原性抗原性 强，可刺激机体产生高效价的抗毒强，可刺激机体产生高效价的抗毒 素。经甲醛脱毒成为类毒素，仍有素。经甲醛脱毒成为类毒素，仍有 较强的抗原性，可用于人工自动免较强的抗原性，可用于人工自动免 疫疫 刺激机体对多糖成份产生抗体，刺激机体对多糖成份产生抗体， 不形成抗毒素，不能经甲醛处不形成抗毒素，不能经甲醛处 理成为类毒素理成为类毒素 14经验课堂 疫苗现状疫苗现状 v梭菌类的疫苗有单价苗和多联苗，单价

10、疫苗在实梭菌类的疫苗有单价苗和多联苗，单价疫苗在实 际应用中难以取得很好的效果，原因是致病的梭际应用中难以取得很好的效果，原因是致病的梭 菌种类较多，而且有的是混合感染，单价苗往往菌种类较多，而且有的是混合感染，单价苗往往 是顾此失彼，不能有效地预防疾病。是顾此失彼，不能有效地预防疾病。 v国外相继出现了包括产气荚膜梭菌的四联、五联、国外相继出现了包括产气荚膜梭菌的四联、五联、 七联和八联苗梭菌苗，不仅把梭菌苗联合起来，七联和八联苗梭菌苗，不仅把梭菌苗联合起来， 而且还把所梭菌苗与需氧菌苗而且还把所梭菌苗与需氧菌苗(如巴氏杆菌苗、沙如巴氏杆菌苗、沙 门氏杆菌苗门氏杆菌苗)联合起来，甚至与病毒苗

11、联合起来，甚至与病毒苗(如羊痘疫如羊痘疫 苗苗)联合起来进行防疫。联合起来进行防疫。 疫苗现状疫苗现状 v国内首先出现的是羔羊痢疾，肠毒血症等单价苗，国内首先出现的是羔羊痢疾，肠毒血症等单价苗， 继之出现了羊猝狙、快疫二联苗，羊黑疫、快疫继之出现了羊猝狙、快疫二联苗，羊黑疫、快疫 二联苗，快疫、羔羊痢疾、肠毒血症三联苗。文二联苗，快疫、羔羊痢疾、肠毒血症三联苗。文 希喆等希喆等(1978)研制成功了快疫、羔羊痢疾、碎研制成功了快疫、羔羊痢疾、碎 狙、肠毒血症、黑疫五联苗。纪金春等狙、肠毒血症、黑疫五联苗。纪金春等(1978) 研制成功了快疫、羔羊痢疾、猝狙、肠毒血症、研制成功了快疫、羔羊痢疾、

12、猝狙、肠毒血症、 黑疫和肉毒中毒六联苗。黑疫和肉毒中毒六联苗。 疫苗现状疫苗现状 v 上世纪上世纪70年代到年代到80年代，中监所的文希喆、王泰健、屠年代，中监所的文希喆、王泰健、屠 伟英等科研人员，在国际上率先开创了梭菌多联干粉苗的伟英等科研人员，在国际上率先开创了梭菌多联干粉苗的 研究，取得满意效果，保存期长，使用方便，可以随意搭研究，取得满意效果，保存期长，使用方便，可以随意搭 配，疫苗的保护期也得到的延长，基本克服了液体苗的缺配，疫苗的保护期也得到的延长，基本克服了液体苗的缺 陷。陷。 v 效力检验：多联苗所含的成份越多，需要的动物也越多，效力检验：多联苗所含的成份越多，需要的动物也越

13、多， 以致于达到不便检验的程度，严重阻碍了多联苗的发展，以致于达到不便检验的程度，严重阻碍了多联苗的发展， v 采用免疫动物测定血清中和效价的方法，来评价梭菌苗的采用免疫动物测定血清中和效价的方法，来评价梭菌苗的 效力。其方法是用梭菌苗免疫动物两次后，用国际单位效力。其方法是用梭菌苗免疫动物两次后，用国际单位 (I.U.)衡量血清的中和效价，检验每批疫苗所需试验动物衡量血清的中和效价，检验每批疫苗所需试验动物 为为8-12只。只。 v免疫效果与制苗菌液中毒素毒力正相关免疫效果与制苗菌液中毒素毒力正相关 v抗原含量过大会产生严重局部反应，会导抗原含量过大会产生严重局部反应，会导 致安全性检验不合

14、格致安全性检验不合格 主要毒素主要毒素 毒素毒素 v各型产气荚膜梭菌均产生各型产气荚膜梭菌均产生毒素毒素,它是产气荚膜梭它是产气荚膜梭 菌最重要的毒素之一菌最重要的毒素之一,同时又是同时又是A型产气荚膜梭菌型产气荚膜梭菌 的主要毒素的主要毒素 v是是A型产气荚膜梭菌的主要毒素。它具有磷脂酶型产气荚膜梭菌的主要毒素。它具有磷脂酶 C(Phospholipase C,PLC)和鞘磷脂酶和鞘磷脂酶 (Sphin-gomyelinase)两种酶活性两种酶活性,能水解细能水解细 胞膜的主要成分膜磷脂胞膜的主要成分膜磷脂,从而破坏细胞膜结构的完从而破坏细胞膜结构的完 整性整性 理化性质和生物学特性 v毒素

15、是由毒素是由370个氨基酸组成的单链多肽个氨基酸组成的单链多肽,分子量分子量 为为43 ku。它是一种依赖于锌离子的多功能性金。它是一种依赖于锌离子的多功能性金 属酶属酶,具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏 死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性 v当把当把毒素加热至毒素加热至6070时时,就可以使其失去就可以使其失去 活性活性,当进一步加热到当进一步加热到100时时,又可以恢复部分又可以恢复部分 活性活性 毒素基因的克隆与表达毒素基因的克隆与表达 v毒素基因在禽类和哺乳动物中都是保守的毒素基因在禽类和哺乳动物中都

16、是保守的 v毒素的启动子是最强的启动子之一毒素的启动子是最强的启动子之一,可被大肠杆菌可被大肠杆菌 的的RNA聚合酶所识别聚合酶所识别,因而因而毒素在自身启动子下毒素在自身启动子下 不仅可在产气荚膜梭菌本身中高效表达不仅可在产气荚膜梭菌本身中高效表达,也可在大也可在大 肠杆菌中得到高效表达肠杆菌中得到高效表达 v免疫免疫毒素的毒素的C端功能区端功能区,来预防产气荚膜梭菌所来预防产气荚膜梭菌所 致气性坏疽的发生致气性坏疽的发生 刘家森等克隆了刘家森等克隆了毒素基因序列中从第毒素基因序列中从第294个碱基到中止密码子约个碱基到中止密码子约900 bp的核苷酸序列的核苷酸序列,并表达出大小约并表达出

17、大小约3. 8 ku的重组蛋白。重组蛋白完全涵盖的重组蛋白。重组蛋白完全涵盖 了了毒素的羧基末端的蛋白序列并缺失掉了位于氨基末端内对毒素的羧基末端的蛋白序列并缺失掉了位于氨基末端内对毒素起重要作毒素起重要作 用的用的Trp1、His11、Asp56、His68等氨基酸残基等氨基酸残基;表达的重组蛋白含量表达的重组蛋白含量 占到菌体蛋白总量的占到菌体蛋白总量的30%以上以上,且表现出良好的反应原性且表现出良好的反应原性,无毒性现象产生。无毒性现象产生。 毒素毒素 v 产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌毒素是由产气荚膜梭菌毒素是由产气荚膜梭菌B型和型和C型菌株产型菌株产 生的坏死、致死性毒素生的坏死、致死性

18、毒素,可引起人和动物的坏死性肠炎可引起人和动物的坏死性肠炎, 。 毒素对胰酶敏感，毒素对胰酶敏感，37作用作用30min后即完全失活后即完全失活 v 毒素分为毒素分为1、2毒素毒素,其中其中2毒素是近年确认的由毒素是近年确认的由C型型 产气荚膜梭菌产生的一种新的毒素。产气荚膜梭菌产生的一种新的毒素。2毒素与毒素与1毒素没毒素没 有明显的氨基酸序列的同源性有明显的氨基酸序列的同源性,但具有相似的生物学活性。但具有相似的生物学活性。 而且而且,抗抗2毒素的抗体能识别纯化的毒素的抗体能识别纯化的2毒素毒素,并能与并能与1毒毒 素发生弱反应素发生弱反应,然而然而,抗抗1毒素的抗体只能与毒素的抗体只能与

19、1毒素反应毒素反应, 却不能与却不能与2毒素发生反应毒素发生反应,表明二者的免疫学相关性差表明二者的免疫学相关性差,但但 其机制尚不清楚。其机制尚不清楚。 1毒素毒素 v1毒素是一种强毒素毒素是一种强毒素,具有细胞毒性、致死性。具有细胞毒性、致死性。 纯化的纯化的1毒素分子量为毒素分子量为34 ku左右左右,等电点等电点(PI) 约为约为5. 6。 2毒素毒素 v1997年年Gibert等首先从来自仔猪坏死性肠炎病等首先从来自仔猪坏死性肠炎病 例的培养上清中分离纯化到这种例的培养上清中分离纯化到这种C型产气荚膜梭型产气荚膜梭 菌菌(CWC245)毒素毒素 v2毒素与家畜的梭菌性胃肠道疾病有关毒

20、素与家畜的梭菌性胃肠道疾病有关 v2毒素在猪的胃肠道疾病中发挥了一定作用毒素在猪的胃肠道疾病中发挥了一定作用 v2毒素基因存在于质粒上毒素基因存在于质粒上 v研究刚起步研究刚起步 毒素毒素 v毒素是由毒素是由B型和型和D型产气荚膜梭菌所产生，能引型产气荚膜梭菌所产生，能引 起家畜的致死性肠毒血症起家畜的致死性肠毒血症,又称肉性肾病又称肉性肾病 v毒素的编码基因毒素的编码基因etx位于质粒上位于质粒上,etx基因编码的基因编码的 蛋白蛋白毒素前体在分泌初期是无毒性的毒素前体在分泌初期是无毒性的,通过蛋白通过蛋白 酶去除毒素前体酶去除毒素前体N端的端的13个氨基酸和个氨基酸和C端端22个氨个氨 基

21、酸后成为有活性的成熟肽基酸后成为有活性的成熟肽,成熟肽分子质量为成熟肽分子质量为 32 ku，参与活化的蛋白酶包括产气荚膜梭菌产，参与活化的蛋白酶包括产气荚膜梭菌产 生的生的蛋白酶和消化性蛋白酶如胰蛋白酶、蛋白酶和消化性蛋白酶如胰蛋白酶、胰凝胰凝 乳蛋白酶。乳蛋白酶。 v毒素是致死性毒素毒素是致死性毒素,给小鼠静脉注射纳克级的给小鼠静脉注射纳克级的毒毒 素素,在在30 min内即可引起小鼠死亡内即可引起小鼠死亡,并且其毒力并且其毒力 仅次于肉毒素和破伤风毒素仅次于肉毒素和破伤风毒素 毒素毒素 v这种通过切除这种通过切除N、C末端两段序列且还有菌体自末端两段序列且还有菌体自 身蛋白参与的活化过程

22、较为少见。身蛋白参与的活化过程较为少见。Miyata S等等 证明证明,去除去除C末端氨基酸残基是活化作用的关键末端氨基酸残基是活化作用的关键,而而 且不同的酶切产生的毒素的且不同的酶切产生的毒素的N、C末端及其活性末端及其活性 也不相同。其中以胰蛋白酶加胰凝乳蛋白酶活化也不相同。其中以胰蛋白酶加胰凝乳蛋白酶活化 的毒素毒力最强的毒素毒力最强,而而N末端氨基酸残基去除与否对末端氨基酸残基去除与否对 毒素活性基本没有影响。惟有毒素活性基本没有影响。惟有C末端的切除位点末端的切除位点 对毒素活性对毒素活性,包括在神经突触膜上形成七聚体的能包括在神经突触膜上形成七聚体的能 力有影响。去除力有影响。去除C末端氨基酸残基后的成熟毒素末端氨基酸残基后的成熟毒素 其毒性是毒素前体的其毒性是毒素前体的1 000倍。倍。 毒素毒素 v毒素与宿主细胞表面的作用机制还不是很清楚毒素与宿主细胞表面的作用机制还不是很清楚, 但是现已证明它可以识别小鼠脑细胞和突触小体但是现已证明它可以识别小鼠脑细胞和突触小体 膜上的唾液糖蛋白受体。