非蛋白氮的概述和检测方法

1、非蛋白氮的概述和检测方法1发布时间：2002-11-08非蛋白氮的概述非蛋白氮大致可以分为以下几类，尿素及其衍生物类，如缩二脲、羟甲基尿素等；氨态氮类，如液氨、氨水等；铵类，如硫酸铵、氯化铵等；肽类及其衍生物，包括氨基酸、酰胺、胺等；动物粪便及其它废弃物类。以下是几种常见的 非蛋白氮的介绍：1l双缩脲又称缩二脲，是一种尿素缩合产品，其含氮量在 35上，蛋白质当量为 219。缩二脲难溶于水，一般的定量检验方法为紫红色配位化合物比色法（原理：鱼粉中的双缩脲经抽提后，在酒石酸钠的碱性溶液中与硫酸铜生成紫红色配位化合物，在 550nm 波长下比色从而测出其含量）。12尿素是氮和二氧化碳在高温高压下化合

2、而成。纯尿素的含氮量为 47，折合蛋白当量为 29375。易潮解，易溶于水，一般的定量检验方法有二种：一种为二甲基氨基苯甲醛显色法；另一种为二嗪衍生物显色法。但以上两种方法只能测定游离性尿 素而不能测定其衍生物。13尿素甲醛聚合物是由尿素和甲醛聚合而成，其含氮量为 38.89，折合蛋白当量为 24306。该聚合物难溶于水。14硫酸铵俗称肥田粉，其含氮量为 20左右，折合蛋白当量为 125。硫酸铵的工业品一般为白色或微带黄色的结晶，易溶于水，其分子式为（nh4）2so4。15异亚丁基二脲又名二脲异丁烷，简称 ibdu，为尿素和异丁醛在催化剂的作用下综合反应生成。ibdu 为一种子的白色粉末或颗粒

3、，总含氮量为 3218，折合蛋白当量为 201.13， 吸湿度远低于尿素。以上是比较常见的非蛋白氮物质。随着科技的发展，还会有越来越多的非蛋白氮物质被合成出来，从而使反刍动物所用的非蛋白氮使用广泛，而掺假者很容易将 此物质掺入饲料原料中以提高原料的粗蛋白质。22l非蛋白氮的检验非蛋白氮的定性检验在对原料样品的检测中，一般有定性检测和定量检测。在定性检测中，使用的比较多的为显微镜检，包括直接镜检、分层镜检（用四氯化碳或三氯甲烷分层）、反应剂镜检（用化学物质和样品中的某些物质反应而在显微下区分）、染色镜检等。 在使用的过程中，往往使用一项或多项镜检方法对样品中的物质进行判定。对于非蛋白氮的检验，显

4、微镜检是一种比较有效的方法。在对样品的检测中，一般使用的是生物显微镜，其放大的倍数在 36400 倍之间，为了获得更好的显微效果，可以根据实际情况作出具体的调整。以下是镜检使用过程中的一些技巧：2.1.l直接镜检直接镜检一般所用的倍数比较小，通过对样品不同的物理特征，如颜色、透明度、表面组织、形状等物理性状进行判定。特别的要与典型的样品进行比较，以便能够更好区分样品与杂质的不同。在直接镜检中，用不同的滤光片有时可以起到比较明显的效果。虽然直接镜检比较方便和直观，但有时对于样品中的物质很难区分时， 可以用其它的检验方法。2.1.2分层镜检将样品用四氯化碳进行脱脂和比重分离之后，样品与其它物质的区

5、分会更加容易。对样品中的有机物和无机物分层之后，需在常温下干燥后再进行镜检。非蛋白氮一类的物质与原料的很多外观性质很不一样，通过两者的特异性之间的观察，可以 对样品中是否掺有非蛋白氮一类的物质作出一个大概的判断。213反应剂镜检用反应剂和样品进行反应，非蛋白氮一类的物质的化学性质和样品不一样，通过此种方法可以对样品中的非蛋白氮进行鉴别。经过四氯化碳分层之后，再与反应剂反应是比较好的一种方法。而镜检时在样品中加一滴或数滴浓硫酸，观察样品与浓硫酸反应的情况是一种比较直观的鉴别方法。因为无论动物蛋白还是植物蛋白，其与 浓硫酸的反应速度和产生的现象比较明显。2.1.4染色镜检用染色剂对样品进行染色，使

6、样品中的植物或动物细胞染成不同的颜色，而非蛋白氮一类的物质则和样品的染色后的表现不同，通过此种方法使两者区分开来从 而加以鉴别。以下是比较常用的染色方法：对植物细胞的染色方法：番红固绿染色法。取适量脱胎（视样品脂肪多少而定，可以用四氯化碳，也可以用丙酮，对于脂肪少的也可以不用脱脂）样品于烧杯中，用 1的番红水溶液浸泡 l3h 水洗（去多余的染料）。将样品涂在玻片上，稍晾干。滴加 0l的固绿（溶剂用 95乙醇）。过 15s 后滴加 95的乙醇，冲去多余固绿染料。待乙醇稍挥发后，加甘油液（甘油:水1:1）浸润，加盖玻片。用生物显微镜检查。染色结果：细胞核，木质化细胞壁呈鲜红色，纤维素细胞壁、细胞质

7、呈绿色。因为非蛋白氮没有细胞核、细胞质等结构，所以只要能够较好的掌握染色技巧，其对比效果比较明显。当然，不能从染色效果判断其一定为非蛋白氮。对动物细胞的染色方法：苏木精曙红对染法。取适量的脱脂样品于烧杯中，加入埃利希苏木精染色液浸泡 35min，水洗数次（用 5min 左右）。将样品涂在玻片上，滴加氨水。34s 后立即满加水，洗 l min，稍晾一下，加 0.2曙红水溶液浸润 3min，滴加 95的乙醇，洗去多余曙红染料。再稍晾一下，加甘油浸润，加盖玻片，用生物显微镜观察。其染色的结果为：细胞核呈蓝色，细胞质呈淡红色。 通过此种方法染色，一般能够很容易的区分样品和非蛋白氮一类的物质。为了能够更

8、清晰的在显微镜下区分样品与杂质，也可采用以下方法（对于检验鱼粉一类的物质比较有效）：先用四氯化碳或三氯甲烷对样品分层，除去无机物，必要时再用丙酮进行脱脂，再取一定量的样品置入蒸馏水中，搅拌，除去溶于水的物质，再用 60 目或 80 目的样品筛过滤，将样品放入 5060的烘箱中进行烘干（时间不能过长，以保持样品原来的状态），然后在显微镜下进行检验或再对其进行处理后 镜检。在显微镜检中，只能对非蛋白氮作初步判断。若要进一步的分析判断，还需 进行定量分析检验。2.2非蛋白氮的定量检验在非蛋白氮定量的检测方法中，比较常用的方法是硫酸铜沉淀法和氨基酸测定法。除此之外，本文根据非蛋白氮的组成结构的不同，采

9、用水解蒸馏法对样品中的非蛋白氮进行检验。2.2.l硫酸铜沉淀法根据非蛋白氮的化学性质来看，大部分溶于水，一部分在常温下不溶水，但在沸水中溶解。根据此种性质，可以先将样品煮沸，用硫酸铜将样品中的蛋白质沉淀下来，由于非蛋白氮已经溶于水，故可用过滤方法将其与样品中的蛋白质分离。在过滤时，水的温度一定不能太低，否则象双缩脲一类的物质会因为不溶于常温水而不能被过滤掉。用此种方法测定出的蛋白质含量称为样品的真蛋白质。但实际上，此种方法有很大的局限性。如果非蛋白氮不溶于沸水，或者将一般的非蛋白氮微囊化，此种方法测出的结果会与样品中的实际真蛋白有很大的差异。2.2.2氨基酸测定法为了真正能够判定样品中是否掺有

10、非蛋白氮，需测定样品中的氨基酸含量。无论采用经典的氨基酸自动分析仪分析（柱后衍生），还是采用比较快捷的hplc分析（往前衍生），将所测定的氨基酸总量相加得到一个总氨基酸数值，然后将此数值乘以 6.25 为 m，和用凯氏定氮法测定的粗蛋白质 n 相比较，m 至少为 n 的 85（m 可能略大于 n）。如果低于此数值，则可以判定该样品中掺有非蛋白氮。2.2.3水解蒸馏法原理非蛋白氮主要包括以下五类：尿素及其衍生物类、氨态氮类、铵类、肽类及其衍生物、动物粪便及其它废弃物类。如果在原料中掺有氨态氮类、铵类和粪便比较容易判断（可采用硫酸铜沉淀法加镜检），一般很少将肽类及其衍生物掺入其中，剩下比较难鉴别的

11、就是尿素及其衍生物。尿素和尿素衍生物经过强酸或强碱水解为氨盐或氨和其它的物质，在强碱的条件下可以蒸馏出氨气，原料中的蛋白质经过水解成氨基酸盐，氨基酸盐在强碱条件下稳定，从而可将非蛋白氮和真蛋白氮进行分离。仪器和设备：酒精喷灯，试管和其它常用的仪器。试剂与溶液：6mol1 的盐酸溶液和其它常用的试剂。测定方法：本文只列出用酸水解的方法。采集有代表性样品约 100g，混匀后用四分法缩分出 209 左右，将其粉碎，使其全部通过 60 目样品筛。精确称取 0.300 0g 的样品，置于容积为 60ml 的试管底部（注意样品勿沾在管壁上），加入 30ml 6moll 的盐酸溶液，将试管在距试管口 l2c

12、m 处用喷灯加热并封口。将封好的试管置于干燥箱内，于110下水解 24h。冷却后打开试管，将水解液过滤至 100ml 容量瓶中，用蒸馏水反复多次冲洗试管和滤纸，然后定容至刻度。用 10ml 移液管移取 10ml 样液移入半微量式定氮仪的反应室中，加入2oml 1:1 的氢氧化钠溶液蒸馏 10 min，余下的步骤按照测定粗蛋白的方法进行操作，得出样品所消耗的盐酸的体积为 v1（ml）。同时作空白滴定可得消耗的盐酸的体 积为 v0，设所称样品的质量为 m（g）。非蛋白氮的粗蛋白质计算公式:cp(%)（v1-vo）co14625/ m3 讨论及注意事项31 关于尿素衍生物是否水解和水解是否完全的问题

13、。从理论上讲，在强酸或强碱和一定的温度（110）的条件下，尿素及其尿素聚合物一定会水解，但不一定能够在 24h 内水解完全。经过笔者做了大量的试验，证明了缩二脲在 24h 内的水解程度可达到 50以上，尿素在同样的条件下的水解比率可达到 90以上。即使水解不完全，如果样品中含有尿素衍生物，其的数值 v1 也会远远的大于 v0，通过此数值， 也可判定样品中是否掺有非蛋白氮。3.2关于水解后的产物问题，经过笔者反复试验，确定该水解的最终物质为氨盐或一水合氨。33关于用半微量蒸馏时所用碱量和所用的时间：通过笔者大量的实践，如果水解程度比较完全，则按照做粗蛋白的方法确定蒸馏的时间，但笔者推荐将加碱量增大一倍即 20ml，蒸馏时间增大一倍以上即 10min 以上怎样做能使数据尽量的准确。34关于盐酸和氢氧化钠反应生成的大量的氯化钠对反应是否有影响的问题。笔者做了以下试验：先用加热的方法除去水解完毕后的盐酸，使其大部分挥发，然后再加等体积的氢氧化钠进行蒸馏，得出的结果可以看出：使用加热除去盐酸的方法和不除去盐酸的方法得出的结果相差不大（已经考虑在加热过程中的氨的损失）。35关于用碱水解的问题。碱水解的