抗抑郁药R托莫西汀中间体S氯苯丙醇的生物合成

1、研究背景研究背景 论文创新点论文创新点 实验结果实验结果 主要结论与建议主要结论与建议 1 2 3 4 研究背景研究背景 生物法制备手性药物中间体具有反应条件温和、 选择性好的优点。而且使用微生物全细胞作为催 化剂还可省去酶纯化与辅酶添加费用。 因此，利用生物法进行(S)-3-氯-1-苯丙醇的制备， 具有重要的现实意义。 研究背景研究背景 u目前对于(S)-3-氯-1-苯丙醇的制备多采用 化学法不对称还原或生物化学方法拆分 外消旋醇；对于生物法不对称还原前手 性酮制备手性醇研究较少。 u当前生物法制备手性醇最佳成果为：植 物细胞作为催化剂还原3-氯-1-苯丙酮， 20 mmol/L底物浓度下，

2、反应48 h，产率 达到78%，e.e.达到98% 。 论文创新点论文创新点 u1、筛选出一株催化性能优异的酵母，与其它 相关研究进行比较，本研究可以在实现同等对映 体过量率的情况下，得到更高的时空产率； u2、在水/有机溶剂体系和含离子液体的水/有 机溶剂体系中不对称还原得到(S)-3-氯-1-苯丙醇， 未见报道； u3、研究了单一水相体系和两相体系不同条件 对还原过程中细胞膜流动性、完整性等的影响， 初步探索了细胞生物学特性与不对称还原反应的 关系。 实验结果与讨论实验结果与讨论 1、菌株的筛选与鉴定 2、单一水相体系中的不对称还原 3、水/有机溶剂两相体系中的不对 称还原 1、菌株的筛选

3、与鉴定、菌株的筛选与鉴定 u菌株的筛选 菌株 产率(%)e.e. (%) 优势产物 汉逊德巴利酵母14.8253.31S Sigma面包酵母49.2790.09S 毕赤酵母NANA- 酵母FU572.4396.22S 高活性干酵母70.8594.12S 酿酒高活性干酵母30.2985.31S 表1 不对称还原酵母菌株的筛选 由表1可知，同等条件下，酵母FU5菌株对底物3-氯-1-苯丙酮具有最佳 的还原产率和对映体过量率。因此，选择其做为后续实验菌株。 1、菌株的筛选与鉴定、菌株的筛选与鉴定 u菌株鉴定 采用ITS全长序列分析对菌株进行鉴定。 图1 酵母基因组电泳图 图2 酵母ITS序列电泳图

4、1、菌株的筛选与鉴定、菌株的筛选与鉴定 u构建系统进化树 进化树的构建以刚果锥虫（Trypanosoma congolense）ITS序列 作为外类群，以担子 酵母（ Basidiomycete yeast ）ITS序列作为 参照，使用NJ算法，并对进化树进行1000次可信度检验。 FU5 W37 Saccharomyces cerevisiae strain NBRC 2114 Saccharomyces cerevisiae M01614 Saccharomyces cerevisiae strain isolate ZY9 Saccharomyces cerevisiae CHY1011

5、 Saccharomyces cerevisiae strain DX2006P Basidiomycete yeast sp. DX2006Q Basidiomycete yeast sp. Trypanosoma congolense 62 99 86 0.1 图3 基于ITS 序列和Neighbor-Joining 算法构建的系统发育树 2、单一水相体系中的不对称还原、单一水相体系中的不对称还原 表2 有氧无氧条件对不对称还原的影响 图4 底物浓度对不对称还原的影响 0510152025 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Final product concen

6、tration(mmol/L) or Initial reaction rate(mmol/(L.h) Yield or e.e.(%) Substrate concentration (mmol/L) Yield e.e. 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 Initial reaction rate Final product concentration 2、单一水相体系中的不对称还原、单一水相体系中的不对称还原 图5 细胞浓度对不对称还原的影响 图6 不对称还原的时间进程 产率维持恒定的原因：（1）反应达 到平衡；（2）体系中细胞死亡，反 应不再进行；（3）底物或

7、产物的毒 性导致细胞失去催化能力；（4）体 系中存在产物抑制。 04080120160200240 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Average specific production rate(mmol/(L.h.g) Yield or e.e.(%) Cell concentration(g/L) Yield e.e. 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Average specific production rate 010203040506070 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%

8、) Time (h) e.e. Yield 100 2、单一水相体系中的不对称还原、单一水相体系中的不对称还原 C产物OD260OD280RGlcViability 空白 0.5010.223100.0100.0 30.5120.29595.497.6 60.5830.32591.693.4 90.6220.33678.982.1 120.7050.32852.065.5 150.7900.39223.338.7 u在反应体系中加入产物对可能存在的产物毒性 进行考察。 图7 不同浓度的产物对还原的影响 表3 不同浓度的产物对酵母的影响 说明体系中存在产物毒性。 03691215 0.0 20.

9、0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield (%) Product concentration(mmol/L) Yield 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 Initial reaction rate Initial reaction rate(mmol/(L.h) 2、单一水相体系中的不对称还原、单一水相体系中的不对称还原 u在体系中加入环糊精、表面活性剂等添加物降 低体系中的产物浓度，并考察加入这些物质对 反应的影响。 0.02.55.07.510.012.5 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.

10、(%) Cyclodextrin concentration(mmol/L) Yield e.e. 图8 不同浓度的环糊精对还原的影响图9 不同浓度的表面活性剂对还原的影响 0.00.51.01.52.02.5 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield(%) Surfactant concentration (mmol/L) Tween 80 SDS CTAB 2、单一水相体系中的不对称还原、单一水相体系中的不对称还原 图10 不同浓度的表面活性剂对酵母细胞的影响 -0.50.00.51.01.52.02.5 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 OD2

11、60 or OD280 Surfactant concentration (mmol/L) 0.00.51.01.52.02.5 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Viability(%) Surfactant concentration (mmol/L) CTAB SDS Tween 80 0.00.51.01.52.02.5 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 RGlc(%) Surfactant concentration (mmol/L) CTAB SDS Tween 80 Circle: CTAB Square: SDS Triang

12、le:Tween 80 Open shape: OD260 Solid shape: OD280 3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原 Organic solvent log PYield (%)e.e. (%) 1-DMF-1.02.1589.44 2-乙酸乙酯0.680.2599.00 3-甲苯2.50.8382.20 4-正己烷3.555.4596.68 5-正辛烷4.546.8395.01 6-DBP5.46.9484.66 7-正十二烷6.637.4192.62 表4 两相体系有机溶剂的选择 图11 两相体系有机溶剂的选择 3、水、水/有机溶剂两相

13、体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原 图12 两相体系底物浓度对还原 的影响 图13 两相体系相体积比对还原 的影响 051015202530 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) Substrate concentration (mmol/L) Yield e.e. 012345678910 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) Volume of n-hexane(mL) Yield e.e. 1.5 3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对

14、称还原 u单一水相体系和两相体系的细胞膜流动性研究 （荧光分光光度计测定细胞荧光各向异性）： Ex 358 nm，Em 430 nm ，DPH标记时间：60min。 Entry r A:Control0.216 B:Control+1.5 mL 正已烷0.140 C: Control+20 mmol/L底物+1.5 mL 正已烷0.194 D :Control+20 mmol/L底物+1.5 mL 正已烷0.236 表5 不同条件处理酵母细胞的荧光各向异性 Control:10mL Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L，pH 8.0),100 g/L酵母湿 菌体,30 g/L葡萄糖。 四

15、种体系均在32 ，150 r/min下处理20 h。 3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原 u PI对酵母细胞染色，流式细胞仪检测显强荧光 和弱荧光的酵母个数，衡量酵母细胞膜完整性。 如膜流动性研究中四种方式处理酵母处于强荧光区的酵母细胞 占细胞数量比值都极低，其原因在于此种酵母细胞膜完整性难以被 破坏，四种处理方式可能对酵母细胞膜完整性影响较小。 图14 酵母细胞流式图 3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原 图15 两相体系中底物的分配图16 不同体系水相中的产物浓度 020406080100 0.00 0.05 0.1

16、0 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 Substrate concentration in n-hexane(mmol/L) Substrate concentration in aqueous(mmol/L) Total concentration of substrate(mmol/L) 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 0510152025 0.0 4.0 8.0 12.0 16.0 Product concentration in aqueous phase(mmol/L) Product concentration (mmo

17、l/L) monophasic aqueous system biphasic system 3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原 0102030405060708090 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) Glucose concentration (g/L) Yield e.e. 辅助底物Yield (%)e.e. (%) 甲醇24.0398.34 乙醇21.9398.41 丙三醇33.9697.21 异丙醇17.6897.98 正丁醇1.14100.00 葡萄糖62.0398.00 020406

18、080100120140 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) Cell concentration(g/L) Yield e.e. 0.00 0.10 0.20 0.30 Average specific production rate Average specific production rate(mmol/(L.h.g) 图17 不同细胞浓度对还原的影响 表6 两相体系辅助底物的选择 图18 不同葡萄糖浓度对还原的影响 3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原 图20 不同pH对还原的影响图19 不

19、同反应温度对还原的影响 2426283032343638 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Temperature( 0C) Yield or e.e.(%) Yield e.e. 345678910 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) pH Yield e.e. 3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原 图21 不同缓冲液浓度对还原的影响 BufferYield(%)e.e.(%) Control49.0297.52 Tris-盐酸82.0198.12 Tris-乙酸78.94

20、98.27 Tris-硼酸77.3098.01 Tris-磷酸81.8298.10 Tris-甘氨酸80.9098.29 表7 缓冲体系的选择 050100150200 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) Buffer concentration (mmol/L) Yield e.e. 3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原 图22 不同振摇速度对还原的影响 100150200250300 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) Shaking ra

21、te (r/min) Yield e.e. 3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原 图23 两相体系不对称还原的时间进程 在水/正己烷两相体系中，酵母细胞的催化活性保持时间较 长；但相比与单一水相体系，即使在较高的底物浓度下，两相 体系中的催化速率仍较低。 01020304050607080 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) Time (h) e.e. in biphasic system yield in biphasic system yield in monophasic aqueous sys

22、tem 底物浓度15 mmol/L 底物浓度20 mmol/L 3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原 u水/正己烷两相体系中加入离子液体对反 应的影响 加入不同种类的离子液体对酶的立 体选择性影响较小。但离子液体会对还 原产率产生不利影响。 主要结论主要结论 u1、筛选到一株对3-氯-1-苯丙酮具有良好的不 对称还原能力的酵母FU-5，初步鉴定为酿酒酵 母。 u2、在单一水相体系中，当底物浓度为15 mmol/L，反应20 h后，产率达到65%，e.e.达到 98%。研究显示，体系中不存在底物抑制与产物 抑制，但产物毒性限制了产率的提高。 u3、在水相体系中

23、，适当浓度的添加物 （Tween 80和-环糊精）可提高产率：当反应体 系中Tween 80浓度为2.0 mmol/L，-环糊精浓度 为5.0 mmol/L时，产率从对照组的64.7%分别提 高到73.8%和70.6%。说明同时具有包结作用和 改善细胞膜渗透性的Tween-80提高产物得率的 效果优于仅具有包结作用的-环糊精。但对于产 物e.e.值而言，两种包结物对其基本无影响。 主要结论主要结论 u4、在水/正己烷两相体系中，经过条件 优化，当底物浓度为 20 mmol/L时，产 率和e.e.值可分别达到84%和98%。相比 于单一水相体系，两相体系可使底物浓 度和产率得到大幅提高。 u5、

24、不同的反应体系对酵母细胞膜完整性 影响较小，但会影响细胞膜的流动性。 u6、所考察的9种离子液体对酵母细胞中 酶的立体选择性影响较小，但产率均有 所下降。 2、单一水相体系中的不对称还原、单一水相体系中的不对称还原 u在体系中加入环糊精、表面活性剂等添加物降 低体系中的产物浓度，并考察加入这些物质对 反应的影响。 0.02.55.07.510.012.5 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) Cyclodextrin concentration(mmol/L) Yield e.e. 图8 不同浓度的环糊精对还原的影响图9 不同浓度的表面活

25、性剂对还原的影响 0.00.51.01.52.02.5 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield(%) Surfactant concentration (mmol/L) Tween 80 SDS CTAB 3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原 图12 两相体系底物浓度对还原 的影响 图13 两相体系相体积比对还原 的影响 051015202530 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) Substrate concentration (mmol/L) Yield e.e. 012345678910 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 Yield or e.e.(%) Volume of n-hexane(mL) Yield e.e. 1.5 3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原 图15 两相体系中底物的分配图16 不同体系水相中的产物浓度 020406080100 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 Substrate concentration in n-hexane(mmol/L) Subst