发酵工程的灭菌与除菌课件

1、发酵工程的灭菌与除菌1 第四章第四章 灭菌灭菌与与除菌除菌 发酵工程的灭菌与除菌2 n在当前的发酵工业中，绝大多数的发酵过程属于需氧的纯 种发酵。 n发酵过程中需要不断通入无菌空气以满足微生物生长及合 成代谢产物的需要。 n在整个发酵系统内存活的生物体只有需要培养的微生物， 如果在发酵系统内除了需要培养的微生物以外，还有其他 微生物存活，这种现象称为染菌。 n染菌会给发酵带来很多负面影响，轻则影响产物的产量， 或使产物的提取变得困难，造成产品质量下降或收率降低， 重则导致产物全部损失，所以染菌是工业发酵的“大敌”。 n发酵使用的培养基、发酵设备、空气过滤器、附属设备、 管路、阀门以及通入罐内的

2、空气，在使用前均需彻底灭菌 或除菌，这是防止发酵过程染菌、确保正常生产的关键。 发酵工程的灭菌与除菌3 本章主要内容本章主要内容 第一节第一节 染菌的危害染菌的危害 第二节第二节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 第三节第三节 培养基和发酵设备的灭菌培养基和发酵设备的灭菌 第四节第四节 空气除菌空气除菌 发酵工程的灭菌与除菌4 第一节第一节 染菌的危害染菌的危害 问题来了问题来了 n杂菌污染会产生哪些不良后果？杂菌污染会产生哪些不良后果？ n为防止杂菌污染应采取哪些措施？为防止杂菌污染应采取哪些措施？ 发酵工程的灭菌与除菌5 n在工业发酵中，发生杂菌污染会产生以下不良后果： n营养物质

3、和产物会被杂菌消耗而损失； n杂菌产生的毒性物质和某些酶类会抑制生产菌株的 生长； n杂菌的代谢产物改变发酵液的某些理化性质(如溶 解氧、黏度、pH) ，抑制产物的生物合成； n污染的杂菌和产生的某些酶类会分解或破坏已经合 成的产物； n使产物提取变得困难，造成产率降低或使产品外观 及内在质量下降； 1.发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使生产失败。 发酵工程的灭菌与除菌6 n因此防止染菌是任何发酵的一项重要工作内容， 必须牢固树立无菌观念，特别强调无菌操作： n发酵设备、空气过滤器、附属设备、管路、阀门 应严格密闭，整个系统要维持高于环境的压力， 使用前应经过彻底灭菌； n培养基和培养过程中

4、加入的物料应经过彻底灭菌； n通入罐内的空气应经彻底除菌处理； n使用无污染的种子等。 1.这是防止发酵过程染菌、确保正常生产的关键。 发酵工程的灭菌与除菌7 第二节第二节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 有问题吗？有问题吗？ n词解：灭菌：消毒：防腐：化疗：致死温度：词解：灭菌：消毒：防腐：化疗：致死温度： 致死时间：热阻：相对热阻：致死时间：热阻：相对热阻： n消毒与灭菌的概念及区别消毒与灭菌的概念及区别? 发酵工程的灭菌与除菌8 n工业生产中常用的灭菌方法有哪些？原理？应用工业生产中常用的灭菌方法有哪些？原理？应用 范围？优缺点？范围？优缺点？ n湿热灭菌原理？灭菌彻底与否以何

5、为标准？湿热灭菌原理？灭菌彻底与否以何为标准？ n如何计算灭菌时间？对数残留定律的意义有哪些？如何计算灭菌时间？对数残留定律的意义有哪些？ k值的意义？值的意义？ n如何确定灭菌温度？阿累尼乌斯方程式的意义？如何确定灭菌温度？阿累尼乌斯方程式的意义？ 高温短时灭菌方法的意义？高温短时灭菌方法的意义？ n为什么干热灭菌与湿热灭菌相比温度高？时间长？为什么干热灭菌与湿热灭菌相比温度高？时间长？ 发酵工程的灭菌与除菌9 一、常用灭菌方法 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 发酵工程的灭菌与除菌10 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 n灭菌：是利用物理或化学的

6、方法杀灭或去除物 料或设备中所有的有生命的有机体的技术或工 艺过程。 n消毒：是采用较温和的理化方法，仅杀死对人 体有害的病原微生物的过程。 n消毒只能杀死营养细胞而不能杀死芽孢或孢子。 n除菌：是指用过滤方法除去空气或液体中所有 的微生物及其孢子。 发酵工程的灭菌与除菌11 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 n防腐：就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生 物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的 措施。如： 低温，缺氧，干燥，高渗，高酸度， 防腐剂。 n化疗即化学治疗：是利用具有高度选择毒力（即 对病原微生物具有高度毒力而对宿主无显著毒性） 的化学物质来抑制宿主体内病原

7、微生物的生长繁 殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。 n用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂。最重要的 化学治疗剂如各种抗生素、磺胺类药物和中草药中 的有效成分等。 发酵工程的灭菌与除菌12 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 n发酵工业生产中常用的灭菌方法： n化学物质灭菌、 n热灭菌 n辐射灭菌 n过滤介质除菌 n臭氧（O3）灭菌 干热灭菌 湿热灭菌 发酵工程的灭菌与除菌13 n高温灭菌 干热灭菌法 火焰灼烧法 热空气灭菌法 湿热灭菌法 常压灭菌 高压灭菌 巴氏消毒法 煮沸消毒法 间歇灭菌法 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 高压12115min；

8、低压10530min。 低温长时间(LTLT,6265,30 分钟)，现在殆不存在， 高温短时间(HTST,7275,15 秒)，能杀灭牛乳中之所有病 原菌，在欧美主要被使用。 超高温加热瞬时法(UHT法 ， 120150、14秒) ，而成为 今日牛乳杀菌法的主流，此 有牛乳中乳清蛋白增进变性 之虞。 发酵工程的灭菌与除菌14 n二、高温湿热灭菌二、高温湿热灭菌 n1.高温湿热火菌是利用饱和蒸汽直接接触需要灭菌 的物品以杀死微生物。 n原理：蒸汽具有强大的穿透力，冷凝时释放大量 潜热，使微生物细胞中的原生质胶体和酶蛋白变 性凝固，核酸分子的氢键破坏，酶失去活性，于 是微生物因代谢发生障碍而在短

9、时间内死亡。 n湿热灭菌法是目前最常用的基本灭菌方法，一般 的湿热灭菌条件为121 (表压约0.1MPa) ，维持 2030min 。 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 发酵工程的灭菌与除菌15 n湿热灭菌优点： n蒸汽来源方便，操作简单，价格低廉，本身 无毒； n蒸汽有强的穿透力(能杀死耐热的芽孢杆菌能杀死耐热的芽孢杆菌)和 很大的潜热，灭菌效果可靠； 因此被广泛用于工业生产。 n注意：将饱和蒸汽通入培养基中灭菌时，冷凝 水会使培养基的浓度下降，所以在配制培养基 时应扣除冷凝水的体积，以保证培养基在灭菌 后保持应有的浓度。 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的

10、基本原理 发酵工程的灭菌与除菌16 n2.几个概念 n各种微生物都有一定的最适生长温度范围，如嗜 冷微生物的最适生长温度为510，常温微生物 的最适生长温度为2537，嗜热微生物的最适生 长温度为5060，甚至更高。 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 杂菌的名称杂菌的名称 溫度溫度/ 最低最低最适最适最高最高 嗜热芽孢杆菌嗜热芽孢杆菌526575 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌15303755 大肠杆菌大肠杆菌10303743 酵母菌酵母菌0.5253040 表几种杂菌适应温度范围表几种杂菌适应温度范围 发酵工程的灭菌与除菌17 n当微生物处于其最适生长温度的下限时，代谢作 用

11、几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最适生 长温度的上限时，细胞中的蛋白质会发生不可逆 的凝固变性，在很短时间内引起死亡。热灭菌即 是利用微生物的这一特性进行的。 n能够杀死微生物的温度称为致死温度。 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 几种杂菌致死温度范围几种杂菌致死温度范围 杂菌名称杂菌名称致死溫度致死溫度/致死时间致死时间/min 嗜热芽孢杆菌嗜热芽孢杆菌12012 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌100617 大肠杆菌大肠杆菌6010 肺炎球菌肺炎球菌5657 酵母菌酵母菌5060510 发酵工程的灭菌与除菌18 n致死时间：在致死温度下杀死全部微生物所需要的 时间称为致死时

12、间。 n对于同种微生物，在致死温度范围，温度愈高，致 死时间就愈短。 n同种微生物的营养体、芽孢和胞子的结构不同，对 热的抵抗力也不同，致死温度和致死时间也有很大 的差别。 n不同的微生物的致死温度和致死时间也有差别。 n一般无芽孢的营养菌体在60保温l0min即可全部被杀死， n而芽孢在100%下保温数十分钟乃至数小时才能被杀死， n某些嗜热细菌在121下可耐受20-30min 。 发酵工程的灭菌与除菌19 n微生物对热的抵抗力常用“热阻”表示。 n热阻：指微生物在某一种特定条件下（主要指温度 和加热方式）的致死时间。 n一般来说，灭菌是否彻底，是以能否杀死热阻大 的芽孢杆菌为指标。 n相对

13、热阻：是指某一微生物在某一条件下的致死时 间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。 发酵工程的灭菌与除菌20 n某些微生物的相对热阻及对一些灭菌剂的相对某些微生物的相对热阻及对一些灭菌剂的相对 抵抗力抵抗力 (与大肠杆菌相比较与大肠杆菌相比较) 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 灭菌方式大肠杆菌 细菌或酵母 营养细胞 细菌芽胞 霉菌孢子 噬菌体 和病毒 干热1110002101 湿热11310621015 苯酚11101081230 甲醛112502102 紫外线11255100510 发酵工程的灭菌与除菌21 2、灭菌时间的选择 n在灭菌过程中，微生物由于受到不利环境

14、条件的作用而 逐渐死亡，其死亡的速率(dN/dt)与瞬间残留的微生物数 目(N)成正比，服从一级反应动力学，可以用数学表达式： n其中 N：时间t时培养基中残存的活菌数(个)； t：灭菌时间(s或min)； k：灭菌速度常数，或称菌死亡速度常数(1/s或1/min)， 与灭菌温度、菌种特性有关； dN/dt：活菌的瞬时变化速率，即死亡速率(个/s或个/min )。 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 kN dt dN 发酵工程的灭菌与除菌22 n开始灭菌时，即t=0时，培养基中活菌数为N0。积 分上式得： 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 dN N N

15、 N 0 1 t kdt 0 = = - - t kt N N 0 ln t kN N 0 lnt t 1 NO-灭菌开始时原有的活菌数灭菌开始时原有的活菌数(个个) Nt -灭菌结束后残留的活菌数灭菌结束后残留的活菌数(个个) s o N N K tlog 1 303. 2 t k 可以由实验测出可以由实验测出 此式表明：活菌残留率的对数与灭菌时 间呈线性关系，这就是对数残留定 律”。 发酵工程的灭菌与除菌23 n对数残留定律 的意义： n 热灭菌时间(t)取决于污染程度(N0)、灭菌程度(残留菌 数Nt)以及热致死速率常数k值。 n因此配制培养基所用原料要含杂菌少，培养基配制后 要尽快灭菌

16、，以减少杂菌的生长。 n灭菌程度的确定：在对数残留方程式中，如果要达到 绝对彻底地灭菌，即Nt=0，所需灭菌时间t为，这实 际上是不可行的。 n因此在生产设计上常采用Nt=0.001 为达到灭菌要求， 即，在1000批次灭菌中只允许有1批失败； N0可以参考一般培养基中的活菌数，取为1107 2107个/mL。由此得到的是理论灭菌时间，实际设计 和操作时可适当延长或缩灭菌时间。 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 s o N N K tlog 1 303. 2 t k 发酵工程的灭菌与除菌24 n例：有一发酵罐内装40m3培养基，在121温度下进行 实罐灭菌。原污染程度为2

17、105/ ml个耐热细菌芽孢， 121时灭菌速度常数为0.03s1。求灭菌失败几率为 0.001时所需的灭菌时间。 解：N0 = 40106 2105 = 8 1012 (个) Nt = 0.001; K= 1.8 (min 1) t = 2.303 K lg N0 N = 2.303 1.8 lg (81015) = 20.34 (min) 发酵工程的灭菌与除菌25 n 如以活菌残留率的 对数 与灭菌时 间t的实测值作图， 得出的残留曲线在 一定的时间范围内 为直线，其斜率为- k/2.303，k值随菌株 及灭菌温度而异。 n若温度升高，残留 曲线会变陡，也就 是k值增加，表明微 生物灭菌时

18、容易死 亡。 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 (log Nt /No) 灭菌时间灭菌时间t(min) t log N No 活菌残留率的对数活菌残留率的对数 02468 10 10-4 10-3 10-2 10-1 1 54oC 56oC 58oC 60oC N No t(min) 大肠杆菌在不同 温度下的残留曲线 s o N N K tlog 1 303. 2 t k 发酵工程的灭菌与除菌26 某嗜热芽胞杆菌在104 和131 时的残存曲线 发酵工程的灭菌与除菌27 nk值是微生物耐热性的特征，与微生物的种类和灭菌 温度有关。灭菌速度常数k是判断微生物受热死亡难 易程

19、度的基本依据。 n在相同的灭菌条件下，各种微生物的k值是不同的，k 值愈小，表明这种微生物的热阻愈大，越耐热。 n细菌营养体、酵母菌、放线菌、病毒及噬菌体对热 的抵抗力较弱，如121 时， k =101010/min 。 n而细菌芽孢、霉菌孢子对热的抵抗力较强。如121 时，k =1/min左右， 发酵工程的灭菌与除菌28 细菌芽孢名称细菌芽孢名称k值值 1 /s 枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌0.0430.047 硬脂嗜热芽胞杆菌硬脂嗜热芽胞杆菌FS15180.013 硬脂嗜热芽胞杆菌硬脂嗜热芽胞杆菌FS6170. 049 产气梭状芽胞杆菌产气梭状芽胞杆菌PA36790.030 在121，悬浮于缓

20、冲液中的几种细菌芽孢的k值 发酵工程的灭菌与除菌29 n三、干热灭菌 n是指在干燥高温条件下，微生物细胞内的各种 与温度有关的氧化反应速度迅速增加，使微生 物的致死率迅速增高的过程。 n常用灭菌条件：160下保温12 h。 n适用范围：需要保持干燥的器械和容器的灭菌， 如培养皿、接种针、吸管等玻璃、陶瓷、金属 可以耐高温的物品。 n灼烧，是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只 能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 发酵工程的灭菌与除菌30 四、辐射灭菌 n辐射灭菌是利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭 微生物。 射线、X射线、射线、射线、紫

21、外线、超 声波等从理论上讲都能破坏蛋白质，破坏生物活性物 质，从而起到杀菌作用。 nX射线、射线，波长0.11.4，含有极高的能量，使 菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，产生自 由基，进一步与氧作用，产生一些具强氧化性的过氧 化物，如HO2 、H2O2，使细胞内某些蛋白质和酶发生 变化，阻碍微生物的代谢活动而导致菌体损伤或迅速 死亡。 nX射线的穿透力极强，但不经济，并且向四面八方辐射， 不适于发酵生产使用。 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 发酵工程的灭菌与除菌31 n紫外线波长为21003100的紫外线有灭菌作用， 最常用的波长2537的紫外线。 n主要是与菌体

22、核酸发生光化学反应而造成菌体死亡。 n紫外线对微生物菌体和芽胞均有杀灭作用，有高度 致死效果。但紫外线的穿透力很低，仅适用于表面 和局部空间灭菌，如台面、洁净室、更衣室等。 n现在，紫外线常与HVAC相结合用于气相循环消毒。 nHVAC是Heating, Ventilation and Air Conditioning 的 英文缩写，就是空气调节系统，是包含温度、湿度、 空气清净度以及空气循环的控制系统。 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 发酵工程的灭菌与除菌32 五、化学物质灭菌五、化学物质灭菌 原理：某些化学药剂能与微生物细胞中的某种成分产生 化学反应，如使蛋白质变性

23、、酶类失活、破坏细胞膜 透性而具有杀菌或消毒的作用。 常用的化学药剂：甲醛、氯(或次氯酸钠)、高锰酸钾、环 氧乙烷、苯酚、季氨盐(如新洁尔灭)、氯化汞等。 适用情况：因培养基里含有蛋白质等营养物质亦易与 上述化学物质发生化学反应， 同时药物加入培养基之后很难除掉。 适合于局部空间或某些器具的消毒，但不适合用于培 养基的灭菌。 使用方法：根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、 喷洒、气态熏蒸等。 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 发酵工程的灭菌与除菌33 六、静电除菌 n静电除菌是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘 灭菌的目的。原理是，悬浮于空气中的微生物，其孢 子大多数

24、带有不同的电荷，没有带电荷的微粒进入高 压(1000V/cm2)静电场时都会被电离成带电颗粒，受 静电场库仑力的作用，向极板移动，吸附在极板上， 得到净化的气体排出除尘器外。 - - - - 带微粒的空气 电离部分 除尘部分 清洁空气 5000v 10000v 图4-2 静电除尘器装置图 发酵工程的灭菌与除菌34 空气进 空气出 钢丝电 晕电极 钢管沉 淀电极 + 发酵工程的灭菌与除菌35 n优点：阻力小，约0.01MPa； n除水、除油的效果好 n耗电少，每处理1000m3的空气每小时仅耗电0.20.8KW。 n缺点： n静电除菌效果不是很高，一般在8599%之间； n当捕集的微粒积聚到一定

25、厚度时，极板电压下降，微粒的吸附力 减弱甚至随气流飞散，这时除菌效率很快下降。一般当电极板上 尘厚1mm时，就应该用喷水管自动喷水清洗，洗净干燥后重新投 入使用。 n对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小，当产生的引力等 于或小于微粒布朗扩散运动的动量时，则微粒就不能被吸附而沉 降，所以静电除尘灭菌对很小的微粒效率较低。 n设备庞大 、一次性投资较高。 由于除菌效率不高，往往需要与高效空气过滤器联由于除菌效率不高，往往需要与高效空气过滤器联 合用于洁净工作室空气除菌；或用于洁净工作台。合用于洁净工作室空气除菌；或用于洁净工作台。 发酵工程的灭菌与除菌36 n七、臭氧（O3）灭菌 n臭氧是一种

26、强氧化剂，灭菌过程属生物化学氧化反 应。原理是： n臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分 解成氧气（O2）和单个氧原子（O）；后者具有极 强的氧化作用，能氧化分解细菌内部氧化葡萄糖所 必须的酶，从而破坏其细胞膜，将它杀死； n直接与细菌、病毒作用，破坏它们的细胞器和DNA、 RNA，使细菌的新陈代谢受阻，导致细菌死亡； 作用于细胞外膜的脂蛋白和内部的脂多糖，使细菌 发生通透性畸变而溶解死亡。 发酵工程的灭菌与除菌37 n我国在GMP验证过程中人们大力推荐臭氧灭菌方 法。臭氧灭菌有许多特点： n O3为气体，能迅速弥漫到整个灭菌空间，灭菌无死角， 浓度分布均匀。 n臭氧灭菌为溶菌级方法，

27、杀菌彻底。杀菌能力与过氧 乙酸相当，高于其它消毒剂。 n杀菌广谱，可杀灭细菌繁殖体和芽孢、病毒、真菌等， 并可破坏肉毒杆菌毒素。另外，O3对霉菌也有极强的 杀灭作用。 臭氧制备是利用我们周围的大气制取(现有成型产品： 臭氧发生器），现制现用，不需储藏设施，节省原料 储储所需的占地面积。 发酵工程的灭菌与除菌38 n臭氧分解形成的单个氧原子（O）则会自行重新结合成 为普通氧分子（O2），不存在任何有毒残留物，没有 二次污染，故称无污染消毒剂(绿色消毒剂)。 n臭氧灭菌在药品生产中具有广泛的用途。 n对管道容器的灭菌； n与HVAC相结合，利用中央空调净化系统对洁净 区的灭菌； n对原辅助材料和工

28、作器具的灭菌； n对密闭空间的灭菌； n对药厂用水的灭菌处理。 发酵工程的灭菌与除菌39 n八、介质过滤除菌 n要去除液体或气体中的微生物以达到无菌要求，可 以使用适当的材料进行过滤，这种方法只能用于澄 清流体的除菌。工业上主要用于热敏性物质(氨水、 丙醇等)和空气的除菌。 n按过滤除菌机制不同而分为 n两者原理是不同的，绝对过滤绝对过滤介质间的空隙小于颗 粒直径，是靠表面拦截作用除去菌体；而深层过滤深层过滤 介质间的空隙远大于颗粒直径。是靠微生物微粒与 滤层纤维间产生惯性冲击、拦截、扩散、重力沉降 及静电吸附等作用，将其中的尘埃和微生物截留、 捕集在介质层内，达到过滤除菌体目的。 第一节第一

29、节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 绝对过滤绝对过滤 深层过滤深层过滤 发酵工程的灭菌与除菌40 1、绝对过滤 n绝对过滤最常用的过滤材料是微孔滤膜。选择孔径 为0.2m或0.45m的滤膜就可达到除菌的目的。对动 物细胞血清培养基选用0 1m孔径的滤膜来除去支原 体的污染。 n滤膜材料可以是醋酸纤维素、尼龙、聚醚砜、聚丙 烯等。 n绝对过滤易于控制过滤后空气质量，节约能量和时 间，操作简便。 n由于绝对过滤介质的拦截负荷大，所以滤膜的使用 寿命短、处理量小，对预处理的要求高。在空气过 滤之前应设预过滤器将空气中的油、水除去，以提 高微孔滤膜的过滤效率和使用寿命。 发酵工程的灭菌与除菌

30、41 2、深层过滤（介质过滤） n空气中的微生物大多数是细菌和芽孢，还有一定数 量的霉菌、酵母和病毒。细菌的大小为零点几微米 至几微米，这些微生物在空气中极少单独游离存在， 基本都是附着在灰尘、液滴等微粒的表面上。 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 微生物 细胞(m)宽*长 孢子(m)宽*长 金黄色小球菌 0.511.0 产气杆菌 1.01.5 1.02.5 蜡样芽孢杆菌 1.32.0 8.125.8 普通变形杆菌 0.51.0 1.03.0 巨大芽孢杆菌 0.92.1 2.010.0 0.61.2 0.91.7 霉状分枝杆菌 0.61.6 1.613.6 0.81.2

31、0.81.8 枯草杆菌 0.51.1 1.64.8 0.51.0 0.91.8 酵母菌 35 519 2.53.0 病毒 0.00150.225 0.00150.28 发酵工程的灭菌与除菌42 空气中常见微生物种类及大小 微生物细胞：宽长/m孢子：宽长/m 产气杆菌1.01.51.02.5 蜡状芽孢杆菌1.32.08.125.8 普通变形杆菌0.51.01.03.0 地衣芽孢杆菌0.50.71.83.3 巨大芽孢杆菌0.92.12.010.00.61.20.91.7 蕈状芽孢杆菌0.61.61.613.6 枯草芽孢杆菌0.51.11.64.80.51.00.91.8 金黄色小球菌0.51.00

32、.51.0 酵母菌3.05.05.019.0 病毒0.00150.2250.00150.28 霉状分枝杆菌0.61.61.613.60.81.20.81.8 发酵工程的灭菌与除菌43 n介质过滤除菌就是把空气中的各种微粒和游离微 生物捕集起来，从空气中除掉。为适用于大量的 空气净化处理，可用较大孔隙的纤维介质等滤材 组成深层过滤层，来去除极微小的悬浮微生物。 n采用空气过滤器制备大量的无菌空气，滤材要求 能耐受高温高压，不易被油水污染，除菌效率高， 阻力小，成本低，易更换。 n常用的滤材介质有棉花、棒状活性炭、石棉板、 超细玻璃纤维纸、烧结玻璃、粉末烧结金属、硝 酸纤维酯类物质、多孔陶瓷、聚四

33、氟乙烯薄膜、 聚砜、尼龙膜等。 第一节第一节 灭菌和除菌的基本原理灭菌和除菌的基本原理 发酵工程的灭菌与除菌44 n介质过滤除菌的原理与绝对过滤除菌的原理是不 同的，介质过滤介质间的空隙往往远大于颗粒直 径。 n如棉花纤维直径一般为1620m，充填系数(空气 过滤器内过滤介质的体积占过滤器总体积的百分 率)为8%时，棉花纤维间形成的空隙为2050m。 球菌的直径一般在0.52m，杆菌一般长1-5m， 宽0.5lm。 n带微粒的空气流过纤维滤层时，悬浮于空气中的 微生物菌体何以能被过滤除去呢？ 发酵工程的灭菌与除菌45 n当气流为层流时，气体中的微粒随 空气做平行运动，接近纤维表面的 微粒(指在

34、流动空气宽度b内的微粒) 被纤维捕获，而宽度大于b的气流 中的微粒绕过纤维继续前进。 n因为过滤介质层是由无数的纤维纵 横交错组成的，形成的网格阻碍气 流前进，使气流无数次地改变运动 速度和运动方向，这些改变引起空 气中微粒的惯性冲击、拦截、扩散、 重力沉降和静电吸附等作用，于是 大大增加了微粒被纤维捕获的几率。 第一节 灭菌和除菌的基本原理 发酵工程的灭菌与除菌46 n（1）惯性冲击截留作用：撞上去被吸附； n灰尘微粒有一定的质量，因而在运动时有一定的惯 性。当灰尘微粒随气流前进遇到过滤介质时，气流 突然改变流向，而微粒由于惯性力的作用仍然沿直 线向前运动，与纤维碰撞而被吸附于纤维的表面上，

35、 此微粒就被捕集。 n这种惯性冲击作用的程度取决于微粒的动能、纤维 阻力、气流速度。惯性冲击作用的强弱与气流流速 成正比，空气流速大时，惯性冲击就起主导作用。 第一节 灭菌和除菌的基本原理 发酵工程的灭菌与除菌47 n(2)拦截截留作用：速度太慢动能不足被吸附； n当气流速度较低时，微粒的运动轨迹与空气流线相似。气 流改变力向时，微粒的流向随之改变，与纤维表面接触时 就被捕集，这种作用叫拦截。 n微生物微粒直径很小，质量很轻，当随低速气流流动靠近 纤维时，微粒所在的主导气流流线受纤维阻碍而改变力向， 绕过纤维前进，并在纤维的周边形成一层边界滞留区。滞 留区的气流速度更慢，进入滞留区的微粒慢慢靠

36、近纤维并 接触纤维而被黏附捕集。微粒被捕集的位置为90o，空 气流速较小时，拦截才起作用。 第一节 灭菌和除菌的基本原理 90o 发酵工程的灭菌与除菌48 n(3)布朗扩散截留作用：不规则运动增强了接触机会； n直径很小( 1m)的微粒在很慢的气流中能产生不规 则的直线运动称为布朗运动。结果使较小的微粒聚集 成为较大的微粒，增加了与纤维接触的机会，当与纤 维接触时就被捕集，这种作用叫做扩散。 n布朗扩散的运动距离很短，在较大的气速、较大的纤 维间隙中是不起作用的，但在很慢的气流速度和较小 的纤维间隙中布朗扩散作用大大增加微粒与纤维的接 触滞留机会。由于布朗扩散截留作用的存在，大大增 加了纤维的

37、截留效率。 第一节 灭菌和除菌的基本原理 发酵工程的灭菌与除菌49 n(4) 重力沉降作用：对大颗粒有效； n空气中的灰尘微粒所受的重力大于气流对它的 支持力时，微粒就会沉降。 n直径50m以上的颗粒沉降作用比较显著，小颗 粒只有在气流速度很慢时才有沉降作用。 n一般重力沉降是与拦截作用相配合的，即在纤 维的边界滞留区内，微粒的沉降作用提高了拦 截的捕集效率。 第一节 灭菌和除菌的基本原理 发酵工程的灭菌与除菌50 n(5) 静电吸引作用：异性相吸。 n空气在非导体物质中间进行相对运动时，由于摩 擦会产生诱导电荷，特别是纤维更为显著。悬浮 在空气中的微生物颗粒大多带有不同的电荷。有 人曾测定，

38、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌约有75%的 孢子带负电荷，15%的孢子带正电荷，其余10%的 孢子是电中性的。 n带电荷的微生物通过过滤介质层时，可被具有相 反电荷的纤维介质吸引，而被吸附捕集；也可能 是纤维介质被流动的带电荷的粒子所感应，产生 相反的电荷而将粒子吸引。 n此外表面吸附也归属于这个范畴，如活性炭的大 部分过滤作用是表面吸附的作用。 第一节 灭菌和除菌的基本原理 发酵工程的灭菌与除菌51 n在过滤除菌中，有时很难分辨上述各种机理各自所做 出贡献的大小，多是五种作用的综合结果。随着参数 的变化，各种作用之间有着复杂的关系，目前还未能 作准确的理论计算。 n一般认为惯性冲击、拦截和布朗扩散

39、运动的作用较大， 而重力沉降作用和静电吸引的作用则很小。 n上图是纤维过滤除菌总效率与气流速度Vs的关系。 n过滤效率就是滤层所滤去的微粒数与原有微粒数的过滤效率就是滤层所滤去的微粒数与原有微粒数的 比值，它是衡量过滤设备过滤能力的指标。比值，它是衡量过滤设备过滤能力的指标。 n当气流速度较大时(大于0.1m/min)，以惯性冲击作用为 主。当气流速度低于一定值时，以拦截作用和扩散作 用为主，并可认为惯性冲击不起作用，此时的气流速 度称为临界速度(Vc)。 第一节 灭菌和除菌的基本原理 Vc 发酵工程的灭菌与除菌52 n临界速度与纤维直 径df、微粒直径dp以 及气体的物理性质 有关。 n空气

40、温度20，微 粒重度p=1.0g/cm3 时，通过不同直径 的纤维过滤层的空 气的临界速度 (Vc) 见右图 第一节 灭菌和除菌的基本原理 发酵工程的灭菌与除菌53 第一节 灭菌和除菌的基本原理 n空气过滤后的微粒数与过滤前的微粒数的比值称为 穿透率P，则 n P = n式中N0过滤前空气中的微粒含量(个)； n Nt过滤后空气中的微粒含量(个)。 n介质过滤效率是指被捕集的微粒数与空气中原有 的微粒数的比值，是衡量过滤设备过滤能力的指标。 n n = =1-=1-P Nt N0 N0 -Nt N0 Nt N0 发酵工程的灭菌与除菌54 第一节 灭菌和除菌的基本原理 n空气过滤器的过滤效率与微

41、粒的大小、过滤介质的种类 和纤维直径、介质的填充密度、介质层的厚度以及空气 通过介质层的气流速度等因素有关。 n1）纤维直径：在其他条件相同时，介质纤维直径越小， 过滤效率越高。 n2）介质的填充厚度与密度：对于相同的介质，填充厚 度和密度越大则过滤效率越高，但同时流速也越小。 n3 ）空气流速：在空气流速很低时，过滤效率随气流速 度增加而降低；当气流速度增加到临界值后，过滤效率 随气流速度增加而提高；气流速度高达一定值后，过滤 效率再降低，所以要通过实验方法来摸索最适流速。 发酵工程的灭菌与除菌55 第一节 灭菌和除菌的基本原理 n空气在一定的条件下，通过单位高度介质层后，杂 菌数目的减少量

42、与进入此介质层的杂菌数量成正比， 即： n - = K N n式中N进入介质层的菌的数目(个)； n L介质层厚度(m)； n K过滤常数或除菌常数(1/m)； ndN/dL单位高度过滤介质层所除去的菌的数目(个/米)。 dN dL 发酵工程的灭菌与除菌56 第一节 灭菌和除菌的基本原理 n将上式移项积分，得： n =- n L=ln n上式称为“对数穿透定律”，表示进入过滤介质滤层 的菌数与穿透过滤介质滤层的菌数之比的对数与滤层 厚度成正比。 n如果要将杂菌完全除尽，即NL=0，滤层厚度需要无 穷大，事实上是不可能的。 L 0 N N N dN t LdK 0 1 K N0 Nt 发酵工程的

43、灭菌与除菌57 第一节 灭菌和除菌的基本原理 n这说明介质过滤不可能长期拥有100%的除菌效 率， n在分批发酵过程中，介质过滤除菌的实质是通 过介质的作用，大大延长了空气中的微生物在 过滤介质中的停留时间，在整个发酵周期内阻 止空气中的杂菌进入发酵罐导致染菌。 n当气流速度达到一定值或过滤介质使用时间太 长，介质中滞留的杂菌微粒就有可能穿过，所 以过滤器必须定期灭菌。 发酵工程的灭菌与除菌58 n培养基的灭菌 n1. 分批灭菌 n2. 连续灭菌 n发酵罐的灭菌 n1. 空消 n2. 实消 n物料管路的灭菌 n倒种管路的灭菌 n补料液的灭菌 n消沫剂的灭菌 第二节 培养基和发酵设备的灭菌 湿热

44、灭菌效果好，湿热灭菌效果好， 具有经济、快速的具有经济、快速的 特点，广泛用于工特点，广泛用于工 业生产，适用于培业生产，适用于培 养基、发酵罐、附养基、发酵罐、附 属设备属设备(油罐、糖罐油罐、糖罐 等等)、管道以及其他、管道以及其他 耐高温物品的灭菌。耐高温物品的灭菌。 发酵工程的灭菌与除菌59 问题怎么这么多？问题怎么这么多？ n连消与实消各有何优缺点？连消与实消各有何优缺点？ n影响培养基灭菌因素有哪些？影响培养基灭菌因素有哪些？ n如何计算培养基灭菌时间？如何计算培养基灭菌时间？ n怎样做到既要灭菌目的又要保护培养基营养成怎样做到既要灭菌目的又要保护培养基营养成 分最少破坏？分最少破

45、坏？ n实消的过程要点和控制参数？实消的过程要点和控制参数？ n连消的过程要点和设备组成？连消的过程要点和设备组成？ 发酵工程的灭菌与除菌60 一、温度和时间对培养基灭菌的影响 n用湿热灭菌方法对培养基灭菌，在杀灭微生物的同时， 也会对营养成分造成破坏。在高压加热的条件下，会使 糖液焦化变色、维生素失活、醛糖与氨基化合物反应、 不饱和醛聚合、一些化合物水解等。 一、温度和时间对培养基灭菌的影响 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死亡程度为N/N0=10-16时， 灭菌温度对维生素B1破坏的影响 灭菌温度 （C） 达到灭菌程度的时间 （min） 维生素B1的损失 （%） 100 110 120 130 140

46、 150 843 75 7.6 0.851 0.107 0.015 99.99 89 27 10 3 1 发酵工程的灭菌与除菌61 一、温度和时间对培养基灭菌的影响 灭菌温度、灭菌时间和维生素灭菌温度、灭菌时间和维生素B1破坏量的比较破坏量的比较 灭菌灭菌温度温度/灭菌时间灭菌时间/minB1破坏量破坏量/% 10040099.3 1103067 1151550 120427 1300.58 1400.082 1500.011 发酵工程的灭菌与除菌62 n因此，选择既能达到灭菌要求又能减少营养成分 破坏的灭菌温度和时间，是提高培养基灭菌质量 的重要内容。 n将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以接

47、受的总数 Nt(10-3)， 需要多高的温度、多长的时间为合理。 灭菌温度和时间的确定取决于： n（1）杂菌孢子的热灭死动力学； n（2）反应器的形式和操作方式； n（3）培养基中有效成分受热破坏的可接受范围。 一、温度和时间对培养基灭菌的影响 发酵工程的灭菌与除菌63 n首先，培养基的绝大部分营养成分的破坏属于一级 分解反应，其反应动力学方程式为： n式中：C-反应物浓度(mol/L)；t-分解反应时间(s)； k-分解反应速度常数，与温度和反应物种类有关(1/s) n化学反应中，在其他条件不变的情况下，分解反应速度常数k 与温度T的关系用阿累尼乌斯方程式表示： n式中： A-分解反应的阿累

48、尼乌斯常数(1/s ) R-气体常数8.314J/(mol K)； T-热力学绝对温度(K)； E-分解反应所需的活化能(J/mol)； 一、温度和时间对培养基灭菌的影响 kC dt dC RTE eAk / 发酵工程的灭菌与除菌64 n热灭菌致菌体死亡也是一级动力学反应，热致死速 度常数与温度的关系也可用阿累尼乌斯方程式表示： n式中A-灭菌反应的阿累尼乌斯常数(1/s ) E-灭菌反应所需的活化能(J/mol)； 前两式取对数，则得： 营养成分的破坏方程式营养成分的破坏方程式 菌体死亡方程式菌体死亡方程式 RTE eAk / 一、温度和时间对培养基灭菌的影响 k k 发酵工程的灭菌与除菌6

49、5 n阿累尼乌斯方程式的意义： n 反应了反应速度常数k 和热致死速度常数k与灭菌 温度T的关系。以lnk(lnk )对1/T作图，可得一直线， 如图， 由此直线的斜率和截距可 分别求得E(E)和A(A)值。 一般E杀死微生物营养体 =200270kJ/mol E杀死微生物芽孢 400kJ/mol E酶或维生素分解 80kJ/mol lnK 1/T 高活化能的孢子死亡高活化能的孢子死亡 低活化能营低活化能营 养成分分解养成分分解 孢子死亡和营养成分孢子死亡和营养成分 降解中活化能影响降解中活化能影响 k k 发酵工程的灭菌与除菌66 名称E (J/mol) 叶酸 泛酸 维生素B12 维生素B1

50、 嗜热脂肪芽孢杆菌 枯草杆菌 肉毒梭状芽孢杆菌 腐败厌气菌NCA3679 70.3 87.9 96.7 92.1 283.5 318.2 346.3 303.1 部分微生物的致死活化能E和营养成分破坏的活化能E 一、温度和时间对培养基灭菌的影响 E E 发酵工程的灭菌与除菌67 n 为灭菌温度和灭菌时间的选择提供依据和指导 由 ，加热灭菌时，灭菌温度发生变 化，热致死速度常数 k 值和培养基成分分解反应速 度常数 k 值都会变化情况，当温度由T1升至T2时， 则：k1k2and k1k2 n阿累尼乌斯方程经推导得出下式： E：菌体死亡所需活化能 E：营养成分破坏所需活化能 一、温度和时间对培养

51、基灭菌的影响 RTE eAk / k1 k2 k k 发酵工程的灭菌与除菌68 n由于杀死微生物的E营养成分破坏的E ，因此， n即随温度上升，灭菌反应速度常数的增加倍数大于 培养基营养成分破坏速度常数的增加倍数。或者说， 当灭菌温度上升，微生物死亡速率大于培养基成分 破坏速率。 k1 k2 lnln k1 k2 E：菌体死亡所需活化能 E：营养成分破坏所需活化能 k1 k2 k k 一、温度和时间对培养基灭菌的影响 发酵工程的灭菌与除菌69 n温度升高对反应速度常数的影响用Q10来表示， nQ10为温度升高10时的反应速度常数与原温度时 的反应速度常数的比值。 n一般 化学反应的Q10为1.

52、52.0， 杀灭微生物营养体反应的Q10为510， 杀死细菌芽孢的反应的Q10为35左右。 n在灭菌过程中，当温度升高时，两种反应过程的 速度都在增加，但微生物死亡的速度增加值超过 培养基营养成分破坏的速度增加值。 n采用高温快速灭菌方法，既可杀死培养基中的全 部有生命的有机体，又可减少营养成分的破坏。 一、温度和时间对培养基灭菌的影响 发酵工程的灭菌与除菌70 n下表列出的是达到完全灭菌(以杀灭细菌芽孢为准) 的灭菌温度、时间和营养成分维生素B1破坏量的 比较，可以清楚地说明这一问题。 灭菌温度/ 灭菌时间/min 维生素B1破坏量/% 100 400 99.3 110 36 67 115

53、15 50 120 4 27 130 0.5 8 145 0.08 2 150 0.01 1 一、温度和时间对培养基灭菌的影响 发酵工程的灭菌与除菌71 二、影响培养基灭菌的其它因素 1、 培养基成分 n培养基中的油脂、糖类和蛋白质增加微生物的耐热性， 使微生物的热致死速率变慢，这主要是因为有机物质 会在微生物细胞外形成一层薄膜，阻碍热的传入，因 此应提高灭菌温度或延长灭菌时间。 n相反培养基中高浓度的盐类(如8%以上NaCl溶液)、色 素会减弱微生物细胞的耐热性，一般较易灭菌。 n在固形物含量高的情况下，灭菌温度要高些。 培养基成分对大肠杆菌灭菌影响 环境水10%糖液30%糖液 致死6065

54、，10min70，46min70，30min 发酵工程的灭菌与除菌72 二、影响培养基灭菌的其它因素 2、培养基的pH值 npH对微生物的耐热性影响很大。在pH6.08.0范围内微 生物最耐热，pH6.0时，氢离子极易渗入细胞内，从 而改变细胞的生理反应促进其死亡，故pH愈低，灭菌 所需的时间愈短。一般微生物生长对培养基的pH都有 一定的要求，在不允许调节pH的情况下，就要考虑适 当延长灭菌时间或提高灭菌温度。 n温度 孢子数 灭菌时间 (min) n () (个/ml) pH=6.1 5.3 5.0 4.7 4.5 n120 10000 8 7 5 3 3 n115 10000 25 25

55、16 13 13 n110 10000 70 65 35 30 24 n100 10000 740 720 180 150 150 发酵工程的灭菌与除菌73 二、影响培养基灭菌的其它因素 n3、培养基的物理状态 n培养基的物理状态对灭菌有极大的影响。 n固体培养基的灭菌时间要比液体培养基的灭菌时 间长，如果100时液体培养基的灭菌时间为1h， 同体培养基则需要23h才能达到同样的灭菌效果。 n其原因在于液体培养基灭菌时，热量传递是由传导 作用和对流作用完成的，而固体培养基只有传导作 用而没有对流作用。 n此外，液体培养基中水的传热系数要比固体有机物 质大得多。 n越浓稠的培养基灭菌所需时间越长

56、。 发酵工程的灭菌与除菌74 二、影响培养基灭菌的其它因素 n4、泡沫 n泡沫中的空气会形成隔热层，使传热困难，对灭 菌极为不利。对易产生泡沫的培养基进行灭菌时， 可加入少量消泡剂。 n5、培养基中的微生物性质与数量 n不同成分的培养基中含菌性质与量是不同的。 n培养基中微生物数量越多，达到无菌要求所需的 灭菌时间也越长。天然基质培养基，特别是营养 丰富或变质的原料中的含菌量远比化工原料的含 菌量多，因此灭菌时间要适当延长。 n含芽孢杆菌和霉菌孢子多的培养基，要适当提高 灭菌温度或延长灭菌时间。 发酵工程的灭菌与除菌75 二、影响培养基灭菌的其它因素 n6、冷空气排除情况 n高压蒸汽灭菌的关键

57、问题是为热的传导提供良好条件，而其中 最重要的是使冷空气从灭菌器中顺利排出。因为冷空气导热性 差，阻碍蒸汽接触欲灭菌物品。 n降低蒸汽分压使之不能达到应有的温度，如果灭菌器内冷空气 排除不彻底，压力表所显示的压力就不单是罐内蒸汽的压力， 还有空气的分压，罐内的实际温度低于压力表所对应的温度， 造成灭菌温度不够，检验灭菌器内空气排除度，可采用多种方 法，最好的办法是发酵罐同时装有压力表和温度计。 空气排除程度与温度的关系 蒸汽压力 罐内实际温度/ Mpa 未排除空气 排除1/3 排除1/2 排除2/3 完全排除空气 0.03 72 90 94 100 109 0.07 90 l00 105 10

58、9 115 0.1 l00 109 112 115 121 1.3 109 115 118 121 126 1.5 115 121 124 126 130 发酵工程的灭菌与除菌76 n工业生产中对于大量的培养基和发酵设备的灭菌， 最有效、最常用的方法是蒸汽灭菌(即湿热灭菌)。 n培养基的灭菌包括 n分批灭菌：将配制好的培养基输入发酵罐内，经过 间接蒸汽预热，然后直接通入饱和蒸汽加热，使培 养基和设备一起灭菌，达到要求的温度和压力后维 持一定时间，再冷却至发酵要求的温度，这一工艺 过程称为分批灭菌或实罐灭菌。 n全程包括加热、维持、冷却三个过程。 三、培养基分批灭菌三、培养基分批灭菌 分批灭菌

59、连续灭菌 发酵工程的灭菌与除菌77 搅拌桨搅拌桨 冷冷 却却 管管 发酵工程的灭菌与除菌78 n进行实罐灭菌前，通常先把空气分过滤器灭菌并用 空气吹干。将配制好的培养基送至罐内，开动搅拌 以防料液沉淀。 n加热：包括预热和升温。 n预热：培养基在搅拌状态下，排放夹套或蛇管中的 冷水，开启排气管阀，在夹套或蛇管内缓慢通入蒸 汽以预热料液，当发酵罐的温度预热至8090， 关闭夹套或蛇管蒸汽阀门。 n作用：使物料糊化、溶胀并均匀受热；减少冷凝水 的生成；减轻蒸汽流冲击发酵液产生的噪音。 n如果一开始不预热就直接导入蒸汽，由于培养基与蒸汽的温差如果一开始不预热就直接导入蒸汽，由于培养基与蒸汽的温差 过

60、大，会产生大量的冷凝水，使培养基稀释；过大，会产生大量的冷凝水，使培养基稀释； n直接导人蒸汽还容易造成泡沫急剧上升，使物料外溢。直接导人蒸汽还容易造成泡沫急剧上升，使物料外溢。 三、培养基分批灭菌三、培养基分批灭菌 发酵工程的灭菌与除菌79 n升温：培养基加热至 90，关闭夹套或蛇管 蒸汽阀门后，由 n空气进口 n取样管 n放料管 n通入蒸汽对培养基直接 加热。 n开启 n排气管阀 n进料管(补料管) n接种管排气阀 n消泡剂管 n排气。 三 路 进 汽 液面 四 路 出 汽 发酵工程的灭菌与除菌80 n保温：当发酵罐内温度升至110左右，控制进出蒸汽 阀门直至温度达121、压力为0.1MP