提取基因试剂总结与每步骤原理、作用

1、第一部分：质粒DNA提取中各种试剂的作用说明卩 细胞的裂解：* 裂解液I 50nonolA葡萄糖卩25nanol ATris-Cl （pH8. 0）召 10iranolAEDTA（pH8.欲用柱层析逬一步纯化所制备的质粒DNA,无菌的碱裂解液I在使用前可补 充以适当体积的去DNA酶的RNA酶A（20wg/nil）,使之终浓度为lOOug/ml.欲用 其他的方法纯化DNA,则不推荐在此步骤添加RNA酶。4葡萄瘾 增加瘩液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解EDTA：螯合N尹、C尹等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解多用卄裂解液II0. 2N NaOHdSDSu旳0H,核酸

2、在pH大于5、小于9的溶液中，是稳定的。但当pH12或PHH7. 5）v 30niTOL/L EDTA缓冲液a 用于洗脱（提取）和保存DNM第二部分：DNA提取中其他试剂我1. TE： Tris-HCREDTA pH 为心Tris HCL维持pH的稳定，为溶菌酶提供合适的pHd用Tri,调节至pH为&是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碗性条件下 CpH57),RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA 彳羊品6 *EDTLV (1)螯合Mg2+、62 +等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用(DNase作用时需要一定的金属离子作辅基)；2)EDTA的存在

3、， 有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的坏境。ED1A还可以螯合维持细胞壁稳定性的CQ+,使细胞壁不稳定。卩2.溶菌酶z它是糖彗水解酶.能水解菌体细胞壁的主妾化学成分駄聚糖中的 ?4,4糖昔犍，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受 到抑制 33. SDS； SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有；亠(1) 溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。“(2) 解聚细胞中的核蛋白。屮SDS能与蛋白质结合成为复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。屮 但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除 干挣，防止在下一步操作中(ffl

4、RNase去除RNA时)受到干扰4. 蛋白菌监蛋白酶K是一种非特异性、枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶， 具有很高的比活性。EDTA等鳌合剂或SDS等去垢剂不能使蛋白酶K失活， 反而增强和稳定酶活性。在组织或细胞核酸分离时，它使核酸酶(RNase和 DNase )以及反应中的其他酶类失活以及降解蛋白质。心5. 5M NaCl：沉淀DNA吋总会加入高浓度的盐如盐的目的是破坏能使蛋白质 保持稳定的两个因素，使蛋.白和DNA分离并沉淀下来而此时盐的阳离子会与 DNA结合形成DNA-阳离子盐溶于溶液中，再用无水乙醇可以将DNA-阳离子 盐沉淀下来但这样一来QNA中就含有较多的盐离子，这势必会影响下一歩

5、实 验的进行所以要用70%乙醇洗榇DNA沅淀(因为在70%乙醇里DNA是不溶 的而盐离子却可溶)用无水乙醇则达不到这个目的卩6. 酚:氯仿=异戊醇(25:24:1)酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白冰溶液与酚或氯仿混合时，蛋白 质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去,使蛋白失去水合状态而变性。经过离心, 变性蛋白质的密度比水的巒度为大，因而与水相分离，沉淀在朮相下面，从而与 溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。4 作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大, 但酚与水相有一定程度的互溶，大约10%15%旳水溶解在酚相中，因而损失

6、了这部分水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效杲好，但氯仿与水不相混 溶，不会带走DNAo所以在抽提过程中，混合使用酚与氯彷效果最好。经酣第 一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯彷是互溶的，可用氯仿第二次变性 蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯伪混合(1:1) 使用。*异戊醇：在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合 液內易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡秣产生 一股采用氯仿与异戊酵为24 1之比， 也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25i 24:1不必先配制，可在临用酣巴一份酚 加-24

7、： I的氯仿与异戊醇即成二同时异戊醇有助于分相.使离心后的上层 水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。卩7. 稀释调幣NaCl浓度（NsAg或NaCl至最塔蕭度达410.2SmoVLH在pH为&左右的榕液中QNA分子是带员电荷的,加一定鞭度的NaAc或NaCL 使N廿中和DNA分子上的负电荷.诫少DNA分子之间的同性电荷相斥力.易 于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低吋，只有部分DNA 形成DNA钠盐而聚合，遠祥就造成DNA沉淀不完全当刖入的盐溶液派度太 髙时，其数果也不奸。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA 旳酶切等反应，所以最后需要用70%的乙醇洗去多余的盐 质粒抽提时，瘩液3中含有大量的盐，所以不必另外加扯8. 仏6倍体积异丙醇用乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法令乙醇的优点.乙醇与 核酸不会起任何化学反应.对DNA很安全.因此是理想的沉淀剂。4DNA溶液是DN血以水台状态稳定存在，当加入乙醇时.如果用的是无水乙醇, 无水乙醇会夺去DNA周国的水分子，使DNA-fa离子盐失爪，DNA分子之间就 容易形成氢键而发生沉淀.一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混 合，其