细胞穿膜肽修饰的SN38前药及其siRNA共递送体系的抗肿瘤研究

1、细胞穿膜肽修饰的SN38前药及其siRNA共递送体系的抗肿瘤研 究 恶性肿瘤是全球主要的致死疾病之一 , 严重威胁人类的健康。恶性肿瘤的临 床治疗手段仍以手术和化疗为主。 但化疗药物通常具有溶解性差、毒性大、不具有靶向性等缺点 , 限制其广泛 的临床应用。本文建立了一种细胞穿膜肽（CPP修饰的自包封前体药物及其共 递送体系用于递送难溶性化疗药物。 7-乙基-10-羟基喜树碱（SN38是一种传统的抗肿瘤药物,具有广谱的抗肿 瘤活性,但由于自身的理化性质、药理学特点和毒性限制 ,使其很难应用于肿瘤的 临床治疗。本文以SN38作为模型药物，采用PEG与不同性质的CPP修饰SN38合 成SN38前体药

2、物（CPP-PEG-SN38改善其溶解性、提高细胞摄取。 这些SN38前体药物可以自组装形成胶束,聚乙二醇（PEG对CPP的电荷屏 蔽作用使这些胶束可以应用于体内抗肿瘤研究。与阳性对照伊立替康（ CPT-11 相比,这些CPP-PEG-SN3胶束在细胞摄取、体内体外抗肿瘤活性、组织分布等方 面具有显著的优势 , 并且优化出具有最优抗肿瘤活性的前体药物 （TAT-PEG-SN38 但CPP-PEG-SN3并未改善CPT-11对组织的毒性。Survivin siRNA 可以提 高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,为增强SN38靶向性、改善SN38抗肿瘤活性、 降低SN38的组织毒性,本文建立了 TAT-

3、PEG-SN3与survivin siRNA的转铁蛋白 （Tf 靶向脂质体共递送体系（ Tf-L-SN38/P/siRNA 。 Survivin siRNA 与鱼精蛋白通过静电吸附构成脂质体核心 ;磷脂与 TAT-PEG-SN3作为递送体系的中间层骨架；外层的Tf修饰为脂质体提供靶向能 力。Tf-L-SN38/P/siRNA 提高了 survivin siRNA与 TAT-PEG-SN3的抗肿瘤活性， 并且与CPT-11相比,显著降低了组织毒性。 本论文研究内容主要涉及以下几部分：1、CPP-PEG-SN3合成以PEG乍为 linker连接CPP与 SN38,合成一系列CPP-PEG-SN38

4、采用三步法合成 CPP-PEG-SN38:(1)合成5种C末端半胱氨酸修饰的 CPP,5种CPP分别为R8 P28 PFV SAP( E)和 TAT。 (2)以三光气作为酰氯化试剂，将SN38的 C10/subW羟基酰氯化后, 与0PSS-PEG2000v/sub-O8过酯键连接。(3)反应产物中加入半胱氨酸 修饰的CPP与 OPSSS团反应形成二硫键,合成CPP-PEG-SN38 CPP-PEG-SN3自组装形成胶束,粒径为124 nm到249 nm,并具有相对较低的 电位。2、CPP-PEG-SN3体外抗肿瘤活性评价通过激光共聚焦与流式细胞仪对 CPP-PEG-SN3的细胞摄取定性、定量分

5、析，CPP-PEG-SN3旳以被细胞完整地摄 取,CPP-PEG-SN38勺细胞摄取依赖 CPP的疏水性与正电荷，TAT-PEG-SN38具有最 高的细胞摄取率 , 并且具有细胞核靶向性。 采用细胞摄取抑制剂处理细胞，研究不同CPP-PEG-SN3的摄取机制，发现 CPP-PEG-SN3主要通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞。CPP-PEG-SN3的体 外抗肿瘤活性与CPP的性质密切相关,CPP-PEG-SN3啲细胞毒性与细胞摄取具有 相似的趋势，并且CPP-PEG-SN3的细胞毒性具有时间、剂量依赖特性。 在A549和MCF-7细胞中,TAT-PEG-SN38的细胞毒性分别为 SN38的4.

6、3、3.6 倍。3、CPP-PEG-SN3体内抗肿瘤活性及毒性研究通过体外溶血实验对 CPP-PEG-SN3的血液相容性进行分析，CPP-PEG-SN3并未引起溶血或者凝聚现 象, 可以通过静脉给药。 建立裸鼠A459细胞异位荷瘤模型评价CPP-PEG-SN3体内抗肿瘤活性，系列 CPP-PEG-SN3胶束均具有显著的抗肿瘤活性，TAT-PEG-SN38展现了最强的肿瘤 生长抑制效果。与对照组和 CPT-11给药组相比,TAT-PEG-SN38分别抑制73.6% 和 61.4%的肿瘤生长。 体外、体内抗肿瘤实验证明:TAT-PEG-SN38具有最优的抗肿瘤活性。通过体 重、脏器病理切片评价CP

7、P-PEG-SN3的毒性。 TAT-PEG-SN3的毒性与CPT-11相似,并未显著降低裸鼠体重。但脏器病理 切片显示TAT-PEG-SN3会对裸鼠的肝脏、小肠造成损伤,损伤程度和CPT-11相 近。 4、TAT-PEG-SN38勺药代动力学及组织分布建立血浆、 组织中TAT-PEG-SN38 SN38和CPT-11的含量分析方法,研究大鼠给药TAT-PEG-SN38口 CPT-11后的药 代动力学,CPT-11的血药浓度显著高于 TAT-PEG-SN38,TAT-PEG-SN并未展现出 抗肿瘤优势。建立裸鼠A549细胞荷瘤模型,分析TAT-PEG-SN3在裸鼠体内的组 织分布。 TAT-PE

8、G-SN3在裸鼠肿瘤内大量积累,在肿瘤组织内TAT-PEG-SN3的 AUClast 是 CPT-11 的 37.5 倍,TAT-PEG-SN38释放的游离 SN38的 AUClast是CPT-11的8.7倍。通过裸鼠活体成像进一步分析 TAT对 TAT-PEG-SN3在肿瘤内累积的影响，实验结果证明：TAT可以促进SN38在肿瘤组 织内累积 , 发挥更好的抗肿瘤活性。 5、Tf-L-SN38/P/siRNA抗肿瘤活性评价SN38是一种具有广谱抗肿瘤活性的 拓扑异构酶I (TOPI)抑制剂。然而SN38具有溶解性差、副作用强等缺点,虽 然将SN38合成TAT-PEG-SN3前体药物提高了抗肿瘤

9、活性,但与CPT-11相比并未 显著改善组织毒性。 Survivin 在肿瘤细胞高表达 ,survivin 蛋白具有抑制细胞凋亡 , 促进血管生 成等作用。Survivin siRNA可以提高肿瘤细胞对SN38的敏感性,增强SN38的抗 肿瘤活性。 本文建立了共递送survivin siRNA 与TAT-PEG-SN38勺靶向脂质体体系，以 期提高TAT-PEG-SN38勺抗肿瘤活性、降低组织毒性。Tf-L-SN38/P/siRNA的粒 径为148 nm, Z -电位为+7.8 mV。 当鱼精蛋白与survivin siRNA通过静电吸附形成脂质体核心时，脂质体具有 更好的 siRNA结合效率

10、。Tf-L-SN38/P/siRNA 可以将 survivin siRNA 与 TAT-PEG-SN3同步地、等比例地转载进入细胞，并且Tf与TAT-PEG-SN3显著增 强了 Tf-L-SN38/P/siRNA 的细胞摄取。 细胞摄取机制研究结果显示 ,Tf-L-SN38/P/siRNA 主要通过转铁蛋白受体和 网格蛋白介导的内吞途径进入细胞。MTT实验中,survivinsiRNA脂质体对HeLa 细胞的细胞毒性不显著。 在HeLa细胞中,Tf脂质体仅载药TAT-PEG-SN3时,细胞毒性是SN38的 1.25 倍；但当survivin siRNA 与TAT-PEG-SN3联合给药时，细胞

11、毒性提高至SN38的 14.56 倍。采用 Western blot 评价 Tf-L-SN38/P/siRNA 对 survivin 基因的沉默 作用。 Tf与TAT-PEG-SN3可以增加脂质体对survivin siRNA 的递送效率，与 survivin siRNA 脂质体相比较，Tf-L-SN38/P/siRNA能显著抑制HeLa细胞表达 survivin 蛋白。建立HeLa细胞裸鼠荷瘤模型评价 Tf-L-SN38/P/siRNA体内抗肿 瘤效果。 L-siRNA的抗肿瘤作用有限。Tf-L-SN38/P/siRNA具有最有效的抗肿瘤活性 与对照组相比肿瘤增长抑制率为 76.8%;与Tf-L-SN38相比,Tf-L-SN38/P/siRNA 与siRNA共同给药抑制了 33.8%的肿瘤增长；与L-SN38/P/siRNA相 比,Tf-L-SN38/P/siRNA 在Tf靶向修饰后抑制了 39.1%的肿瘤体积增长。 并且 Tf-L-SN38/P/siRN