国自然标书模板

1、国自然标书模板项目 申报学科 科学部 c c030303国家自然科学基金申请书项目名称： msc 对先天性巨结肠症肠道神经组织重建的实验研究申 请 者：所在单位：邮政编码：通讯地址：410016重庆市渝中区医学院路号电话：4传真：申请日期：62000 年 12 月国 家 自 然 科 学 基 金 委 员 会一九九七年制填 报 说 明1、 填写申请书前，请先查阅国家自然科学基金有关项目申请办 法及规定。申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达要明 确、严谨，字迹要清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达。第一 次出现的缩写词，须注出全称。2、 申请书为十六开本，复印时用 b5 复印纸，于左侧装

2、订成册。 第三页起各栏空格不够时，请自行加页。一式六份（至少一份为原件）， 由所在单位审查签署意见后，按申报学科投送国家自然科学基金委员 会对口科学部。地区科学基金项目，申请书另报送省（自治区）科委 一份原件。3、 封面右上角“科学部编号”由对口科学部填写，项目类别和 申报学科代码 1 由申请者填写。4、 下列人员不得作为申请项目的负责人提出申请，但可作为项 目组成员参加研究：在读（含在职）研究生已离退休的科研人员申请单位的兼职科研人员5、 申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请 （含参加）的项目数，连同在研的国家自然科学基金项目数（不含重 点项目、重大项目），不得超过两项。6、

3、同一项目组研究内容相近的项目，只允许报送一个学科。 七、申请者可因同类项目竞争等原因，提出不宜评议本项目的专家名单（姓名与单位， 3 人以内），密封于信封中，钉在申请书原件 封面，或另专函相关学科，供科学部选择同行评议人时参考。科学部 将对此信息保密。八、国家自然科学基金委员会通讯地址：北京市海淀区花园北路 35 号东门邮政编码： 100083摘意一、简表研究内容和1通过m s c体外培养，转化为神经干细胞，进 而基因转染，体内移植，诱导分化等方法探索 对先天性巨结肠症动物无神经节细胞段进行神 经支配重建的途径和效果。本研究的完成将采 用细胞工程原理和方法代替手术方法, 从根本要 上改进先天性

4、巨结肠症的治疗及预后，丰富临 床神经生物学的发展。主 1. 主题词数量不多于三个； 2. 主题词之 义 中 m s c 神经干细胞 先天性巨结肠症英 mesenchymal stem cell / neuronal stem cell / aganglionic bowel简 表 填 写 要 求1、 简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最新 发布的国家自然科学基金申请项目分类目录及代码为准填写。高技术探索课题主题号按高技术 新概念新构思探索课题项目指南中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写 b，并在申请书 封面右上角加注“高技术探索课题重点

5、项目”。2、 凡选择性栏目，将相应提示符 a、b 等之一填入该栏的右下角。3、 部分栏目填写要求：项目名称应确切反映研究内容和范围，最多不超过 25 个汉字 (包括标点符号）。基础研究指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。应用基础研究 指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。 申报学科申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。申请金额以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。起止年月起始时间从申请的次年 1 月算起。终止时间为完成年度的 12 月。所用实验室 系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点

6、实验室或部门批准的 开放实验室。所在单位名称及代码按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填“中科院西安光机所”或“西安光机所”。全称中的数字，一律写中文，例 如：中国航天工业总公司第七一所。首次申请国家自然科学基金的单位， 尚未编入单位代码，其代码暂不填写。参加单位数 指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位 (合作者所在单位 )，以 阿拉伯数字表示。项目组主要成员 指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作用的人员，本人应在申请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。研究内容和意义 摘要与主题词均录入软盘。2二、立论依据

7、（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析， 并附主要参考文献及出处）对基础研究，着重结合国际科学发展趋势， 论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国 民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其 应用前景。先天性巨结肠症（ hirschsprungs disease ， hd）是小儿外科领域内的一种常见性疾病，发 病率为 1/20001/5000。对 hd 临床及基础研究 一直是小儿外科研究的热点之一。此疾病的发生 是由于多种原因使胚胎期神经嵴细胞在消化道 移行受阻，结肠壁肌间神经节细胞缺如，病变结 肠痉挛收缩，肠内容物排出受阻，近端肠管继发 性扩张形成巨结肠，影响儿童健康成长

8、。自发现 hd 的病因以来，hd 的治疗主要依靠手术切除 远端无神经节细胞段，手术方式较多，由于各种 术式固有缺陷，目前仍存在各种并发症，影响3-1且此类患儿病变肠段不仅有神经节异常，尚有 肠道平滑肌，结缔组织的增生等细胞外基质变 化，单纯的神经嵴细胞移植一方面神经嵴细胞 来源受限，另一方面能否在体内改造病变肠段 的病理变化，仍需进一步研究。近年来干细胞的基因修饰治疗发展较快，国 外有人发现将表达神经营养因子的神经干细胞 直接种植于受伤的脑组织中，能促进神经功能 的恢复。神经干细胞在受到碱性成纤维细胞因 子（ fgf-2 ）和上皮细胞生长因子（ egf）刺激 时可分化出神经元和胶质细胞， eg

9、f 可维持神 经干细胞的生成， fgf-2 对干细胞的分化起重 要作用；有很多神经因子（如血小板生长因子， 转化生长因子等）对神经干细胞的分化起着协 同作用。诱导分化剂维甲酸对神经干细胞也有诱导分化作用3。对于 hd 病变肠段不仅有神经节异常，尚有肠道平滑肌，结缔组织的增生等 变化的现象，我们注意到纤溶酶原激活因子 （pa）能激活纤溶酶原，水解纤维蛋白，及细 胞外基质中的纤连蛋白 (fibronectin, fn) ，层粘 连蛋白（laminin，ln），基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase enzyme, mmp ）能分解周围 组织细胞外基质，如将 pa，mmp

10、的 cdna 转染修饰神经干细胞将有可能对 hd 病变段的 病理变化进行改造，有利于神经干细胞生长， 发育。通过探索影响神经干细胞移植，生长， 分化的分子机制，结合基因工程技术，将可为 神经干细胞移植治疗成功创造条件。鉴于神经干细胞的多向分化潜能，在大脑， 脊髓中的损伤修复研究中令人鼓舞的发现，自体造血干细胞等分化为神经干细胞可能性的提 出4 （此将为神经干细胞自体移植提供一个很 好的来源），以及神经干细胞目前被认为是一种更优于成纤维细胞的基因治疗的载体细胞5，针对上面的问题我们提出如下假说：如同神经 干细胞移植在恢复受损大脑，脊髓神经功能上 具有良好的应用前景一样，通过各种人工方法 修饰后，

11、神经干细胞移植有恢复 hd 病变肠段 的正常神经支配的可能。细胞移植虽然已被认为对于修复神经组织 是有效的治疗方法，但目前使用的细胞多取自 胚胎，这样一方面细胞来源有限，另一方面存 在异体免疫排斥作用。神经干细胞可以在体外 大量增殖，但目前主要在海马和室管膜下层发 现有神经干细胞分布，这样造成了神经干细胞来源困难。骨髓中有两类干细胞，即造血干细 胞和间充质干细胞（ mesenchymal stem cell, msc ）。前者的移植已成功用于临床治疗白血病， 但其移植需要获得足够数量的造血干细胞，并 且造血干细胞体外扩增存在困难。 msc 易于从 骨髓中分离，体外扩增简单，长期培养过程中 能保

12、持多向分化潜能。近期美国学者 woodbury 等在体外实验中成功地将源于成年大鼠及人骨 髓 msc 转化为神经干细胞 , 并进而分化为神经元 6。此研究结果很好地解决了神经干细胞来源困难的问题，为今后神经干细移植治疗多种 神经系统疾病打下了基础。总之，随着当今干细胞研究的深入，探索通 过 msc 转化为神经干细胞恢复小儿外科常见 疾病（先天性巨结肠症）正常神经支配的方法具有重要现实性及可能性。美国 时代 周刊曾将人类胚胎干细胞（ es 细胞）和胚胎生殖细胞（ eg 细胞）建系研究 成功列为 20 世纪末世界十大科技成就之首， 并认为 es 细胞和人类基因组将同时成为新世 纪最具发展和应用前景

13、的领域。由此激发了人 们对 es 细胞，骨髓干细胞，神经干细胞定向 分化的研究。将 msc,神经干细胞定向分化，移 植的研究引入到 hd 这一小儿外科常见病的治 疗研究中，探索 msc，神经干细胞克隆、定向 分化、移植对于 hd 治疗方法，可为发育生物 学积累宝贵的资料；采用细胞工程原理和方 法，通过 msc，神经干细胞移植重建 hd 病变 段的正常神经支配方法的研究成功，在临床上 将可以让 hd 患儿免于手术，使 hd 的治疗发生根本性的改观。该课题的完成除能为儿童的 健康成长做出巨大贡献，并能带动本地区整个 小儿外科水平的发展，提高本地区小儿外科在 国内及国际上的地位，为祖国西部大开发战略

14、 的顺利进行贡献力量。参考文献(1) 陈雷玲，胡廷泽，朗诗明，等。 320 例先 天性巨结肠症的诊断与治疗分析。华西医科 大学学报，2000，31(2)：274-27(2) kathryn s. embryonic stem cells used to remyelinate injured rat spinal cord neurons. lancet, 2000, 355 (9218): 1890(3) mccaffery p, drager uc. regulation of retinioc acid signaling in the embryonic nervous system:

15、 a master differentiation factor. cytokine growth factor rev. 2000, 11(3): 233-249(4) natarajan d, grigoriou m, marcos-gutierrez cv, et al. multipotential progenitors of themammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture. development, 1999,126:157-168(5) 刘平，

16、卢亦成，朱诚。中枢神经干细胞。 中华神经外科杂志。2000，16（3）：196-198(6) woodbury d, schwarz ej, prockop dj, et al. ault rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. j neurosci res, 2000, 61(4): 364-3703-3三、研究方案1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标：探索建立针对先天性巨结肠症的 msc ，神 经干细胞移植治疗方法。研究内容：1 msc 的分离，体外克隆；2 msc 向神经干细胞的转

17、化；3 多种人工修饰条件下的神经干细胞在 hd 动物模型（lethal spotted rat,）ls/ls无 神经节细胞肠段移植，定向分化；4 鉴定神经干细胞移植后 hd 动物模型 的消化道神经系统形态及机能。拟解决的关键问题：1 msc 向神经干细胞的转化；2 神经干细胞的基因修饰；42.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及 可行性分析研究方法： 无血清培养，单细胞克隆技术； mrna 差异消减显示技术；3 原位杂交；rt-pcr，免疫组化技术， 透射电镜技术；4 基因转染技术。技术路线：建立 hd 动物模型msc 的分离及体外培养msc 向神经干细胞的转化神经干细胞体外培养，克隆（v-

18、myc，egf 等多种基因转染，修饰）5-1实验方案：第一部分：建立 hd 动物大鼠参 照 文 献 进 行 大 鼠 选 育 ， 源 于 wistar-imamichi ar 系，hd 大鼠均 结肠造瘘处理。第二部分： msc 分离培养，向神经干细 胞转化1. msc 分离培养切取鼠一侧股骨，暴露骨髓腔，用注射器抽取细胞培养 液（ dmem/20 fbs ），反复多次冲 洗出骨髓细胞，用吸管反复抽吸后， ficoll 分离液离心分离出有核细细 胞，移入 t-75 培养瓶，过夜培养，第 二日将悬浮细胞移去（贴壁细胞为较 纯的基质干细胞），3-4 天更换培养液， 5-2当 细 胞 融 合 时 用 胰

19、 岛 素 /edta （trypsin/edta）处理，收获贴壁细 胞为 msc ( msc 鉴定选用 cd29， cd90，cd106 等标记)。2. msc 向神经干细胞转化 参照文献 在 msc 培养液中加入脊索中胚层浸 出液，脊索中胚层条件培养液，星形 胶质细胞上清液，多种神经生长因子 等。3. 鉴定 a. 光镜及电镜下观察转化细 胞形态改变。b. 免疫组化或流式细胞仪检测 细 胞 转 化 后 的 表 面 标 志 : nestin, 波形蛋白，rc 抗原。第三部分：神经干细胞分离提取，体外培 养，基因转染1. 神经干细胞的分离和传代分别取鼠纹状体和孕鼠皮层组织，吸管吹tm打机械分离制成

20、单细胞悬液，利用 dmem/f12(1:1) 加 b27 及 bfgf 无 血清培养基进行原代培养，具体参见 文献。2.体外基因转染对于以上两种来源的神经干细胞采用脂质体介导基因转染技术，将v-myc ， egf ，及fgf-2 ，pa，mmp cdna 重组逆转 录病毒载体导入神经干细胞，包括双 基因及单基因转染的多种形式。逆转 录病毒载体 plncxe 由中国医学科 学院分子生物学国家重点实验室提 供。e. coli 质粒 dna 大量制备、纯 化和酶切参照 sambrook 等的文献方 法进行；按 lipofectamine 试剂盒说明进行转染实验。第四部分：神经干细胞在无神经节细胞段

21、的移植，定向分化及检测1. 神经干细胞在 hd 动物模型体内移植 按多种组合形式，利用毛细显微注射 器将经多种形式基因转染的神经干 细胞注射到 hd 无神经节细胞段；参 考文献报道进行，将注射细胞浓度定 为 0.5-1 cell/ 0.5ul。2. 移植后的神经干细胞在 hd 动物体内的分化诱导维甲酸等分化诱导剂处理，药物浓度选择参考文献。3. 移植后的神经干细胞对 hd 动物模型 无神经节细胞段肠神经系统的影响 5-3检测a实验动物的处理：将实验组鼠（包 括对照组）分别于不同时期断颈处 死，如移植后 4 周，16 周，32 周。 取移植处肠组织进行检测，分别按 进行检测的项目要求对样本进行处

22、 理。光镜及电镜检测移植处组织形态 学变化。免疫组化技术：检测神经细胞特 异性烯醇化酶（ nse ）， -100 ， gafp 等表达。原位杂交， rt-pcr 检测：转染 基因的表达（v-myc，egf 等）， 原位杂交所需探针， rt-pcr 引物可分别购自中山，gibic 公司，按 说明进行实验操作。功能鉴定：直肠测压技术，生物 化学方法检测 r-氨基丁酸， p 物质 等的合成。4. 神经干细胞移植，分化的分子机制 参照文献利用 mrna 差异消减显示 技术显示以上多种形式神经干细胞 移植，分化的差异基因，进而进行分 级分段克隆。a. 神 经干细胞移植处肠段及相同部 位正常肠神经组织 r

23、na 的纯化： 利用肠道组织的剥片技术获取肠 神经组织，立即置放于液氮中，-70 保存。氯仿法提取 rna，dnase i32处理，紫外分光度计定量测定。b. rt-pcr 差异消减显示：对分别将 神经干细胞移植处肠段及相同部 位 正 常 肠 神 经 组 织 分 离 扩 增 出cdna，运用 5、端帽子引物与 3、端锚定引物，对 cdna 进行大量扩 增，正常肠神经组织用生物素标记 的 datp 和 dntps 进行 pcr 扩增， 产物进行消减杂交，用连亲和素去 除共有产物，剩下的产物由带有 a- pdatp 的 dntps 进行 pcr， 在重复差异显示，回收差异条带并 克隆。（0.4ul

24、 rna，1逆转录缓冲 液，15umol/l dntp, 10umol/l 简并引物， 65。c 5min ，37。c 温育10min，加 200u/ulmomulv 反转录酶，37。c 温育 50min，95 。c 温育 5min，pcr，消减杂交，过柱 子，pcr，消减杂交，ta 克隆盒 进行 dna 克隆，按说明进行，及 进行测序，基因鉴定等）。5. 结合步骤 3 的检测结果再进行神经干细胞的基因转染 外基因转染。同第三部份的体6. 获得神经干细胞基因转染，移植，分 化，重建 hd 正常神经支配的方案 重复步骤 1；2；3；4，反复调整。第五部分：统计分析各实验组间的数据以 均数标准差表

25、示，用 f 检验，t 检验，多因素方差分析进行多组及组间统计学处理，p 值小于 0.05 为差异显著。可行性分析：(1) msc 分离，体外培养，本课题组已经完 成。(2) 本课题组已前期进行了 msc 转化为神 经干细胞的实验，同时成功进行了体内 神经干细胞的分离并获得了国家自然科 学基金支助（编号 30070382）。(3) 神经干细胞移植为当今各国神经细胞工 程研究重点，大量的研究文献报道了神 经干细胞分离，培养的方法。(4) 较其它一些干细胞研究不同，神经干细 胞有明确的免疫标记。(5) 在临床及研究中对大量先天性巨结肠症 进行了观察，有多篇相关文献发表。(6) 课题组已成功进行了神经

26、干细胞的分离 培养与鉴定，及成人骨髓 msc 体外扩增 和定向诱导分化为骨和软骨细胞。5-43本项目的创新之处（1） 以往对神经干细胞移植的研究主要局 于中枢神经系统及脊髓损伤修复方面， 虽然有类似于神经干细胞的神经嵴细 胞修复肠神经节缺如的文章报道，但神 经干细胞移植修复肠神经节缺如尚未 见报道。（2） 首次提出 msc 转化为神经干细胞后， 移植分化修复 hd 正常神经支配可能。4. 年度研究计划及预测进展（1）2002 年 1 月2002 年 12 月构建 hd 动物模型及初步完成 msc 分 离，体外培养，及向神经干细胞转化。（2） 2003 年 1 月2003 年 12 月完成神经干

27、细胞的各种基因转染实验， 初步完成 hd 动物模型的无神经节细胞6四、研究基础1. 与本项目有关的研究工作积累和已取得的 研究工作成绩（1） 本项目的提出源于课题组对先天性巨 结肠症长期的临床及基础研究，既往主要 将注意力集中在手术方法的改进，病理生 理学变化观察上，已有多篇相关文章发表。（2） 本课题组对多个年龄组的正常个体及 先天性巨结肠症患者进行了神经节发育观 测，并对人巨细胞病毒与先天性巨结肠症 的关系进行了研究。（3） 对数百例先天性巨结肠症患者进行了 诊治，有较丰富的临床经验。（4） 已成功地建立了神经干细胞的培养。（5） 本课题组成员已进行了 msc 转化为 神经干细胞的实验，并

28、获得了国家自然科 学基金资助（编号 30070382）。（6） 本课题组较熟练地掌握了基因转染技 术，效果优良。7-17 细胞培养全套设备8 荧光分光光度计9 紫外分光光度计10 lkb 电泳仪器11 低温超速离心机12 超低温冰箱，低温冰柜13 超声细胞粉碎仪14 去离子水发生器15 分子生物学实验常用设备 动物实验检测维持设施17 二氧化碳孵箱18 其他辅助设备19 其它本次实验需要，但缺少的设 备，如 dna 测序分析仪等可通过测序 公司解决或联系国家干细胞研究重点 实验室解决。7-2 申 请者和项目组主要成员的学历和研究 工作简历，近期已发表与本项目有关的主要 论著目录 * 和获得学术

29、奖励情况及在本项目 中承担的任务；青年科学基金申请者还应注 明学位论文名称及导师姓名与工作单位* 论文：作者题目刊名年份卷（期）页目 （万码专著：作者书名出版者年份 8-18-3五、经费预算支 出 科 金 额 计 算 根 据 及 理 由 1. 合 计 21.31科研业 3.5资料费 0.5 资料检索及查新等 学术交流 1.0 发表论文等 成果鉴定 2.02实验材 16.8实验动物 2.1 wistar-imamichi ar 系选育 生物试剂 3.5 nestin ，及 v-myc ， egf ， 多种消耗 3.3引物合成 2.3cdna 测序 2.5多种生长3项目组 1.0注: 预算支出科目按下列顺序填写: 1. 科研业务费2. 实验材料费3. 仪器设备费4. 实验室改装费5. 协作费6. 项目组织实施费。开支范围详见国家自然科学基金资助项目财务管理办法第二章。9六、申请者正在承担的其它研究项目（攀登计划、863 计划、攻关任务和各部委、 省市任务等