慢性疼痛基因治疗的研究现状和展望

1、q慢性疼痛的概念与机制慢性疼痛的概念与机制 q慢性疼痛的基因治疗的研究慢性疼痛的基因治疗的研究 慢性疼痛的概念与机制慢性疼痛的概念与机制 慢性疼痛慢性疼痛 不同直径的初级传入神经元不同直径的初级传入神经元 伤害刺激和其感受器特异性激活后产生的疼痛信号经过不同的初伤害刺激和其感受器特异性激活后产生的疼痛信号经过不同的初 级传入神经传到不同区域的脊髓背角。初级传入神经元有不同的直径，级传入神经传到不同区域的脊髓背角。初级传入神经元有不同的直径， 根据直径的大小可分为三大类，分别传递不同的信息。根据直径的大小可分为三大类，分别传递不同的信息。 初级传入神经元初级传入神经元 本体觉轻触觉本体觉轻触觉

2、定位明确的伤害性刺激定位明确的伤害性刺激 定位模糊的伤害性刺激定位模糊的伤害性刺激 脊髓背角脊髓背角 背根神经节背根神经节 脊髓丘脑束脊髓丘脑束 大脑皮层产生感知定位大脑皮层产生感知定位 内源性镇痛系统：内源性镇痛系统： 1、下行抑制旁路：、下行抑制旁路： 5HT; 去甲肾上腺去甲肾上腺 素纤维素纤维对传导疼痛对传导疼痛 的上行旁路有一定的上行旁路有一定 抑制作用。抑制作用。 2、内源性吗啡肽：、内源性吗啡肽： 内啡肽和脑啡肽内啡肽和脑啡肽等等 与上行旁路突触周与上行旁路突触周 围的阿片受体结合，围的阿片受体结合， 阻断兴奋性递质的阻断兴奋性递质的 释放，降低痛觉。释放，降低痛觉。 外周敏化外

3、周敏化 癌症（癌症（WHO统计）统计） 全球年新发癌症患者1000万， 40%伴有不同程度的疼痛； 60%90%的晚期癌症患者 有不同程度的疼痛，70%以疼 痛为主要症状 全世界至少有500万人忍受 着癌症疼痛的折磨 我国每年癌症新发病人数约 有180万，其中62伴有疼痛 非甾体抗炎药（非甾体抗炎药（NSAIDNSAID） 潜在的心血管风险潜在的心血管风险 阿片类药物阿片类药物 耐受与戒断耐受与戒断 指在末梢的脑、脊神经（或神经指在末梢的脑、脊神经（或神经 节）、交感神经节等神经内或神经节）、交感神经节等神经内或神经 旁注入药物或以手术物理方法阻断旁注入药物或以手术物理方法阻断 神经传导功能神

4、经传导功能 通过放置硬膜外电极，提供电刺激作用通过放置硬膜外电极，提供电刺激作用 于脊髓后根称脊髓刺激（于脊髓后根称脊髓刺激（Spinal Cord Spinal Cord StimulationStimulation，SCSSCS） 虽然虽然使用这些药物和方法确实能产使用这些药物和方法确实能产 生好的镇痛效果，但伴随而来的是一些生好的镇痛效果，但伴随而来的是一些 令人忧虑的副作用令人忧虑的副作用 传统药物治疗传统药物治疗基因治疗基因治疗 优优 点点 使用方便 效果明确 可多次反复使用，但易发生 不良反应 一次应用可长时间镇 痛，作用效果可维持 数十天，甚至数月 缺缺 点点 应用剂量大或多次使

5、用后将 产生戒断症状、耐受、药物 依赖（成瘾）等副作用。 少见，多是轻微的感 冒样症状 慢性疼痛的基因治疗的研究慢性疼痛的基因治疗的研究 基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作 用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠 正基因的缺陷，从而达到治疗疾病目的的生正基因的缺陷，从而达到治疗疾病目的的生 物医学新技术。物医学新技术。 DNA DNA 疾病疾病 q基因治疗的靶细胞主要分为两大类：体基因治疗的靶细胞主要分为两大类：体 细胞和生殖细胞。细胞和生殖细胞。 q目前开展的基因治疗只限于体细胞。基目前开展的基因治疗只限于体细胞。基

6、 因治疗目前主要是治疗那些对人类健康因治疗目前主要是治疗那些对人类健康 威胁严重的疾病。包括：遗传病（如血威胁严重的疾病。包括：遗传病（如血 友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血 症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染 性疾病（如性疾病（如AIDSAIDS、类风湿等）。、类风湿等）。 19891989年年 美国美国RosenbergRosenberg等经美国等经美国FDAFDA批准，进批准，进 行了标志基因转移到人体的首次临床行了标志基因转移到人体的首次临床 试验。试验。 19901990年年1111月月 美国美国NIHNIH的的B

7、leaseBlease，CulverCulver和和AndersonAnderson 进行了首例人体基因治疗的临床试验，进行了首例人体基因治疗的临床试验， 并取得了巨大的成功。并取得了巨大的成功。 基因治疗在经历了准备期、狂热期后，从基因治疗在经历了准备期、狂热期后，从19961996年进入了理性年进入了理性 期。美国成立了三个研究基因导入系统与载体的研究机构期。美国成立了三个研究基因导入系统与载体的研究机构 ； 从从1996 1996 年至今，全世界的基因治疗临床方案增加了数倍，参加年至今，全世界的基因治疗临床方案增加了数倍，参加 治疗的病人数也有相应增加。从投资来看，除国家投资外，企治疗的

8、病人数也有相应增加。从投资来看，除国家投资外，企 业界的热情有增无减，目前每年的总投资在业界的热情有增无减，目前每年的总投资在2020亿美元左右。这亿美元左右。这 些都说明基因治疗研究已经以稳健的步伐跨入了二十一世纪！些都说明基因治疗研究已经以稳健的步伐跨入了二十一世纪！ 迄今共有迄今共有10201020个方案个方案 进入临床试验。其中进入临床试验。其中 方案主要集中在美洲方案主要集中在美洲 和欧洲，各有和欧洲，各有682682和和 288288个。个。 美国最多，有美国最多，有669669个个 方案。我国数量较少，方案。我国数量较少， 仅有仅有3 3个方案。个方案。 针对癌症的治疗仍是针对癌

9、症的治疗仍是 基因治疗的首选目标，基因治疗的首选目标， 但其所占比重相对于但其所占比重相对于 19961996年的统计已经有年的统计已经有 所下降。所下降。 基因治疗临床方案基因治疗临床方案 采用的基因导入系统采用的基因导入系统 目前在基因治疗中所采用的基因转导系统主要有反转目前在基因治疗中所采用的基因转导系统主要有反转 录病毒载体、腺病毒载体、裸录病毒载体、腺病毒载体、裸DNADNA、脂质体和腺相关病脂质体和腺相关病 毒载体等，其中腺病毒载体和反转录病毒载体占绝大毒载体等，其中腺病毒载体和反转录病毒载体占绝大 部分，分别有部分，分别有 260 260和和261261个方案采用，而腺相关病毒载

10、个方案采用，而腺相关病毒载 体只有体只有2727个，可能是由于腺相关病毒的生产仍有待突个，可能是由于腺相关病毒的生产仍有待突 破。破。 治疗基因治疗基因 选择主要集中于抗体、肿瘤抑制剂和细胞因子三个方面。选择主要集中于抗体、肿瘤抑制剂和细胞因子三个方面。 基因基因 治疗治疗 基因导 入系统 基因表达 的可控性 治疗效果 明确的基因 单次治疗持续时间显著延长单次治疗持续时间显著延长 内源性基因产物不易耐受成瘾内源性基因产物不易耐受成瘾 产物对正常神经系统功能影响小产物对正常神经系统功能影响小 利用基因重组技术将一些抗痛基因、调控因子基因利用基因重组技术将一些抗痛基因、调控因子基因 及受体基因等外

11、源基因插入载体基因组，加上启动及受体基因等外源基因插入载体基因组，加上启动 子，导入神经细胞，促进抗痛基因的表达。子，导入神经细胞，促进抗痛基因的表达。 降低神经系统内源性疼痛分子的表达，目前基因治降低神经系统内源性疼痛分子的表达，目前基因治 疗中常用的疗中常用的knockdownknockdown技术有反义寡核苷酸技术技术有反义寡核苷酸技术 ( (antisense oligonucleotide,as0DN)antisense oligonucleotide,as0DN)和和RNARNA干扰干扰 ( (RNAi)RNAi)。 已克隆ORL孤啡肽 ？未克隆内吗啡肽 已克隆强啡肽 已克隆 -

12、内 啡 肽 已克隆脑啡肽 是一类能够促进特定神是一类能够促进特定神 经组织细胞分化、再生，刺激神经递质释放并经组织细胞分化、再生，刺激神经递质释放并 且能改变神经元特性的蛋白分子，包括且能改变神经元特性的蛋白分子，包括NT3NT3、 NT4NT4、 BDNF BDNF、NGFNGF等。主要是通过抑制神经元凋等。主要是通过抑制神经元凋 亡和促进阿片肽释放治疗疼痛，适用于神经损亡和促进阿片肽释放治疗疼痛，适用于神经损 伤或中毒导致的慢性神经痛。伤或中毒导致的慢性神经痛。 IL-2IL-2和和IL-10IL-10。其中其中 前者主要通过类阿片肽作用，后者通过抑制神前者主要通过类阿片肽作用，后者通过抑

13、制神 经组织炎症反应达到镇痛目的。经组织炎症反应达到镇痛目的。 F19991999年，年，Eaton M JEaton M J 等将前脑啡肽原基因构建到等将前脑啡肽原基因构建到 第一代人单纯疱疹病毒基因组中，通过小鼠足底皮第一代人单纯疱疹病毒基因组中，通过小鼠足底皮 肤注射感染脊髓后角神经元，高效表达的脑啡肽明肤注射感染脊髓后角神经元，高效表达的脑啡肽明 显抑制小鼠的冷热刺激痛阈，治疗持续时间达显抑制小鼠的冷热刺激痛阈，治疗持续时间达3 3个个 月。月。 F20012001年，年，Braz JBraz J等报导用前脑啡肽原基因治疗关等报导用前脑啡肽原基因治疗关 节炎性痛模型。节炎性痛模型。 F

14、20032003年，年，Goss J RGoss J R 等报导重复注射这种基因治等报导重复注射这种基因治 疗系统治疗慢性神经痛模型，并无明显的耐受发生。疗系统治疗慢性神经痛模型，并无明显的耐受发生。 F19951995年年Beutle A S.Beutle A S.等将小鼠神经生长因子前导等将小鼠神经生长因子前导 肽与肽与内啡肽编码基因的融合，以逆转录病毒内啡肽编码基因的融合，以逆转录病毒 为载体转染为载体转染NIH3T3 NIH3T3 细胞，培养基中可检测到高细胞，培养基中可检测到高 浓度的浓度的内啡肽内啡肽 F19991999年年Alan A. FinegoldAlan A. Fineg

15、old等等 采用这种融合基因采用这种融合基因 重组的非增殖型腺病毒，大鼠脑脊液内注射后，重组的非增殖型腺病毒，大鼠脑脊液内注射后， 三天后脑脊液中的三天后脑脊液中的内啡肽的浓度达到正常大鼠内啡肽的浓度达到正常大鼠 和人脑脊液中和人脑脊液中内啡肽浓度的内啡肽浓度的10-2010-20倍，能够有效倍，能够有效 地抑制炎性痛觉过敏地抑制炎性痛觉过敏 F20032003年，我们构建携带这种融合基因的腺病毒，年，我们构建携带这种融合基因的腺病毒， 观察到对大鼠坐骨神经痛具有显著的镇痛效果观察到对大鼠坐骨神经痛具有显著的镇痛效果 0 0 100100 200200 300300 400400 500500

16、 600600 700700 800800 900900 注药前注药前1天1天3天3天7天7天14天14天21天21天28天28天35天35天 大鼠CSF内-EP含量(pg/ml)大鼠CSF内-EP含量(pg/ml) Ad-NEP组Ad-NEP组Ad-GFP组Ad-GFP组 0 0 3 3 6 6 9 9 1212 1515 0 07 71414212128283535 测定时间测定时间(天天) 大鼠术侧足热痛阈(秒)大鼠术侧足热痛阈(秒) Ad-NEP组Ad-NEP组吗啡组吗啡组Ad-GFP组Ad-GFP组生理盐水组生理盐水组 F 单纯疱疹病毒：神经毒性大单纯疱疹病毒：神经毒性大 F 腺相关

17、病毒：制备困难，装载容量小，起效慢腺相关病毒：制备困难，装载容量小，起效慢 F 逆转录病毒：不能感染非分裂细胞，致畸、成瘤逆转录病毒：不能感染非分裂细胞，致畸、成瘤 F 腺病毒：安全、易制备，宿主范围广，可感染处腺病毒：安全、易制备，宿主范围广，可感染处 于不同于不同 周期的细胞周期的细胞 F 细胞载体、脂质体、裸细胞载体、脂质体、裸DNADNA、真核表达载体等真核表达载体等 基因载体系统基因载体系统 病毒载体系统病毒载体系统非病毒载体系统非病毒载体系统 腺病毒载体腺病毒载体 反转录病毒载体反转录病毒载体 腺相关病毒载体腺相关病毒载体 单纯疱疹病毒载体单纯疱疹病毒载体 慢病毒载体慢病毒载体 裸

18、裸DNA DNA DNA-DNA-阳离子脂质复合物 阳离子脂质复合物 DNA-DNA-蛋白质复合物 蛋白质复合物 细胞内包装细胞内包装细胞外包装细胞外包装 DNA-DNA-阳离子多聚物 阳离子多聚物 DNA/RNADNA/RNA嵌合物 嵌合物 优点：优点：1 1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； 2 2、复杂的装配过程由细胞完成；、复杂的装配过程由细胞完成； 3 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点、不同的病毒载体具有不同的表达特点。 细胞毒性细胞毒性 染色体毒性染色体毒性 免疫毒性免疫毒性 存在的问题存在的问题1 1、安全性、安全性 2

19、2、靶向性、靶向性 3 3、有效性、有效性 转导靶向性转导靶向性 转录靶向性转录靶向性 转导效率转导效率 基因表达水平和持续时间基因表达水平和持续时间 表达的可调控性表达的可调控性 双链双链DNADNA病毒，优点是能感染分裂和非病毒，优点是能感染分裂和非 分裂细胞，高滴度制备容易，对人体的分裂细胞，高滴度制备容易，对人体的 毒害作用轻微。缺点是免疫源性强，目毒害作用轻微。缺点是免疫源性强，目 的基因表达时间短。的基因表达时间短。 腺病毒结构腺病毒结构 腺病毒基因组示意图腺病毒基因组示意图 1)1) 安全安全 2)2) 宿主范围广宿主范围广 3) 3) 感染性强感染性强 4) 4) 人类蛋白可获

20、得高水平表达人类蛋白可获得高水平表达 5) 5) 稳定性比较好稳定性比较好 6) 6) 易于制备与纯化易于制备与纯化 7) 7) 制备的病毒滴度高制备的病毒滴度高 8) 8) 可通过多种方式到达中枢神经系统可通过多种方式到达中枢神经系统 1) ) 载体容量有限（约载体容量有限（约8kb)8kb) 2) 2)宿主强烈的免疫反应和细胞毒性宿主强烈的免疫反应和细胞毒性 3) 3) 基因表达时间短暂基因表达时间短暂 F剔除病毒基因组，保留包装所需基因组分，获得的二三代腺病 毒的免疫源性将显著降低，能有效延长目的基因的时效。 F通过外壳蛋白改造，使病毒对特异组织的亲和力不断提高,有效 保证转基因的效率。

21、 F利用整合病毒如AAV和逆转录病毒的相关元件与腺病毒基因组重 组构建的嵌合病毒，有效整合人体染色体，保证目的基因的长期 表达 第一代：缺失的腺病毒基因片段是第一代：缺失的腺病毒基因片段是E1E1和和/ /或或E3E3区，区， 属于一类复制缺陷、非辅助病毒依赖型载体属于一类复制缺陷、非辅助病毒依赖型载体 第二代：在第一代的基础上，用温敏突变子控制第二代：在第一代的基础上，用温敏突变子控制E2AE2A 基因产物基因产物DBPDBP的表达，进一步缺失的表达，进一步缺失E2E2区和区和/ /或或E4E4 第三代：即第三代：即Gutless Vector, mini-AdGutless Vector,

22、 mini-Ad，仅含有病仅含有病 毒毒DNADNA两端的反向末端重复序列，中间夹有两端的反向末端重复序列，中间夹有 transgenetransgene，但至今仍处于研制阶段但至今仍处于研制阶段 TR TR Transgene cassette 基基 因因 组组 Ref：Packer M et al., J Refract Surg. 2002 Nov-Dec;18(6):692-6 v继承了第一代腺继承了第一代腺 病毒载体的优点病毒载体的优点 v可装载容量大大可装载容量大大 增加增加(36(36Kb)Kb) v机体免疫反应和机体免疫反应和 细胞毒性降低细胞毒性降低 v表达时间延长表达时间延

23、长 优点：优点： 生物学特性：生物学特性： 微小病毒科，优点是有效整合宿主细胞染色体，可同时表达多微小病毒科，优点是有效整合宿主细胞染色体，可同时表达多 个目的基因，免疫反应轻，转基因表达时间长达个目的基因，免疫反应轻，转基因表达时间长达6个月以上。个月以上。 缺点是插入区小，最大只能插入缺点是插入区小，最大只能插入4-5Kb的片段，制备时需要辅助的片段，制备时需要辅助 病毒，易含有野毒，而且高滴度制备困难。整合基因可能导致宿病毒，易含有野毒，而且高滴度制备困难。整合基因可能导致宿 主基因突变从而引起癌变主基因突变从而引起癌变 研究方向：研究方向： 高滴度和高纯度制备技术高滴度和高纯度制备技术

24、 F制备嵌合病毒制备嵌合病毒 F长期基因治疗安全性长期基因治疗安全性 腺相关病毒包装过程示意图腺相关病毒包装过程示意图 host cell Helper virus Packaging plasmid rep cap Vector plasmid 单 纯 疱 疹 病 毒单 纯 疱 疹 病 毒 生物学特性：生物学特性： 双链双链DNA病毒，最大的优点是嗜神经性，外周皮肤或粘膜转染病毒，最大的优点是嗜神经性，外周皮肤或粘膜转染 该病毒后，感染神经末梢，通过轴突运输机制进入神经元胞浆。该病毒后，感染神经末梢，通过轴突运输机制进入神经元胞浆。 缺点是神经毒性大，病毒蛋白可以导致神经元裂解。缺点是神经毒

25、性大，病毒蛋白可以导致神经元裂解。 研究方向：研究方向： F多多IE（即刻早期）基因剔除株（即刻早期）基因剔除株（ICP4-：ICP22-：ICP27-） 的制备，这种复制缺陷病毒的毒性和免疫源性比单基因剔除株的制备，这种复制缺陷病毒的毒性和免疫源性比单基因剔除株 弱，而神经亲和力并不受影响。弱，而神经亲和力并不受影响。 F利用疱疹病毒的潜伏期启动子作为基因表达启动子，可以获得利用疱疹病毒的潜伏期启动子作为基因表达启动子，可以获得 长效表达长效表达 逆转录病毒：逆转录病毒： 第一种应用于临床病人治疗的病毒就是逆转录病毒，用于第一种应用于临床病人治疗的病毒就是逆转录病毒，用于ADA缺乏导致缺乏导

26、致 的先天性免疫缺陷病人。逆转录病毒的一个缺点是病毒不能感染非分裂的先天性免疫缺陷病人。逆转录病毒的一个缺点是病毒不能感染非分裂 细胞如神经元细胞，此外它的整合是随机，并不能作到定点整合，因细胞如神经元细胞，此外它的整合是随机，并不能作到定点整合，因 此，有可能受到基因组的干扰而出现转染沉默现象此，有可能受到基因组的干扰而出现转染沉默现象 。 艾滋病病毒：艾滋病病毒：属于慢病毒类，转基因表达时间长。属于慢病毒类，转基因表达时间长。 动物病毒：动物病毒： 某些动物病毒经过改造后，人体对其不产生免疫应答，从而获得长效某些动物病毒经过改造后，人体对其不产生免疫应答，从而获得长效 基因表达基因表达 非

27、 病 毒 载 体 简 介非 病 毒 载 体 简 介 细胞载体：细胞载体： 最早的细胞移植载体选用的是人的或牛的肾上腺嗜铬细胞，依靠嗜最早的细胞移植载体选用的是人的或牛的肾上腺嗜铬细胞，依靠嗜 铬细胞本身具有分泌儿茶酚胺类物质。铬细胞本身具有分泌儿茶酚胺类物质。 以后发展了采用不死细胞作为载体，通过基因克隆技术使这种细胞以后发展了采用不死细胞作为载体，通过基因克隆技术使这种细胞 可以分泌阿片肽、可以分泌阿片肽、GABA或儿茶酚胺。或儿茶酚胺。 考虑到宿主抗外源细胞免疫反应对细胞移植的影响，采用生物材料考虑到宿主抗外源细胞免疫反应对细胞移植的影响，采用生物材料 将细胞微囊化，将细胞的抗原隐蔽起来，

28、降低了免疫反应的程度。将细胞微囊化，将细胞的抗原隐蔽起来，降低了免疫反应的程度。 脂质体、基因枪、真核表达载体等：脂质体、基因枪、真核表达载体等： 共同的特点是基因转染效率低下共同的特点是基因转染效率低下 ： 优点优点 低毒、低免疫反应、外源基因整合几低毒、低免疫反应、外源基因整合几 率低、无基因插入片断大小限制，以及率低、无基因插入片断大小限制，以及 使用简单、制备方便、便于保存和检验使用简单、制备方便、便于保存和检验 缺点缺点 导入效率低，且无靶向性导入效率低，且无靶向性 概念概念 将一些特殊细胞将一些特殊细胞 植入到受者的中枢神植入到受者的中枢神 经系统，通过这些类经系统，通过这些类 似

29、于似于“生物微泵生物微泵” （bio-minipumpbio-minipump）的的 细胞持续分泌镇痛物细胞持续分泌镇痛物 质而缓解疼痛或提高质而缓解疼痛或提高 痛阈。痛阈。 细胞载体细胞载体 主要手段主要手段 将一些特殊的细胞（如嗜铬细胞等）移将一些特殊的细胞（如嗜铬细胞等）移 植于中枢神经系统的疼痛调控靶位，移植于中枢神经系统的疼痛调控靶位，移 植的细胞如同一个植的细胞如同一个“分泌泵分泌泵”，可以持，可以持 续地分泌具有镇痛作用的活性物质续地分泌具有镇痛作用的活性物质 细胞来源细胞来源 来源于肾上腺髓质的嗜铬细胞和经基因来源于肾上腺髓质的嗜铬细胞和经基因 工程改造或修饰过的其它各类细胞工

30、程改造或修饰过的其它各类细胞 把分离纯化好的嗜铬细胞注射到腰段蛛把分离纯化好的嗜铬细胞注射到腰段蛛 网膜下腔，发现有助于改善神经痛模型的网膜下腔，发现有助于改善神经痛模型的 大鼠以及皮下注射福尔马林的炎性痛模型大鼠以及皮下注射福尔马林的炎性痛模型 的大鼠的痛行为的大鼠的痛行为 国内利用海藻酸钠国内利用海藻酸钠- -多聚赖氨酸多聚赖氨酸- -海藻酸海藻酸 钠微胶囊包裹纯化的牛嗜铬细胞进行大鼠钠微胶囊包裹纯化的牛嗜铬细胞进行大鼠 蛛网膜下腔移植，取得了良好的实验结果蛛网膜下腔移植，取得了良好的实验结果 存在的问题存在的问题 细胞来源较少、体外培养难以获得较高的细胞浓细胞来源较少、体外培养难以获得较

31、高的细胞浓 度、细胞分泌镇痛物质的量及其存活时间和安全性度、细胞分泌镇痛物质的量及其存活时间和安全性 较为有限较为有限 解决方法解决方法 生物细胞永生化和去永生化技术生物细胞永生化和去永生化技术 建系细胞和基因工程修饰细胞的建立建系细胞和基因工程修饰细胞的建立 是利用基因转移技术将外源性的永生是利用基因转移技术将外源性的永生 化基因如猿病毒化基因如猿病毒4040大大T T抗原（抗原（SV40TagSV40Tag）转转 入到靶细胞或稳定整合到靶细胞基因组中，入到靶细胞或稳定整合到靶细胞基因组中， 获得稳定表达的转化细胞，从增殖危机中获得稳定表达的转化细胞，从增殖危机中 逃逸，从而获得类似癌细胞的

32、无限增殖能逃逸，从而获得类似癌细胞的无限增殖能 力，进而建立永生化细胞株。力，进而建立永生化细胞株。 在获得具有分裂活性而又无复制衰老在获得具有分裂活性而又无复制衰老 的原代永生化细胞后，通过的原代永生化细胞后，通过Cre-loxPCre-loxP重组重组 酶系统将两翼酶系统将两翼“锚定锚定”有有loxPloxP序列（序列（LoxP-LoxP- FlankedFlanked）位点的位点的SV40TagSV40Tag基因定向敲除，基因定向敲除， 使细胞去永生化使细胞去永生化, ,从而消除致瘤性，此技术从而消除致瘤性，此技术 又称为又称为“可塑性永生化可塑性永生化”。这一系统意味。这一系统意味 着

33、可通过这一着可通过这一“基因开关基因开关”有目的地控制有目的地控制 基因的表达。基因的表达。 采用基因工程修饰技术建立具有表达采用基因工程修饰技术建立具有表达 人脑啡肤的永生化和可诱导去永生化的神人脑啡肤的永生化和可诱导去永生化的神 经前体细胞系是细胞镇痛中细胞来源的最经前体细胞系是细胞镇痛中细胞来源的最 理想的选择。因其植入受者的蛛网膜下腔理想的选择。因其植入受者的蛛网膜下腔 具有多分化潜能、较好的稳定性、可控性、具有多分化潜能、较好的稳定性、可控性、 安全性以及组织相容性和长时间表达镇痛安全性以及组织相容性和长时间表达镇痛 蛋白的效果。蛋白的效果。 反 义 核 苷 酸反 义 核 苷 酸 是

34、指能够通过碱基互补与靶是指能够通过碱基互补与靶RNA（主要是主要是mRNA）特异结特异结 合，抑制靶合，抑制靶RNA的功能，从而控制其表达的一类小分子转录物。的功能，从而控制其表达的一类小分子转录物。 因此，它是通过下调某种基因产物来发挥作用。因此，它是通过下调某种基因产物来发挥作用。 F在复制水平上，作为在复制水平上，作为DNA复制的抑制因子，与引物复制的抑制因子，与引物RNA前体结前体结 合，合， 抑制抑制DNA的复制的复制 F转录水平上与转录水平上与mRNA 5端结合阻断转录进行。端结合阻断转录进行。 F在翻译水平上与在翻译水平上与mRNA编码区（主要是起始密码）或非翻译区结合，编码区（

35、主要是起始密码）或非翻译区结合， 直接或间接抑制翻译。直接或间接抑制翻译。 F影响前影响前mRNA的剪接或阻止的剪接或阻止mRNA的成熟和转运。的成熟和转运。 F与与mRNA结合，促进结合，促进mRNA的降解。的降解。 主要是参与痛觉传导的中枢神经递主要是参与痛觉传导的中枢神经递 质的受体或蛋白的编码基因，这些基质的受体或蛋白的编码基因，这些基 因的产物直接或间接导致慢性疼痛病因的产物直接或间接导致慢性疼痛病 人神经元的高敏现象。人神经元的高敏现象。 FPKC-y 蛋白蛋白 FNMDA 受体受体 F外周钠通道蛋白外周钠通道蛋白 F大麻醇受体大麻醇受体 F乙酰胆碱乙酰胆碱M型和型和N型受体型受体

36、 F神经激肽（神经激肽（NK）1受体受体 FP物质受体（物质受体（SPR） 反义核苷酸的优点和不足反义核苷酸的优点和不足 F基因克隆简单：片断小，一般为基因克隆简单：片断小，一般为1530bp，可以用可以用DNA自自 动合成仪大量合成动合成仪大量合成 F抑制靶基因的效率高：一个反义分子可以促进多个抑制靶基因的效率高：一个反义分子可以促进多个mRNA的的 降解，同时在细胞中能够自我扩增，放大抑制效应。降解，同时在细胞中能够自我扩增，放大抑制效应。 F在体细胞内不稳定，容易被核酸酶消化在体细胞内不稳定，容易被核酸酶消化 F非特异性结合：容易与非互补链结合或与其他小分子物质非特异性结合：容易与非互补

37、链结合或与其他小分子物质 如蛋白结合如蛋白结合 F降解产物对细胞的增殖或分化有抑制作用降解产物对细胞的增殖或分化有抑制作用 R N AR N A 干 扰 （干 扰 （ R N A iR N A i ） 双链双链RNA对基因表达的阻断作用对基因表达的阻断作用 通过一种小片段干扰性双链通过一种小片段干扰性双链RNA作为效应分子催化与靶基作为效应分子催化与靶基 因因mRNA结合的级联反应而减少结合的级联反应而减少mRNA的含量，实际上就是通的含量，实际上就是通 过细胞过细胞內內的的PCR反应大量扩增干扰性反应大量扩增干扰性RNA干扰目的基因的表达。干扰目的基因的表达。 主要通过正义链干扰。主要通过正

38、义链干扰。 非脊椎动物如线虫，果蝇，以及植物中的应用已经取得了非脊椎动物如线虫，果蝇，以及植物中的应用已经取得了 很多重要的成果，但在哺乳动物中的应用还处于起步阶段，在很多重要的成果，但在哺乳动物中的应用还处于起步阶段，在 哺乳动物身上还没有成功的实验报道。哺乳动物身上还没有成功的实验报道。 转染基因后细胞能够高效、特异、长期的表达产物转染基因后细胞能够高效、特异、长期的表达产物 F改造转基因载体：剔除即刻早期基因组；改造外改造转基因载体：剔除即刻早期基因组；改造外 壳蛋白，提高对宿主细胞的亲和力。壳蛋白，提高对宿主细胞的亲和力。 F选用特殊基因调控元件：选用高效启动子或神经元选用特殊基因调控

39、元件：选用高效启动子或神经元 特异启动子，增加转染基因在神经元细胞内的表达特异启动子，增加转染基因在神经元细胞内的表达 F抑制宿主免疫反应：神经系统内主要是抑制细胞免抑制宿主免疫反应：神经系统内主要是抑制细胞免 疫反应疫反应 在多种细胞内都能高效促进基因表达，不具有细胞在多种细胞内都能高效促进基因表达，不具有细胞 选择性，因此，在载体不能进入神经元胞浆内时，只选择性，因此，在载体不能进入神经元胞浆内时，只 能通过周边细胞以旁分泌形式表达产物。例如能通过周边细胞以旁分泌形式表达产物。例如RCMVRCMV和和 HCMVHCMV启动子启动子 只能在特异的细胞只能在特异的细胞內內如神经元内启动基因表达

40、，如神经元内启动基因表达， 在外周组织内不表达，以自分泌形式发挥作用。例如在外周组织内不表达，以自分泌形式发挥作用。例如 人人synapsin-1 synapsin-1 基因启动子，大鼠特异烯醇酶基因启动子，大鼠特异烯醇酶( (NSE)NSE)启启 动子，神经元特异的沉默子元件（动子，神经元特异的沉默子元件（NRSEsNRSEs） 通过药物诱导启动子功能达到调控基因表达的目通过药物诱导启动子功能达到调控基因表达的目 的。目前常用的有四环素（的。目前常用的有四环素（Tet on/offTet on/off）系统、利福系统、利福 平调控系统等。平调控系统等。 病毒载体都具有一定的神经毒性，特别是单

41、纯疱病毒载体都具有一定的神经毒性，特别是单纯疱 疹病毒，腺病毒的毒性主要通过激发细胞免疫反应疹病毒，腺病毒的毒性主要通过激发细胞免疫反应 造成炎性浸润，腺相关病毒的安全性最高，非病毒造成炎性浸润，腺相关病毒的安全性最高，非病毒 载体一般无毒。载体一般无毒。 过量表达的基因产物可能造成神经功能的损害，过量表达的基因产物可能造成神经功能的损害， 例如过量的阿片肽可能导致呼吸抑制和成瘾，而反例如过量的阿片肽可能导致呼吸抑制和成瘾，而反 义核苷酸能否干扰正常感觉传导等都需要进一步研义核苷酸能否干扰正常感觉传导等都需要进一步研 究究 目前肿瘤基因治疗中以目前肿瘤基因治疗中以onyx015onyx015为

42、金标准，而为金标准，而 疼痛基因治疗没有可以作为实验对照的标准，疼痛基因治疗没有可以作为实验对照的标准， 因此，实验的可靠性不足。因此，实验的可靠性不足。 目前疼痛学机制研究未取得突破，造成目的目前疼痛学机制研究未取得突破，造成目的 基因的多样化，而模拟这些基因产物的药物治基因的多样化，而模拟这些基因产物的药物治 疗无效的病人，基因治疗可能效果不佳。疗无效的病人，基因治疗可能效果不佳。 遗传性疾病和肿瘤的基因治疗的临床实验已遗传性疾病和肿瘤的基因治疗的临床实验已 经广为报导，而疼痛基因治疗尚处于动物实验经广为报导，而疼痛基因治疗尚处于动物实验 阶段。阶段。 需要多学科合作。而掌握核心技术的部门

43、对需要多学科合作。而掌握核心技术的部门对 疼痛治疗往往不了解或不感兴趣。疼痛治疗往往不了解或不感兴趣。 开发无免疫原性、可控性、神经元特异性、开发无免疫原性、可控性、神经元特异性、 长期表达、高效而方便转染的理想载体长期表达、高效而方便转染的理想载体 加大疼痛学机理研究，鉴定和克隆具有强加大疼痛学机理研究，鉴定和克隆具有强 效镇痛作用的基因效镇痛作用的基因 建立疼痛基因治疗产品的疗效标准和参照建立疼痛基因治疗产品的疗效标准和参照 系统系统 我们在意识到我们在意识到 慢性疼痛基因治慢性疼痛基因治 疗的必要性后，疗的必要性后， 更加把研究的中更加把研究的中 心调整到相关领心调整到相关领 域。除了目

44、前所域。除了目前所 进行的研究之外，进行的研究之外， 我们还研究了进我们还研究了进 一步的开发计划。一步的开发计划。 项目项目 序号序号 研研 究究 内内 容容 1.1.表达调控因子对转基因治疗物质表达的作用表达调控因子对转基因治疗物质表达的作用 2.2.表达增强序列表达增强序列( (DNA)DNA)对转基因表达的影响对转基因表达的影响 3.3.第三代复制缺陷型腺病毒载体在慢性疼痛基因第三代复制缺陷型腺病毒载体在慢性疼痛基因 治疗中的应用治疗中的应用 4.4.可定位整合型腺相关病毒载体在疼痛治疗中的可定位整合型腺相关病毒载体在疼痛治疗中的 应用应用 5.5.内内吗吗啡肽基因在慢性疼痛基因治疗中

45、应用啡肽基因在慢性疼痛基因治疗中应用 6.6.基因转导载体在在慢性疼痛基因治疗中安全性基因转导载体在在慢性疼痛基因治疗中安全性 的研究的研究 7.7.基因转导载体规模化生产的研究基因转导载体规模化生产的研究 8.8.疼痛基因治疗的临床期研究疼痛基因治疗的临床期研究 随着生物治疗技术的发展以及慢性疼痛随着生物治疗技术的发展以及慢性疼痛 机制研究的深入，基因治疗有望成为继药物机制研究的深入，基因治疗有望成为继药物 治疗，局部神经阻滞，手术治疗，中医药治治疗，局部神经阻滞，手术治疗，中医药治 疗后的第五种治疗手段，为难治性顽固性疼疗后的第五种治疗手段，为难治性顽固性疼 痛的患者带来福音。痛的患者带来福音。 传统药物治疗传统药物治疗基因治疗基因治疗 优优 点点 使用