最全面猪副嗜血杆菌新兽药证书材料

1、副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条 临 床 试 验 申 请 材 料中国农业科学院兰州兽医研究所中农威特生物科技股份有限公司二零一五年八月二十日一、研制单位基本情况及生物安全防范条件二、 一 般 性 资 料诊断制品名称【通用名】副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条【商品名】 无【英文名】Colloidal Gold Strip for Haemophilus parasuis Antibody 【汉语拼音】Fuzhushixueganjunbing Kangti Jiance Shizhitiao关于“副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条”不侵权的保证书农业部兽医局、农业部兽药评审中心：中国农业科学院兰州兽医研究所和

2、中农威特生物科技股份有限公司联合研制的“副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条”所用的制备方法、生产工艺和流程等均属于自己的科研成果。本次临床试验申请遵守兽药管理条例、兽药注册办法、兽药注册资料要求和农业部第1704号等规定，所提交的相关资料、样品均真实、来源合法，未侵犯他人的权益。如查有不实之处，我们承担由此导致的一切法律后果。 中国农业科学院兰州兽医研究所中农威特生物科技股份有限公司 2015年8月20日副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条制造及检验试行规程（草案）抗原系采用分子克隆技术获得副猪嗜血杆菌OppA基因，利用原核表达系统得到OppA重组蛋白，经镍离子亲和层析纯化后，作为检测线，制备的兔抗PrG抗

3、体作为质控线，金标抗原为市售PrG蛋白，利用免疫层析胶体金标记技术制成副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条，用于间接血凝试验检测副猪嗜血杆菌抗体。阳性血清系用副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原经免疫健康家兔制成；阴性血清系采集健康猪血清制成。用于副猪嗜血杆菌病间接血凝试验对照。1 菌种 1.1 制造抗原用菌种为DE3-HPS-OppA工程菌株，由中国农业科学院兰州兽医研究所构建、鉴定、保管和供应。1.2 菌种标准1.2.1 形态 菌体为革兰氏阴性无芽孢的直杆菌，两端钝圆，散在成对。1.2.2 培养特性 本菌株为兼性厌氧菌，在普通培养基上生长良好，最佳生长温度为37，pH值7.27.4。在含50 ug/m

4、L 卡那霉素的LB琼脂平板上（附注3），经37培养1216小时，菌落为圆形凸起、光滑、湿润、半透明、灰白色、边缘整齐、直径约1 mm的小菌落。1.2.3 生化特性 按伯杰细菌鉴定手册进行操作，本菌能发酵多种碳水化合物并产酸产气；可迅速发酵乳糖和山梨醇；吲哚和甲基红试验均为阳性，VP和枸橼酸盐试验均为阴性。1.2.4 菌种鉴定1.2.4.1 菌种的增殖培养和诱导表达 用接种环钓取适量保存菌种在LB琼脂平板（含50 ug/mL卡那霉素）上划线，37培养12小时，作为一级种子。将一级种子（单菌落）接种于3 mL的LB培养基（含50 ug/mL卡那霉素）中，37培养10小时，作为生产用种子。 取生产用

5、菌种，按培养基总体积的1%的量接种到LB培养基（含50 ug/mL卡那霉素）中，37，220转/分振荡培养3小时左右，至OD600为0.5，于16降温1.5小时，加终浓度为0.1 mM IPTG，16，220转/分诱导16小时收集菌液进行鉴定。1.2.4.2 重组表达质粒的酶切和PCR鉴定 取1 mL菌液，按常规方法提取质粒，用EcoR和Xho双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物，应出现1638 bp的片段。取1 l重组质粒作模板，以上游引物OppA-F和下游引物OppA-R引物（10 pmol）各1 l进行PCR扩增，应获得1638 bp左右的扩增片段。上游引物OppA-F：5-GGCGAAT

6、TCATGCAAACAACCTTTACC-3；下游引物OppA-R：5-CCCTCGAGTTACTGCTTAATGATATA-3。1.2.4.3 重组表达质粒的测序 用pET-30a(+)载体上的T7通用引物测定重组表达质粒的插入序列。所得核苷酸序列的大小应为1638 bp，与Nagasaki原始参考序列（GenBank登录号：KJ778031）的OppA蛋白氨基酸同源性应为100%，且读码框正确。 1.2.4.4 菌种诱导表达产物的SDS-PAGE电泳鉴定各取1 mL诱导表达和未诱导表达的菌液，置1.5 mL离心管，12000转/分离心2分钟后，用PBS（0.01 mol/L，pH值7.2）

7、重悬菌体，洗涤两次后用100 l PBS（0.01 mol/L，pH值7.2）重悬，加入等体积的2SDS上样缓冲液，混匀，水浴煮沸5分钟，用12%的分离胶进行SDS-PAGE电泳，诱导表达菌应出现66.8 kDa的目的蛋白条带。1.2.5 表达OppA重组蛋白的特异性鉴定按常规方法，表达产物经SDS-PAGE电泳蛋白带转移至硝酸纤维素膜上，分别与115型副猪嗜血杆菌标准阳性血清、Nagasaki感染猪血清、健康猪血清进行Western blot鉴定。应与115型副猪嗜血杆菌标准阳性血清、Nagasaki感染猪血清发生特异性反应，而与健康猪血清不反应。1.2.6 OppA重组蛋白表达量检验 各取

8、1 mL诱导表达和未诱导表达的菌液，12000转/分离心2分钟，收集菌体，用PBS（0.01 mol/L，pH值7.2）重悬菌体，洗涤两次后用100 l PBS（0.01 mol/L，pH值7.2）重悬，加入等体积的2SDS上样缓冲液，混匀，水浴煮沸5分钟，用12%的分离胶进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后，经紫外凝胶成像仪薄层扫描检测，与未诱导的对照相比，诱导表达菌应出现66.8 kDa的目的蛋白条带，表达蛋白量不低于菌体总蛋白的20%；称量计算菌体湿重，每100 mL菌液中OppA重组蛋白含量不低于50 mg；用镍离子亲和层析方法纯化OppA重组蛋白，用紫外分光光度计测定OppA重

9、组蛋白抗原浓度，每100 mL菌液可获得的纯化OppA重组蛋白含量不低于1.0 mg。1.2.7 纯粹检验 用LB琼脂平板（含50ug/mL卡那霉素），按现行中国兽药典附录进行检验，应纯粹。1.2.8 基础种子代次 9代以内。1.2.9 菌种保存 甘油菌液-70以下保存，保存期为24个月。2 抗原及抗体制造及半成品检验2.1 抗原制造2.1.1 OppA重组蛋白原核表达菌液的制备 用接种环钓取适量保存菌种在LB琼脂平板（含50 ug/mL卡那霉素）上划线，37培养12小时，作为一级种子。将一级种子（单菌落）接种于3 mL的LB培养基（含50 ug/mL卡那霉素）中，37培养10小时，作为生产用

10、种子。取生产用菌种，按培养基总体积的1%的量接种到LB培养基（含50 ug/mL卡那霉素）中，37，220转/分振荡培养3小时左右，至OD600为0.5，于16降温1.5小时，加终浓度为0.1 mM IPTG，16，220转/分诱导16小时后收集菌体。2.1.2 OppA重组蛋白的提取与纯化 将菌液4 4000转/分离心5分钟，用PBS（0.01 mol/L，pH值7.2）离心洗涤两次后，收集菌体用1/10培养液体积的PBS（0.01mol/L，pH值7.2）重悬，冰上超声30分钟裂解菌体（超声2秒，间隔2秒），4 12000转/分离心15分钟收集上清。用镍离子亲和层析方法纯化OppA重组蛋白

11、。先将Ni-NTA His Bind Resin（南京金斯瑞）装入空层析柱，让液体靠重力作用自然滴出后，层析柱用10倍NTA体积的平衡Buffer（附注3）洗涤，然后将上述上清样品加到层析柱中，冰上结合30分钟然后让其流出；层析柱用5倍平衡Buffer洗涤，最后用5倍NTA体积的NTA-60洗脱Buffer（附注3）进行洗脱，收集洗脱液，经过滤除菌，用紫外分光光度计测蛋白浓度，应不低于1.0 mg/mL，分装冻存备用。2.2 兔抗PrG蛋白多抗的制备2.2.1 兔抗PrG抗体的制备 PrG蛋白为市购产品。浓度为5mg/mL。弗氏完全佐剂抗原和不完全佐剂抗原的配制弗氏完全佐剂抗原：弗氏完全佐剂（

12、Sigma，USA）3 mL加PrG 1.2mg再加生理盐水至6mL。弗氏不完全佐剂抗原：弗氏不完全佐剂（Sigma，USA）3 mL加PrG 1.2mg再加生理盐水至6 mL。上述佐剂抗原均在免疫接种前配制，并充分混合乳化。2.2.2 免疫程序 取上述充分乳化的弗氏完全佐剂抗原，于每只兔两后腿足部皮下，腘淋巴结处及背部皮下多点接种，接种总量为2 mL，14日后仍以上述抗原和剂量由背部皮下多点接种，进行第二次免疫；11日后，以上述弗氏不完全佐剂抗原，由每只兔肩部肌肉两点，背部皮下多点接种，接种总量为2 mL，为其第三次免疫。2.2.3 试血 714日后由耳缘静脉采血分离血清，以IHA试验试血，

13、若免疫兔血清IHA效价达1:128或以上，则正式采血。如免疫兔血清效价偏低，可按第三次的剂量和免疫途径再进行一次加强免疫，714日再进行试血，如免疫兔血清效价达到要求，可按前述方法制备高免血清。否则弃之。2.2.4 兔抗PrG多抗IgG纯化取20ml血清，加生理盐水20ml，再逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液10ml，使成20%（NH4）2SO4饱和溶液，边加边搅拌。4静置30min，4000rpm，4离心20min，弃沉淀，上清液中再加入（NH4）2SO4饱和溶液30ml，使成50%（NH4）2SO4饱和溶液，充分混合。4静置30min，4000rpm，4离心20min，弃上清，沉淀中加2

14、0ml生理盐水，振荡溶解。再加（NH4）2SO4饱和溶液10ml，使成33%（NH4）2SO4饱和溶液，充分混合，4静置30min；4000rpm，4离心20min，弃上清，除去白蛋白，并重复2-3次。10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋，在常水中4透析过夜，再在生理盐水中4透析24h，中间换液数次，以1%BaCl2检查透析液中的SO42-，直至无SO42-为止。4000rpm，4离心20min去沉淀，上清液即为粗提IgG。粗提IgG过常规DEAE-纤维素层析柱，以0.01mol/L pH7.2 PBS液洗脱，收集洗脱液。将洗脱液装入透析袋中，埋入PEG3500，4过夜透析。收集浓缩液，分装1

15、mL小管，-70保存备用。2.2.5 纯化IgG浓度用分光光度法（按中国兽药典），测定纯化IgG蛋白的260nm和280nm波长的吸收度，根据下列公式计算抗原浓度：蛋白浓度（mg/ml）=1.45A2800.74A260IgG蛋白浓度应不低于4.0mg/ml。2.2.5.2胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法（Bassab C,et al.2001）制备胶体金，步骤如下：0.01%氯金酸水溶液100ml加热至沸腾；不断搅动加入柠檬酸三钠，使终浓度为0.65%，轻轻摇匀，继续煮沸15min；胶体金溶液的颜色由蓝变紫，再由紫变红，冷却后蒸馏水定容至初始体积。透射电镜观察金颗粒的形态大小、均匀度、分散。

16、检测D523nm吸收值确定胶体金浓度。2.2.5.3金标抗原的制备2.2.5.4 金标抗原PrG的来源 PrG为市售产品，购于北京博胜经纬科技有限公司。2.2.5.5 胶体金的制备按最佳标记量加入PrG蛋白，混合均匀，室温下电磁搅拌30min；加入5%BSA至终浓度为1%，室温下再搅拌20min；4，2000rpm离心10min，弃沉淀；小心吸去上清液，0.02mol/L pH7.2的PBS洗涤沉淀物两次，4，12000rpm离心，所得沉淀用胶体金0.02mol/L pH7.2的PBS回复体积，制成胶体金标记物。4保存。2.3 试纸条的制备取制备的OPPA蛋白，用0.02mol/L pH7.2

17、的PBS稀释为0.5mg/mL。制备的多抗IgG，用0.02mol/L pH7.2的PBS稀释为0.9mg/mL。制备的金标抗原适量（依制备成品试纸条量测算）。取玻璃纤维纸，用喷膜机按15L/cm将金标PrG喷涂于玻璃纤维纸上，室温干燥，制成金标垫；在20mm300mm 硝酸纤维（NC）膜上，用喷膜机横向线状以1.0L/cm喷涂OPPA纯化抗原，形成检测带。间隔8mm，以1.0L/cm横向线状喷涂多抗IgG，形成质控带。用含10%BSA的0.02mol/L pH7.2的PBS对喷涂的NC膜进行封闭、洗脱，室温晾干；在PVC底板上分别将洁净的玻璃纤维纸制成的样品垫、包被有检测带和质控带的NC膜、

18、金标垫和吸水纸制成的吸收垫，按下图装配（各部分重叠约12mm），按纵向剪切，裁成宽为4.8mm的条状成品，即为副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条。2.4 半成品检验2.4.1 敏感性检测当阳性血清稀释倍数为11024,该稀释度以及低于该稀释度均为阳性。阴性对照均不显色。2.4.2 特异性检测检测15种标准血清型HPS阳性血清（15份）、健康猪血清、大肠杆菌BL21(DE3)阳性血清、猪链球菌2型阳性血清、猪巴氏杆菌阳性血清、猪肺炎支原体阳性血清、猪胸膜肺炎放线杆菌1型阳性血清。其中仅阳性血清的检测带显色，而所有阴性结果检测带不显色。表明副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条的特异性良好。2.4.3 试纸条组装

19、副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条装入PVC试纸卡内，卡表面的C对应试纸条的质控带，T对应检测带，S为样品孔。用力扣紧上下嵌槽，和干燥剂一同装入铝箔袋内，1卡/袋，封口，帖签。将每20个独立包装的试纸卡，配以使用说明书，组装成副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条盒。3 成品检验3.1 外观与性状外装白色或微黄色PVC试纸卡，长7cm，宽2cm，厚0.5cm。正面一大一小椭圆孔，外露NC膜面和样品垫面呈白色，平整；卡上标有“C”、“T”和“S”字样；外包装 铝箔袋，无破损。3.2 敏感性测定当阳性血清稀释倍数为11024,该稀释度以及低于该稀释度均为阳性。阴性对照均不显色。3.3 特异性测定检测15种标准血清

20、型HPS阳性血清（15份）、健康猪血清、大肠杆菌BL21(DE3)阳性血清、猪链球菌2型阳性血清、猪巴氏杆菌阳性血清、猪肺炎支原体阳性血清、猪胸膜肺炎放线杆菌1型阳性血清。其中仅阳性血清的检测带显色，而所有阴性结果检测带不显色。表明副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条的特异性良好。4 作用与用途用于副猪嗜血杆菌病血清抗体检测。5 用法与判定取待检样品70L加入试纸条样品孔（S孔），当液体全部浸湿NC膜后，1020min内观察结果。结果判定：T检测带和C质控带都出现清晰可见的红色条带，判为阳性；只有C质控带出现清晰可见的红色条带，判为阴性；C质控带出现一条清晰可见的红色条带，而在T检测带出现一条颜色很浅

21、、若隐若现的红色条带，判为可疑；若C质控带不出现红色条带，判为无效。6 注意事项6.1 确保试纸条密封，干燥保存，严防受潮和冰冻；6.2 严格按使用说明操作，特别注意控制标明的时间。由于层析膜在湿润时显色相对清晰，同时固相的免疫学反应需要一定时间，因此从样品液体全部浸湿硝酸纤维素膜记时。7 贮藏试纸条在28避光，干燥密封贮存，有效期9个月。8 规格试纸条1卡/袋，20袋/盒，可检测20份样品。附录：1 阴、阳性血清的制备及检验标准1.1 阳性血清的制备及检验标准1.1.1 材料与方法1.1.1.1 制造用动物 选用2 kg左右的健康雄性家兔。1.1.1.2 免疫原制备 按规程（草案）抗原部分2

22、.1制备纯化的OppA重组蛋白抗原。使用紫外分光光度计测定 OppA重组蛋白抗原浓度。稀释至0.5 mg/mL备用。1.1.1.3 弗氏完全和不完全佐剂抗原的配置弗氏完全佐剂抗原：弗氏完全佐剂（Sigma，USA）3 mL加抗原3 mL。弗氏不完全佐剂抗原：弗氏不完全佐剂（Sigma，USA）3 mL加抗原3 mL。上述佐剂抗原均在免疫接种前配制，并充分混合乳化。1.1.1.4 免疫程序取上述充分乳化的弗氏完全佐剂抗原，于每只兔两后腿足部皮下，腘淋巴结处及背部皮下多点接种，接种总量为2 mL，14日后仍以上述抗原和剂量由背部皮下多点接种，进行第二次免疫；11日后，以上述弗氏不完全佐剂抗原，由每

23、只兔肩部肌肉两点，背部皮下多点接种，接种总量为2 mL，为其第三次免疫。1.1.1.5 试血714日后由耳缘静脉采血分离血清，以IHA试验试血，若免疫兔血清IHA效价1:128，则正式采血。如免疫兔血清效价偏低，可按第三次的剂量和免疫途径再进行一次加强免疫，714日再进行试血，如免疫兔血清效价达到要求，可按前述方法制备高免血清。否则弃之。1.1.1.6 制备血清 待免疫血清效价合格后，可从颈动脉大量无菌采集血液，分离血清，在血清中加入0.04柳硫汞防腐，56灭活30分钟，0.45 m滤膜过滤除菌。无菌分装，每瓶1 mL，置-20保存。1.1.2 血清检验及标准1.1.2.1 性状 淡黄色或淡红

24、色透明液体，有时有少量悬浮物。1.1.2.2 效价测定 间接血凝进行测定，血清效价应1:128。 1.1.3 作用与用途：用于副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条阳性对照。1.2 阴性血清的制备与检验标准1.2.1 材料与方法1.2.1.1 制造用动物 选取4周龄健康仔猪，用Biochek公司副猪嗜血杆菌抗体ELISA 检测试剂盒检测抗体阴性。1.2.1.2 血清制造 无菌由颈动脉采血，用自然凝结法无菌分离血清。在血清中加入0.04柳硫汞防腐，56灭活30分钟，0.45 m滤膜过滤除菌。无菌分装，每瓶1 mL，置-20保存。1.2.2 血清检验及标准1.2.2.1 性状 淡黄色或淡红色透明液体，有时有

25、少量悬浮物。1.2.2.2 效价测定 间接血凝进行测定，血清效价应1:2。 1.2.3 作用与用途：用于副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条阴性对照。2. 特异性检验用血清的制备及检验标准2.1 115型副猪嗜血杆菌标准阳性血清的制备及标准2.1.1 材料与方法2.1.1.1 菌种 115型副猪嗜血杆菌标准菌株，由澳大利亚昆士兰州动物健康研究所Pat Blackall博士惠赠，中国农业科学院兰州兽医研究所鉴定保存。2.1.1.2 制造用动物 选用2 kg左右的健康雄性家兔。2.1.1.3 免疫原制备 分别取冻干的115型副猪嗜血杆菌标准菌株，划线接种含0.1%NAD和10%新生牛血清的TSA平板，置3

26、7、5%CO2培养48小时后，挑取单个菌落，接种于含0.1%NAD和10%新生牛血清的的TSB培养基中，置37培养箱培养24小时左右，取培养菌液均匀涂布含0.1%NAD和10%新生牛血清的TSA平板，置37培养箱培养2448小时，待平板上细菌均匀生长密布，用含0.2%福尔马林溶液的PBS（0.01 mol/L，pH值7.2）洗涤平板，37过夜灭活后，4000转/分离心15分钟，再用灭菌的PBS（0.01 mol/L，pH值7.2）洗涤2次，稀释菌液浓度，使OD600值约为1，分成2份备用。2.1.1.4 弗氏完全佐剂抗原和弗氏不完全佐剂抗原的配制弗氏完全佐剂抗原：弗氏完全佐剂（Sigma，US

27、A）3 mL加抗原3 mL。弗氏不完全佐剂抗原：弗氏不完全佐剂（Sigma，USA）3 mL加抗原3 mL。上述佐剂抗原均在免疫接种前配制，并充分混合乳化。2.1.1.5 免疫程序 取上述充分乳化的弗氏完全佐剂抗原，于每只兔两后腿足部皮下，腘淋巴结处及背部皮下多点接种，接种总量为1.5 mL，14日后仍以上述抗原和剂量由背部皮下多点接种，进行第二次免疫；11日后，以上述弗氏不完全佐剂抗原3 mL，由每只背部皮下多点接种，进行第三次免疫，第三次免疫11日后以相应菌株新鲜培养物0.5 mL（使OD600值约为1）用PBS（0.01 mol/L，pH值7.2）洗涤2次后，于每只兔子耳静脉注射，以加强

28、免疫，间隔2日，连续静注5次。2.1.1.6 试血 最后一次静注714日后由耳缘静脉采血分离血清，以IHA法试血，若免疫兔血清IHA效价达1:128及以上，同时采用热稳定抗原利用琼脂扩散试验检测抗体，若出现明显沉淀线则正式采血。如免疫兔血清效价偏低，可按第三次的剂量和免疫途径再进行一次加强免疫，714日再进行试血，如免疫兔血清效价达到要求，可按前述方法制备高免血清。否则弃之。2.1.1.7 制备血清 待免疫血清效价合格后，可从颈动脉大量无菌采集血液，分离血清，在血清中加入0.04柳硫汞防腐，56灭活30分钟，0.45 m滤膜过滤除菌。无菌分装，每瓶1 mL，置-20保存。2.1.2 血清检验及

29、标准2.1.2.1 性状 淡黄色或淡红色透明液体，有时有少量悬浮物。2.1.2.2 效价测定 与副猪嗜血杆菌病间接血凝试验抗原作间接血凝试验，效价应1:128。 2.1.3 作用与用途：用于副猪嗜血杆菌病间接血凝试验抗原特异性检验。2.2 健康猪血清的制备及标准2.2.1 材料与方法2.2.1.1 制造用动物 选取4周龄健康仔猪，用Biochek副猪嗜血杆菌抗体ELISA 检测试剂盒检测抗体阴性。2.2.1.2 试血 由前腔静脉采血分离血清，与副猪嗜血杆菌病间接血凝试验抗原进行反应，若效价1:2，则正式采血。2.2.1.3 制备血清 可从颈动脉大量无菌采集血液，分离血清，在血清中加入0.04柳

30、硫汞防腐，56灭活30分钟，0.45 m滤膜过滤除菌。无菌分装，每瓶1 mL，置-20保存。2.2.2 血清检验及标准 2.2.2.1 性状 淡黄色或淡红色透明液体，有时有少量悬浮物。2.2.2.2 效价测定 与副猪嗜血杆菌病间接血凝试验抗原进行间接血凝试验，效价应1:2。 2.2.3 作用与用途：用于副猪嗜血杆菌病间接血凝试验抗原特异性检验。2.3 大肠杆菌BL21(DE3)阳性血清的制备及标准2.3.1 材料与方法2.3.1.1 菌种 大肠杆菌BL21(DE3)菌株，由中国农业科学院兰州兽医研究所保存。2.3.1.2 制造用动物 选用4周龄健康仔猪，经微量凝集反应检测为阴性。2.3.1.3

31、 免疫原制备 将pET-30a空载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，转化菌涂布于LB琼脂平板（含50 ug/mL卡那霉素），37过夜培养。挑取单菌落接入5 mL LB培养基（含50 ug/mL卡那霉素）中，37，220转/分振荡培养12小时。按1%的接种量逐渐放大培养至5000 mL菌液，37，220转/分振荡培养至OD600为0.5，于16降温1.5小时，加终浓度为0.1 mM IPTG，16，220转/分诱导16小时。离心收集菌体，用终浓度为0.2%甲醛灭活，经检验合格后，在28条件下用PBS（0.01mol/L，pH值7.2）4000 转/分离心洗涤3次，制成浓缩抗原，用紫外分

32、光光度计测定菌体蛋白，将抗原蛋白浓度稀释至1 mg/mL，与等量的ISA206佐剂混合充分乳化后作为免疫原。 2.3.1.4 免疫程序 取上述充分乳化的免疫原3 mL，颈部肌肉注射一次，14日后，以同样剂量加强免疫一次。2.3.1.5 试血 免疫后21日，耳缘静脉采集血液分离血清，用微量凝集反应测定血清效价，若免疫血清效价达到1:64，则正式采血。3.3.1.6 制备血清 待免疫血清效价合格后，可从颈动脉大量无菌采集血液，分离血清，在血清中加入0.04柳硫汞防腐，56灭活30分钟，0.45 m滤膜过滤除菌。无菌分装，每瓶1 mL，置-20保存。2.3.2 血清检验及标准2.3.2.1 性状 淡

33、黄色或淡红色透明液体，有时有少量悬浮物。2.3.2.2 效价测定 用微量凝集反应检测，效价应不低于1:64。 2.3.3 作用与用途：用于副猪嗜血杆菌病间接血凝试验抗原特异性检验。2.4 猪链球菌2型阳性血清的制备及标准2.4.1 材料与方法2.4.1.1 菌种 猪链球菌2型TS株，由中国农业科学院兰州兽医研究所保存。2.4.1.2 制造用动物 选用4周龄健康仔猪，用猪链球菌2型试管凝集试验检测抗体阴性，猪链球菌2型PCR试验检测抗原为阴性。2.4.1.3 免疫原制备 将猪链球菌2型TS株接种在绵羊血平板，37培养24小时，挑取单菌落接种含10%犊牛血清的THB培养基，37培养24小时，然后吸

34、取1 mL培养菌液，接种含10%的犊牛血清的THB液体培养基中扩大培养并进行活菌计数，计数后用终浓度为0.4%甲醛灭活，经检验合格后，浓缩至3.0109 CFU/mL，第一次加入等量完全弗氏佐剂乳化后作为免疫原；第二次和第三次加入等量不完全弗氏佐剂乳化后作为免疫原；第四次免疫不加佐剂，直接用浓缩的灭活菌液作为免疫原。2.4.1.4 免疫程序 颈部肌肉注射三次，第一次2 mL，第二次4 mL，第三次6 mL，第四次静脉注射3 mL，每次免疫间隔2周。2.4.1.5 试血 第四次免疫后10日采血，用试管凝集试验检测抗体效价，若效价达到1:4以上，可采血。2.4.1.6 制备血清 待免疫血清效价合格

35、后，可从颈动脉大量无菌采集血液，分离血清，在血清中加入0.04柳硫汞防腐，56灭活30分钟，0.45 m滤膜过滤除菌。无菌分装，每瓶1 mL，置-20保存。2.4.2 血清检验及标准2.4.2.1 性状 淡黄色或淡红色透明液体，有时有少量悬浮物。2.4.2.2 效价检验 用试管凝集试验检测，效价应不低于1:4。2.4.3 作用与用途：用于副猪嗜血杆菌病间接血凝试验抗原特异性检验。2.5 猪巴氏杆菌阳性血清的制备及标准2.5.1 材料与方法2.5.1.1 菌种 猪巴氏杆菌SZ株（B群），由中国农业科学院兰州兽医研究所分离鉴定保存。2.5.1.2 制造用动物 选用2 kg左右健康雄性家兔。2.5.

36、1.3 免疫原制备 将猪巴氏杆菌SZ株冻干菌种接种含5%小牛血清的TSA平板，37培养20小时左右。挑取典型菌落接种于5 mL的5%的小牛血清的TSB液体培养基中，37振荡培养24小时，然后吸取1 mL培养菌液，扩大培养并进行活菌计数，计数后用终浓度为0.3%甲醛灭活，经检验合格后，浓缩至3.0109 CFU/mL。2.5.1.4 弗氏完全佐剂抗原的配制 弗氏完全佐剂抗原：弗氏完全佐剂（Sigma，USA）3 mL加抗原3 mL。弗氏不完全佐剂抗原：弗氏不完全佐剂（Sigma，USA）3 mL加抗原3 mL。上述佐剂抗原均在免疫接种前配制，并充分混合乳化。2.5.1.5 免疫程序 取上述充分乳

37、化的弗氏完全佐剂抗原，于每只兔两后腿足部皮下，帼淋巴结处及背部皮下多点接种，接种量为1.5 mL，14天后仍以上述抗原和剂量由背部皮下多点接种，进行第二次免疫；隔11日后，以上述弗氏不完全佐剂抗原，由每只兔肩部肌肉2点，背部皮下多点接种，接种剂量为3 mL，为其第三次免疫；11日后，取前述制备好的不含佐剂抗原由每只兔耳静脉注射0.5 mL，进行第四次高免。2.5.1.6 试血 最后一次免疫后14日，耳缘静脉采集血液分离血清，用琼脂扩散试验测定血清效价，若免疫血清达到1:4，则正式采血。 2.5.1.7 制备血清 待免疫血清效价合格后，可从颈动脉大量无菌采集血液，分离血清，在血清中加入0.04柳

38、硫汞防腐，56灭活30分钟，0.45 m滤膜过滤除菌。无菌分装，每瓶1 mL，置-20保存。2.5.2 血清检验及标准2.5.2.1 性状 淡黄色或淡红色透明液体，有时有少量悬浮物。2.5.2.2 效价测定 用琼脂扩散试验检测，效价应不低于1:4。 2.5.3 作用与用途：用于副猪嗜血杆菌病间接血凝试验抗原特异性检验。2.6 猪肺炎支原体阳性血清的制备及标准2.6.1 材料与方法2.6.1.1 免疫原 猪支原体肺炎灭活疫苗（BQ14株），购自梅里亚有限公司（法国），中国农业科学院兰州兽医研究所保存。2.6.1.2 制造用动物 选用4周龄健康仔猪，经间接血凝试验检测猪肺炎支原体阴性。2.6.1.

39、3 免疫程序 首次免疫采用颈部肌肉多点注射，1.0 mL/头；在首免后14、28、42、56日分别进行肌肉多点注射加强免疫，2.0 mL/头。2.6.1.4 试血 最后一次免疫10日后耳缘静脉采集血液分离血清，用间接血凝试验测定血清效价，若免疫血清达到1:40及以上，则正式采血。2.6.1.5 制备血清 待免疫血清效价合格后，可从颈动脉大量无菌采集血液，分离血清，在血清中加入0.04柳硫汞防腐，56灭活30分钟，0.45 m滤膜过滤除菌。无菌分装，每瓶1 mL，置-20保存。2.6.2 猪肺炎支原体阳性血清检验及标准 2.6.2.1 性状 淡黄色或淡红色澄清透明液体，有时有少量悬浮物。2.6.

40、2.2 效价测定 用间接血凝试验检测，效价应不低于1:40。 2.6.3 作用与用途：用于副猪嗜血杆菌病间接血凝试验抗原特异性检验。2.7 猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型阳性血清的制备及标准2.7.1 材料与方法2.7.1.1 菌种 猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型标准菌株，由中国农业科学院兰州兽医研究所鉴定保存。2.7.1.2 试剂 猪传染性胸膜肺炎间接血凝试验抗原与阴、阳性血清，由中国农业科学院兰州兽医研究所研制，证书编号：（2006）新兽药证书63号。2.7.1.3 制造用动物 选用2 kg左右的健康雄性家兔。2.7.1.4 免疫原制备 将猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型标准菌株接于3号胨液体培养基上培

41、养18小时的培养物，菌数达109 CFU/mL，用终浓度为0.2%甲醛灭活，经检验合格后，在28条件下用PBS（0.15mol/L，pH值6.4）的PBS 4000 转/分离心洗涤3次，制成20倍浓缩抗原，用紫外分光光度计测定菌体蛋白，将抗原蛋白浓度稀释至10 mg/mL，作为免疫原。2.7.1.5 弗氏完全佐剂抗原的配制 弗氏完全佐剂抗原：弗氏完全佐剂（Sigma，USA）3 mL加抗原3 mL。弗氏不完全佐剂抗原：弗氏不完全佐剂（Sigma，USA）3 mL加抗原3 mL。上述佐剂抗原均在免疫接种前配制，并充分混合乳化。2.7.1.6 免疫程序 取上述充分乳化的弗氏完全佐剂抗原，于每只兔两

42、后腿足部皮下，帼淋巴结处及背部皮下多点接种，接种量为1.5 mL，14天后仍以上述抗原和剂量由背部皮下多点接种，进行第二次免疫；隔11日后，以上述弗氏不完全佐剂抗原，由每只兔肩部肌肉2点，背部皮下多点接种，接种剂量为3 mL，为其第三次免疫；11日后，取前述制备好的不含佐剂抗原（10 mg/mL）由每只兔耳静脉注射1.5 mL，进行第四次高免，隔14日后采血分离血清。2.7.1.7 试血 14日后由颈静脉采血分离血清，以IHA方法试血，若免疫血清IHA效价达1:128及以上，则正式采血。如免疫兔血清效价偏低，可按上述剂量途径再进行一次加强免疫，714日再进行试血，如血清效价仍不合格，须将免疫兔

43、淘汰。2.7.1.8 制备血清 待免疫血清效价合格后，可从颈动脉大量无菌采集血液，分离血清，在血清中加入0.04柳硫汞防腐，56灭活30分钟，0.45 m滤膜过滤除菌。无菌分装，每瓶1 mL，置-20保存。2.7.2 血清检验及标准2.7.2.1 性状 淡黄色或淡红色透明液体，有时有少量悬浮物。2.7.2.2 效价测定 与猪传染性胸膜肺炎间接血凝试验抗原进行间接血凝试验，效价应1:128。 2.7.3 作用与用途：用于副猪嗜血杆菌病间接血凝试验抗原特异性检验。3. 培养基及所需溶液配制方法LB琼脂平板（含50 ug/mL卡那霉素）：蛋白胨10.0 g，氯化钠（NaCl）10.0 g，酵母提取物

44、5.0 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL，调pH值至7.0，高压灭菌后冷却至60 左右，加入1 mL 卡那霉素（50 mg/mL），按20 mL/板倒入灭菌平皿中，4 保存。LB培养基（含50 ug/mL卡那霉素）：在950 mL去离子水中加入蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠（NaCl）10.0 g，摇动容器直至溶质溶解。用5 mol/L NaOH调pH值至7.0。用去离子水定容至1 L。116高压下蒸汽灭菌20分钟，高压后冷却至60 左右，加入1 mL卡那霉素（50 mg/mL），4 保存。PBS（0.01mol/L，pH值7.2）：氯化钠（NaCl）8.0 g，氯化钾

45、（KCl）0.2 g，Na2HPO412 H2O（十二水合磷酸氢二钠）3.49 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.27 g，蒸馏水1000 mL。4 保存备用。PBS（0.02mol/L，pH值7.2）：氯化钠（NaCl）4.0 g，氯化钾（KCl）0.1 g，Na2HPO412 H2O（十二水合磷酸氢二钠）1.75 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.14 g，蒸馏水1000 mL。4 保存备用。平衡Buffer：50 mM 磷酸氢二钠（NaH2PO4），300 mM 氯化钠（NaCl），10 mM Tris 碱（Tris-base），10 mM 咪唑，调pH值至8.0，0.22 m的滤膜过滤

46、，4 保存备用。NTA-60：50 mM 磷酸氢二钠（NaH2PO4，pH 8.0，300 mM氯化钠（NaCl），10 mM Tris 碱（Tris-base），60 mM 咪唑，调pH值至8.0，0.22 m的滤膜过滤，4 保存备用。副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条质量标准Fuzhushixueganjunbing Kangti Jiance ShizhitiaoColloidal Gold Strip for Antibodies of Haemophilus parasuis本品系利用大肠杆菌表达的OPPA蛋白和市售PrG蛋白以及兔抗PrG蛋白多抗，结合免疫层析胶体金标记技术制成，用于快速

47、检测副猪嗜血杆菌病血清抗体。【性状】试纸条 外装白色或微黄色PVC试纸卡，长7cm，宽2cm，厚0.5cm。正面一大一小共2孔，外露NC膜面和样品垫面呈白色，平整；卡上标有“C”、“T”和“S”字样；外包装 铝箔袋，无破损。【敏感性检验】用PBS（0.02mol/L，pH7.2）稀释阳性血清，稀释度11024时，T检测带应显色。【特异性检验】按该试纸条说明书操作，对115型副猪嗜血杆菌标准阳性血清检测。对健康猪血清、大肠杆菌BL21(DE3)阳性血清、猪链球菌2型阳性血清、猪巴氏杆菌阳性血清、猪肺炎支原体阳性血清、猪胸膜肺炎放线杆菌1型阳性血清检测。阳性血清的T检测带与C质控带均应显示清晰可见

48、红色条带，阴性血清和免疫血清仅C质控带显示清晰可见红色条带。【作用与用途】用于检测副猪嗜血杆菌病血清抗体。【用法与判定】1. 样品检测：将待检血清样品吸取70L加入“S”孔中，待液体经样品垫渗透浸湿NC膜至“C”处后，20min后观察结果。2. 结果判定阳性：C质控带与T检测带均出现清晰可见红色条带；阴性：T检测带不出现可见红色条带，仅C质控带出现清晰可见红色条带；可疑：C质控带出现可见的红色条带，而T检测带出现一条颜色很浅，若隐若显的红色条带；无效：C质控带不出现红色条带。【注意事项】1. 确保试纸条密封，干燥保存，严防受潮和冰冻；2. 严格按使用说明操作，特别注意控制标明的时间。由于层析膜

49、在湿润时显色相对清晰，同时固相的免疫学反应需要一定时间，因此从样品液体全部浸湿硝酸纤维素膜记时。【贮存】试纸条在28避光，干燥密封贮存，有效期9个月。【规格】试纸条1卡/袋，20袋/盒，可检测20份样品。附注：特异性检验所用血清的质量标准1 阳性对照血清标准【性状】 淡黄色或淡红色透明液体，有时有少量悬浮物。【效价测定】 与副猪嗜血杆菌病间接血凝试验抗原作间接血凝试验，效价应1:128。【作用与用途】用于副猪嗜血杆菌病抗体试纸条阳性对照。【规格】1 mL/瓶。【贮藏与有效期】-20以下保存，有效期暂定为12个月。2 阴性对照血清标准【性状】 淡黄色或淡红色透明液体，有时有少量悬浮物。【效价测定

50、】 与副猪嗜血杆菌病间接血凝试验抗原作间接血凝试验，效价应1:2。【作用与用途】用于副猪嗜血杆菌病抗体试纸条阴性对照。【规格】1 mL/瓶。【贮藏与有效期】-20以下保存，有效期暂定为12个月。 3 115型副猪嗜血杆菌标准阳性血清标准【性状】 淡黄色或淡红色透明液体，有时有少量悬浮物。【效价测定】 与副猪嗜血杆菌病间接血凝试验抗原作间接血凝试验，效价应1:128。【作用与用途】用于副猪嗜血杆菌病抗体试纸条特异性检验。【规格】1 mL/瓶。【贮藏与有效期】-20以下保存，有效期暂定为12个月。4 健康猪血清的标准【性状】 淡黄色或淡红色透明液体，有时有少量悬浮物。【效价测定】 与副猪嗜血杆菌病

51、间接血凝试验抗原作间接血凝试验，效价应1:2。【作用与用途】用于副猪嗜血杆菌病抗体试纸条特异性检验。【规格】1 mL/瓶。【贮藏与有效期】-20以下保存，有效期暂定为12个月。5 大肠杆菌BL21(DE3)阳性血清标准【性状】 淡黄色或淡红色透明液体，有时有少量悬浮物。【效价测定】 用微量凝集反应检测，效价应不低于1:64。 【作用与用途】用于副猪嗜血杆菌病抗体试纸条特异性检验。【规格】1 mL/瓶。【贮藏与有效期】-20以下保存，有效期暂定为12个月。6 猪链球菌2型阳性血清标准【性状】 淡黄色或淡红色透明液体，有时有少量悬浮物。【效价测定】 用试管凝集试验检测，效价应不低于1:4。【作用与

52、用途】 用于副猪嗜血杆菌病抗体试纸条特异性检验。【规格】1 mL/瓶。【贮藏与有效期】-20以下保存，有效期暂定为12个月。7 猪巴氏杆菌阳性血清标准【性状】 淡黄色或淡红色透明液体，有时有少量悬浮物。【效价测定】 用琼脂扩散试验检测，效价应不低于1:4。 【作用与用途】用于副猪嗜血杆菌病抗体试纸条特异性检验。【规格】1 mL/瓶。【贮藏与有效期】-20以下保存，有效期暂定为12个月。8 猪肺炎支原体阳性血清标准【性状】 淡黄色或淡红色透明液体，有时有少量悬浮物。【效价测定】 用间接血凝试验检测，效价应不低于1:40。 【作用与用途】用于副猪嗜血杆菌病抗体试纸条特异性检验。【规格】1 mL/瓶

53、。【贮藏与有效期】-20以下保存，有效期暂定为12个月。9 猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型阳性血清标准【性状】 淡黄色或淡红色透明液体，有时有少量悬浮物。【效价测定】 与猪传染性胸膜肺炎间接血凝试验抗原进行间接血凝试验，效价应1:128。 【作用与用途】用于副猪嗜血杆菌病抗体试纸条特异性检验。【规格】 1 mL/瓶。【贮藏与有效期】 -20以下保存，有效期暂定为12个月。质量标准各项主要检验的标准操作程序（SOP）1 性状检验操作规程1.1 目的该SOP用于规范副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条性状检验的操作。1.2 适用范围该SOP适用于副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条性状检验。1.3 职责进行该项检验的

54、检验员应当按该SOP进行检验，检测室负责人负责监督该操作规程的正确执行。1.4 检验1.4.1 实验材料待检样品：副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条。1.4.2 检验步骤及结果判定外装白色或微黄色PVC试纸卡，长7cm，宽2cm，厚0.5cm。正面一大一小两孔，外露NC膜面和样品垫面呈白色，平整；卡上标有“C”、“T”和“S”字样；外包装 铝箔袋，无破损。2 敏感性试验操作规程2.1 目的该SOP用于规范副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条敏感性试验的操作。2.2 适用范围该SOP适用于副猪嗜血杆菌病抗体检测试纸条敏感性检验。2.3 职责进行该项检验的检验员应当按该SOP进行检验，检测室负责人负责监督该操作规程的正确执行。 2.4 检验2.4.1 实验材料阳性血清、PBS（0.02mol/L，pH7.2）、移液器。2.4.2 检验步骤及结果判定用PBS（0.02mol/L，pH7.2）稀释阳性