微工菌种与种子扩大培养

1、1 微生物工业用菌 对菌种的要求 常用的工业微生物 菌种保藏 2 种子扩大培养 2.1 工业微生物的培养方法 2.2 影响种子质量的因素 2.3 种子扩培的实例 2021-6-8# * 菌 种 的 来 源 自 然 界 中 有 目 的 微 生 物 分 离 的 原 则 菌 种 选 育、 分 子 育 种 * 工 业 微 生 物 的 要 求 * 常 用 工 业 微 生 物 * 菌 种 保 藏 2021-6-8# * q 诱变育种：诱变是工业发酵稳产高产的重要保证； q 从自然界分离：目前土壤中已分离的微生物不到总数 的1%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点； q 基因重组：基因定向改造技术大大

2、加快了生物产品开 发的进程。 2021-6-8# 从自然界中分离菌种的一般过程 采样采样 预处理预处理 培养培养 菌落的选择菌落的选择 产品的鉴定产品的鉴定 2021-6-8# * 2021-6-8# (1) 待改良性状的本质及与发酵工艺的关系待改良性状的本质及与发酵工艺的关系 (2) 对这一特定菌种的遗传生化的认识程度对这一特定菌种的遗传生化的认识程度 (3) 经济费用经济费用 如，对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，如，对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少， 则多半采用则多半采用随机诱变、筛选及选育随机诱变、筛选及选育等技术；等技术； 如，对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，如，

3、对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识， 则可选择则可选择基因重组基因重组等手段进行等手段进行定向育种定向育种。 * 抗生素生产有关的微生物 放线菌（链霉素四 环素；红霉素等） 真菌（青霉素、头孢等） 一些产芽孢的细菌 植物或动物来源 2021-6-8# 氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单 谷氨酸发酵的菌种： 其它氨基酸生产菌： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌 氨基酸生产有关的微生物 2021-6-8# 食品工业微生物 包括：酿造业，酶制剂等 食品用的微生物需经过严格的毒理

4、试验，目前已同意 使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌 2021-6-8# 1. 能在廉价原料制成的培养基上迅速生长和大量合成目的 产物 -价值高 2. 能在要求不高、易控制的培养条件下迅速生长和发酵， 发酵周期短。 -可操作性强 3. 根据代谢调控要求选择高产菌株，如营养缺陷型菌株或 调节突变型菌株 4. 菌种抗噬菌体能力强，以防止感染噬菌体而造成“倒罐” 现象的发生。 5. 菌种纯粹，不易退化，可保证发酵生产和产品质量的稳 定性。 -遗传稳定性强 6. 菌种非病原菌，不产生任何有害的物质和毒素，以保证 产品的安全。 -安全性

5、强 2021-6-8# * ( 1) 斜斜 面面 保保 藏：藏： 3 - 6 个个 月月 ( 2) 沙沙 土土 管管 干干 燥燥 保保 藏：藏： 2 年年 ( 3) 液液 氮氮 保保 藏：藏： 2 - 3 年年 ( 4) 悬悬 液液 保保 藏：藏： 常常 温温 或或 低低 温温 ( 5) 超超 低低 温温 保保 藏：藏： 1 年年 以以 上上 ( 6) 冷冷 冻冻 干干 燥燥 保保 藏：藏： 5 - 1 0 年年 2021-6-8# 2021-6-8# 目的：保证菌种在长时间内尽可能保持原有菌株优良的生目的：保证菌种在长时间内尽可能保持原有菌株优良的生 产性能。产性能。 基本原理：根据菌种的生

6、理生化特点，创造条件使菌种的基本原理：根据菌种的生理生化特点，创造条件使菌种的 代谢活动处于不活泼的状态。代谢活动处于不活泼的状态。 基本原则：选用优良纯种和创造一个最有利于菌种休眠的基本原则：选用优良纯种和创造一个最有利于菌种休眠的 环境。环境。 休眠环境：微生物生长繁殖和代谢受抑，不易突变的环境，休眠环境：微生物生长繁殖和代谢受抑，不易突变的环境， 一般要求低温、缺氧、缺营养、添加保护剂、干燥等。一般要求低温、缺氧、缺营养、添加保护剂、干燥等。 菌种保藏菌种保藏 2021-6-8# 保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便 保藏后需再次检测和确定保藏菌种的形

7、态学和生保藏后需再次检测和确定保藏菌种的形态学和生 化特征化特征( (如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征 及生化指标及生化指标) )。 2021-6-8# 方法方法温度温度保护剂保护剂保藏时间保藏时间适用菌种适用菌种 定期移植低 温保藏法 4低温无数月，短 期 各种微生物细胞 液氮超低温 保藏法 -196-150甘油或DMSO长期适用范围最广，微 生物、动物细胞 甘油低温保 藏法 -80-70 （-18） 甘油1年以上特别适用于基因工 程菌 沙土保藏法室温或低温数年芽孢杆菌、放线菌、 曲霉菌等 麸皮保藏法20长期放线菌、霉菌等 蒸馏水保藏 法 410较长时间酵

8、母、真菌 冷冻干燥保 藏法 干燥后，4左 右低温避光处 脱脂乳、蔗糖数年各种微生物细胞 *最有效，适用范围最广，多数国家级菌种保藏单位常用 *原则： 慢冻快溶慢冻快溶 *原理：利用微生物在-130以下新陈代谢趋于停止而有效地 保藏微生物。 2021-6-8# 1.将10%甘油或DMSO作为保护剂分装与安培瓶（or冻干管） 中 2.将长有菌落的琼脂（or培养液）悬浮于已灭菌的保护剂中 3.熔封安培瓶口（or盖上冻干管的盖子） 4.以1min下降1的速度降至-35 ，使瓶内悬浮液体冻结， 然后将安培瓶置液氮罐（or液氮冰箱）中，于-130 以 下储藏 5.恢复培养时，从液氮中取出安培瓶（or冻干管

9、），立即于 3840 水浴中摇动，至瓶内冰全部融化，按常法进行培 养。 2021-6-8# 2021-6-8# 2021-6-8# 在超低温冷藏柜（在超低温冷藏柜（-70-80 ）中保藏菌种的一般方法是：中保藏菌种的一般方法是： 1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞 2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3加入等体积的加入等体积的20甘油或甘油或10二甲亚砜；二甲亚砜； 4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70-80超低温冰超低温冰 箱中保藏。箱中保藏。 超低温冰箱的冷冻速度一般控制在超

10、低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-21-2minmin。一。一 些细菌和真菌菌种可保藏些细菌和真菌菌种可保藏5 5年而活力不受影响。年而活力不受影响。 2021-6-8# 超低温冰箱超低温冰箱 2021-6-8# 冻干保藏冻干保藏：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液 中的水分升华，使培养物干燥。中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌此法是微生物菌 种长期保藏的非常有效的方法之一。种长期保藏的非常有效的方法之一。 冷冻干燥步骤： *冻干样品的准备：准备菌种，与保护剂混合均匀，分装至安瓿 管 *预冻：2小时以上，温度达到-20到-35左右 *冷冻干燥 ：8-2

11、0小时 *真空封口及真空检验 ：安瓿管颈部用强火焰拉细熔封。氯化 钴溶液检测真空度 *低温避光保藏 ： 4 2021-6-8# 冻冻 干干 保保 藏藏 特特 点：点： *冻冻 干干 状状 态态 下下 一一 般般 可可 保保 藏藏 5 - 1 0 年年 不不 丧丧 失失 活活 力力 *冻冻 干干 后后 的的 菌菌 株株 可可 常常 温温 保保 存，存， 便便 于于 运运 输输 *必必 须须 使使 用用 冷冷 冻冻 保保 护护 剂，剂， 常常 用用 脱脱 脂脂 乳、乳、 蔗蔗 糖糖 等等 2021-6-8# 菌种保藏机构菌种保藏机构 国外国外： 1. ATCC American Type Cult

12、ure Collection. RockvilleMaryland. U.S.A 美国标准菌种收藏所，美国，马里兰洲，罗克维尔市。 2. CSH（Cold Spring Harbor Laboratory），U.S.A 冷泉港研究室，美国。 2021-6-8# 3. IAM (Institute of Applied Microbiology), University of Tokyo, Japan 日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。 4. IFO (Institute for Fermentation), Osaka, Japan 发酵研究所，日本大阪。 5. KCC (Kaken C

13、hemical Company Ltd, Tokyo, Japan 科研化学有限公司，日本东京。 2021-6-8# 6. NCTC (National Collection of Type Culture), London United Kingdom， 国立标准菌种收藏所，英国伦敦。 7. NIH (National Institutes of Health), Bethesda, Maryland, U.S.A 国立卫生研究所，美国，马里兰洲，贝塞斯达。 8. NRRL (Northern Utilization Research and Development Division), U

14、.S. Department of Agriculture, Peoria, U.S.A 美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市。 2021-6-8# 中国中国，1970年7月，中国微生物菌种保藏管理委员会 （CCCMS），中国科学院负责，下设六个菌种保藏管理中心。 l）CCGMC 普通微生物菌种保臧管理中心；北京、武汉 2）ACCC 农业微生物菌种保藏管理中心；北京 3）CICC 工业微生物菌种保藏管理中心；北京 4）CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心；南京、北京 5）CACC 抗生素菌种保藏管理中心；北京、成都、石家庄 6）CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心；北京 2021-6

15、-8# *衰衰 退退 的的 表表 现：现： 生生 长，长， 代代 谢谢 （ 产产 品）品） *衰衰 退退 的的 原原 因：因： 保保 藏藏 不不 妥妥 菌菌 种种 生生 长长 的的 要要 求求 没没 有有 得得 到到 满满 足足 （ 不不 利利 环环 境，境， 回回 复复 突突 变变 等）等） 2021-6-8# 2021-6-8# *防止衰退的方法：防止衰退的方法： 1.分离复壮分离复壮 2. 合理改变培养条件合理改变培养条件 3. 减少传代次数减少传代次数 4. 诱变剂处理后重新分离单菌落诱变剂处理后重新分离单菌落 *复壮：分离单细胞，抗性筛选，苛刻条件复壮：分离单细胞，抗性筛选，苛刻条件

16、 将保存在沙土管、冷冻干燥管中处休眠状态将保存在沙土管、冷冻干燥管中处休眠状态 的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或 摇瓶及种子罐逐级扩大培养摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和最终获得一定数量和 质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 * 2021-6-8# 菌种扩培的目的菌种扩培的目的 q提供相当数量代谢旺盛的种子提供相当数量代谢旺盛的种子 -量、状态的需要量、状态的需要 q得到纯、壮、多的培养物得到纯、壮、多的培养物 - 菌种的驯化菌种的驯化 -缩短发酵时间、保证生产水平缩短发酵时间、保证生

17、产水平 2021-6-8# 菌种扩培的任务菌种扩培的任务 实验室阶段：实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等 实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室 完成，因此将其称为实验室阶段的种子培养。 培养基：保证培养基的质量，有利于菌体的生长培养基：保证培养基的质量，有利于菌体的生长 减少传代次数减少传代次数 孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月个月 生产车间阶段生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归发 酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。 培养基：控制成本，驯化；营养比发酵培养基丰富。培养基：控制成

18、本，驯化；营养比发酵培养基丰富。 种子扩培的两个阶段种子扩培的两个阶段 2021-6-8# 2021-6-8# 三级发酵流程：三级发酵流程： 斜面斜面 一级种子一级种子 二级种子罐二级种子罐 三级种子罐三级种子罐 发酵罐发酵罐 * 静置培养法：嫌气发酵静置培养法：嫌气发酵 通气培养法通气培养法 固态培养法固态培养法 液体培养法液体培养法 2021-6-8# 表面培养法表面培养法 2021-6-8# 回转式回转式往复式往复式 2021-6-8# 2021-6-8# * 解释解释特点特点适用范围适用范围 固态培固态培 养养 即曲法培养，源于即曲法培养，源于 传统制曲技术传统制曲技术 酶活力高酶活力

19、高 可调温湿度可调温湿度 酿造业酿造业 液体深液体深 层培养层培养 液体培养，深层通液体培养，深层通 风风 可调节各种环境因素可调节各种环境因素 ：营养物浓度，温湿：营养物浓度，温湿 度等；无菌操作要求度等；无菌操作要求 高高 几乎所有好几乎所有好 气发酵：如气发酵：如 有机酸、氨有机酸、氨 基酸等基酸等 载体培载体培 养养 可重复使用的多孔可重复使用的多孔 材料，严格控制营材料，严格控制营 养条件，结束后挤养条件，结束后挤 压培养液抽提产物压培养液抽提产物 兼具固体培养法与液兼具固体培养法与液 体培养法的优点体培养法的优点 可培养霉菌可培养霉菌 、酵母、放、酵母、放 线菌等线菌等 两步法两步

20、法 液体深液体深 层培养层培养 将营养生长期与生将营养生长期与生 产期分开，分别控产期分开，分别控 制不同条件制不同条件 工艺可达到最优工艺可达到最优 过程繁琐过程繁琐 氨基酸生产氨基酸生产 2021-6-8# * 2021-6-8# 种子的要求：种子的要求： q 总量及浓度能满足要求总量及浓度能满足要求 q 生理状况稳定，个体与群体生理状况稳定，个体与群体 q 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长活力强，移种至发酵后，能够迅速生长 q 无杂菌污染无杂菌污染 *一一 定定 的的 浓浓 度度 *形形 态态 （ 生生 长长 处处 于于 某某 个个 阶阶 段、段、 均均 匀匀 等等 等）等） *理理

21、化化 指指 标：标： C、 N、 P 的的 含含 量，量， p H， 酶酶 活活 等等 *无无 污污 染染 2021-6-8# *培培 养养 基基 *种种 龄龄 与与 接接 种种 量量 *温温 度度 *p H 值值 *通通 气气 与与 搅搅 拌拌 *泡泡 沫沫 *染染 菌菌 的的 控控 制制 *种种 子子 罐罐 级级 数数 影响因素影响因素 种龄种龄 种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐 或发酵罐时的培养时间。或发酵罐时的培养时间。 种龄短：菌体太少；种龄长：易老化种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓

22、度相对较原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较 大，但是最终由实验结果定。大，但是最终由实验结果定。 2021-6-8# 接种量的确定接种量的确定 移入种子的体积移入种子的体积 接种量接种量 接种后培养液的体积接种后培养液的体积 过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7- 15%。但是一般认为大一点好。但是一般认为大一点好。 双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。 倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。 2021-6-8# 发酵级数的确定

23、发酵级数的确定 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第 一级种子罐开始计算发酵级数一级种子罐开始计算发酵级数 确定依据确定依据： 发酵规模、菌体生长特性、接种量发酵规模、菌体生长特性、接种量 级数大，难控制、易染菌、易变异，难管理，一般级数大，难控制、易染菌、易变异，难管理，一般2-4级级 谷氨酸的三级发酵：谷氨酸的三级发酵： 一级种子（摇瓶）一级种子（摇瓶）二级种子二级种子 （小罐）（小罐）发酵发酵 青霉素的三级发酵：青霉素的三级发酵： 一级种子一级种子 （小罐）（小罐）二级种子（中罐）二级种子（中罐）发酵发酵 2021-6-8#

24、 2.3 种子扩大培养举例种子扩大培养举例 例一、谷氨酸生产的种子制备例一、谷氨酸生产的种子制备 斜面菌种斜面菌种一级种子培养一级种子培养 二级种子培养二级种子培养 发酵发酵 2021-6-8# 1、斜面、斜面 (AS1.299) 培养基：蛋白胨培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏，牛肉膏1%，氯化钠，氯化钠 0.5 琼脂琼脂 2%， pH 7.0-7.2 培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细有利于菌体的生长，原料比较精细 培养条件：培养条件：32，生长，生长18-24小时小时 生长斜面要求：生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次次

25、2021-6-8# 2. 一级一级种子（摇瓶）种子（摇瓶） 培养条件：于培养条件：于1000ml三角瓶中，装液三角瓶中，装液200-250ml,32培培 养养12小时。小时。 培养基：葡萄糖培养基：葡萄糖2%，尿素，尿素0.5%，玉米浆，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1% 培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基本接近于发酵培养基 2021-6-8# 3. 二级种子二级种子(种子罐种子罐) 培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），）， 32培养培养7-10个小时个

26、小时 培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 浓度为浓度为2.5% 培养基的特点培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基：长菌体，更接近于发酵培养基 2021-6-8# 种子的质量要求：种子的质量要求： 108-109个个/ml 大小均匀，呈单个或八字排列大小均匀，呈单个或八字排列 pH 7.0-7.2时结束，时结束，6.887.0-7.2 活力旺盛活力旺盛 2021-6-8# 二、青霉素生产的种子制备二、青霉素生产的种子制备 安瓿管安瓿管 斜面孢子斜面孢子 大米孢子大米孢子 一级种子一级种子 二级种子二级种子 发酵发酵 2021-6-

27、8# 一、斜面孢子一、斜面孢子 培养基：甘油、培养基：甘油、 葡萄糖、葡萄糖、 蛋白胨等蛋白胨等 培养基特点培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细有利于长孢子，用量少而精细 培养条件：培养条件：25、7天天, 注意湿度注意湿度50%左右左右 2021-6-8# 二、大米孢子二、大米孢子 培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基：大米及氮源（玉米浆） 培养基的特点培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表成本低、米粒之间结构疏松提高比表 面积和氧的传质，营养适当（要求大米面积和氧的传质，营养适当（要求大米 的白点小）有利于孢子的生长。的白点小）有利于孢子的生长。 培养条件：培养条件：25、7天，控

28、制湿度天，控制湿度 大米孢子的要求大米孢子的要求：1粒米含粒米含1.4*106个孢子个孢子 2021-6-8# 3、一级种子、一级种子 培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆 目的目的：长菌体长菌体 培养条件：培养条件：27，40小时小时 接种量：接种量：200亿孢子亿孢子/吨吨 4、二级种子、二级种子 培养基：同上培养基：同上 培养条件：培养条件：27、10-14小时小时 接种量：接种量：10% 2021-6-8# 种子的质量要求种子的质量要求 菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于 期期 青霉素发酵菌丝

29、体的生长共分为青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，个期，1-4为年青期，为年青期， 4-6期合成青霉素的能力最强期合成青霉素的能力最强 2021-6-8# 小节： 常见工业微生物的种类和用途 生产菌种的来源与保护 控制种子质量的基本方法和手段 思考题： 在生产过程中如何控制种子质量？ 2021-6-8# * q 诱变育种：诱变是工业发酵稳产高产的重要保证； q 从自然界分离：目前土壤中已分离的微生物不到总数 的1%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点； q 基因重组：基因定向改造技术大大加快了生物产品开 发的进程。 2021-6-8# 冻冻 干干 保保 藏藏 特特 点：点： *冻冻 干干 状状 态态 下下 一一 般般