蛋白质组全部

1、精选课件1 精选课件2 1.1.基因研究是二十世纪生命科学研究的主线基因研究是二十世纪生命科学研究的主线 精选课件3 生命科学回顾生命科学回顾 1838 Schleiden和和Schwann 细胞学说细胞学说 1859 Darwin 物种起源进化论物种起源进化论 1866 Mendel 孟德尔遗传定律孟德尔遗传定律 1870-80s Miesher 核酸物质核素核酸物质核素 1910-1913 Morgen 基因理论基因连锁基因理论基因连锁 1910 Kossel 分离出腺嘌呤、胸腺嘧啶和组氨酸分离出腺嘌呤、胸腺嘧啶和组氨酸 1940-50s Griffich和和Avery 肺炎双球菌转化试验

2、肺炎双球菌转化试验DNA是遗传物质是遗传物质 1953 Watson和和Crick DNA双螺旋模型双螺旋模型 1950s McClintock 跳跃基因跳跃基因 1954 Crick 中心法则中心法则 1960 Ochoa RNA聚合酶聚合酶 1961 Jacob 和和Monod 乳糖操纵子模型乳糖操纵子模型 1966 Nirenberg 遗传密码遗传密码 1966 Gellert DNA连接酶连接酶 精选课件4 生命科学回顾（续）生命科学回顾（续） 1970 Smith 限制性内切酶限制性内切酶 1970 Temin 逆转录酶逆转录酶 1972 Berg 首次首次DNA重组重组 1977

3、Sanger和和Gilbert 首次首次DNA序列分析序列分析 1981 首次获得转基因动物（小鼠）首次获得转基因动物（小鼠） 1983 首次获得转基因植物（烟草）首次获得转基因植物（烟草） 1984 人类基因组计划设想人类基因组计划设想 1986 基因工程生物（基因工程生物（GMO）首次环境释放）首次环境释放 1989 美国首次接受美国首次接受GMO的专利申请的专利申请 1994 转基因西红柿作为商品面世转基因西红柿作为商品面世 1997 克隆羊克隆羊Dolly诞生诞生 2001 人类基因组框架图完成人类基因组框架图完成 精选课件5 精选课件6 2. 2. 基因组计划基因组计划 1986 1

4、986 年，人类基因组计划（年，人类基因组计划（HGPHGP）于首次在）于首次在 Science Science 杂志发表的一篇文章中提出杂志发表的一篇文章中提出. . 其目的是阐明人类基因组其目的是阐明人类基因组3030亿个碱基对的序亿个碱基对的序 列，发现所有人类基因并阐明其在染色体上的列，发现所有人类基因并阐明其在染色体上的 位置，从而在整体上破译人类遗传信息。位置，从而在整体上破译人类遗传信息。 该计划启动于该计划启动于19901990年，原定年，原定1515年完成，由于年完成，由于 技术的成熟与基因组测序的规模化运作，以及技术的成熟与基因组测序的规模化运作，以及 来自商业竞争方面的压

5、力，来自商业竞争方面的压力，20002000年年6 6月月2626日基日基 因组序列草图测序完成。因组序列草图测序完成。 精选课件7 遗传图遗传图 物理图物理图 序列图序列图 基因组计划基因组计划 1/2 of all genes “identified” have no known function 这三条数据将提供此生物所有基因在染色体上的精确定位、这三条数据将提供此生物所有基因在染色体上的精确定位、 基因内部序列以及基因的间隔序列。基因内部序列以及基因的间隔序列。 -原核生物或低等真核生物。原核生物或低等真核生物。 精选课件8 精选课件9 转录转录组学组学 蛋白质蛋白质组学组学 代谢代谢

6、组学组学 表型表型组学组学 相互作用相互作用组学组学 功能基因功能基因组学组学 精选课件10 精选课件11 精选课件12 精选课件13 精选课件14 蛋白质组与基因组相对应，也是一个整体的概念， 是基因组表达的全部蛋白。但两者又有根本的不 同之处。 精选课件15 同一个体的基因组不同一个体的基因组不 论是在不同的发育阶论是在不同的发育阶 段或不同种类的细胞段或不同种类的细胞 里都是一样的；里都是一样的； 对于不同类型的细胞或对于不同类型的细胞或 同一个细胞在不同的生同一个细胞在不同的生 理状态下，蛋白质组的理状态下，蛋白质组的 构成是不同的；构成是不同的； 基因组基因组蛋白组蛋白组 多样性多样

7、性同一性同一性 精选课件16 基因组基因组蛋白组蛋白组 有限性有限性 无限性无限性 基因组无论大小，其基因组无论大小，其 核苷酸的数量和序列核苷酸的数量和序列 是一定的，例如人类是一定的，例如人类 基因组长度为基因组长度为32亿个亿个 碱基对；碱基对； 对基因组序列的测定对基因组序列的测定 是一种是一种“有限有限”的工的工 作。作。 由于细胞内大部分蛋白质由于细胞内大部分蛋白质 存在翻译后修饰，包括磷存在翻译后修饰，包括磷 酸化、糖基化、酰基化等，酸化、糖基化、酰基化等， 很难确定蛋白质组的蛋白很难确定蛋白质组的蛋白 质数量；质数量； 对蛋白质组的蛋白质种类对蛋白质组的蛋白质种类 的确定是一种

8、的确定是一种“无限无限”的的 工作。工作。 精选课件17 基因组基因组蛋白组蛋白组 静态静态 动态动态 一个个体的基因组自一个个体的基因组自 个体诞生到死亡，始个体诞生到死亡，始 终保持不变；终保持不变； 个体的蛋白质组，作为新个体的蛋白质组，作为新 陈代谢的主要执行者，在陈代谢的主要执行者，在 个体的生命活动中却总是个体的生命活动中却总是 变动的；变动的； 蛋白质组学研究的一个重蛋白质组学研究的一个重 要任务是找出蛋白质组里要任务是找出蛋白质组里 发生变化的蛋白质。发生变化的蛋白质。 精选课件18 基因组基因组蛋白组蛋白组 周期性周期性 空间性空间性 基因组通常位于细胞核基因组通常位于细胞核

9、 内，比较稳定，序列和内，比较稳定，序列和 功能一般不受空间的影功能一般不受空间的影 响，但是在发育的不同响，但是在发育的不同 阶段和不同的细胞周期，阶段和不同的细胞周期， mRNA的表达是不一样的表达是不一样 的；的； 不同的蛋白质分布在细胞的不同不同的蛋白质分布在细胞的不同 部位，它们的功能与其空间定位部位，它们的功能与其空间定位 密切相关；密切相关； 许多蛋白质在细胞内不是静止的，许多蛋白质在细胞内不是静止的， 他们常常在不同的亚细胞环境里他们常常在不同的亚细胞环境里 运动而发挥作用；运动而发挥作用； 细胞的信号传导和转录调控也常细胞的信号传导和转录调控也常 常依赖于蛋白质的变化和运动。

10、常依赖于蛋白质的变化和运动。 精选课件19 基因组基因组蛋白组蛋白组 孤立行为孤立行为 相互作用相互作用 基因组表达的各种基因组表达的各种 mRNA是彼此孤立的，是彼此孤立的， 互不干扰；互不干扰； 蛋白质组中的各种蛋白质蛋白质组中的各种蛋白质 却是彼此间有着广泛的相却是彼此间有着广泛的相 互作用；互作用； 蛋白质互作的研究有两类：蛋白质互作的研究有两类： 第一类是研究蛋白质相互第一类是研究蛋白质相互 作用的网络，第二类是研作用的网络，第二类是研 究蛋白质复合体组成。究蛋白质复合体组成。 精选课件20 基因组基因组蛋白组蛋白组 单一手段单一手段 多种技术多种技术 在基因组研究中，在基因组研究中

11、， DNA测序技术是最基测序技术是最基 本和最主要的工具，本和最主要的工具， 因为基因组的均一性因为基因组的均一性 和简单性使得一种单和简单性使得一种单 一的技术就能胜任基一的技术就能胜任基 因组的研究任务。因组的研究任务。 在蛋白质组研究中，需要的在蛋白质组研究中，需要的 研究技术远远不止一种，并研究技术远远不止一种，并 且技术的难度也远远大于基且技术的难度也远远大于基 因组的研究技术；因组的研究技术； 蛋白质组研究技术可以简单蛋白质组研究技术可以简单 地分为两大类：蛋白质组分地分为两大类：蛋白质组分 离技术，蛋白质组的鉴定技离技术，蛋白质组的鉴定技 术，其核心是质谱技术。术，其核心是质谱技

12、术。 精选课件21 蛋白质组学与基因组学研究互补与互助蛋白质组学与基因组学研究互补与互助 在质谱测定蛋白质的过程中，离不开对已在质谱测定蛋白质的过程中，离不开对已 知基因组的基因数据的比较；知基因组的基因数据的比较； 蛋白质组的数据可以帮助大大提高基因注蛋白质组的数据可以帮助大大提高基因注 释的正确率。释的正确率。 精选课件22 Compartmentalization：区分、划分 Proteolysis：蛋白水解 精选课件23 2001年，人类基因组序列图谱初稿的公布。但是，年，人类基因组序列图谱初稿的公布。但是， 基因只是遗传信息的载体，蛋白质才是生物细胞基因只是遗传信息的载体，蛋白质才是

13、生物细胞 赖以生存的各种代谢和调控途径的主要执行者。赖以生存的各种代谢和调控途径的主要执行者。 而这仅仅是基因水平的差别，2001年，人类年，人类 基因组序列图谱初稿的公布，但是，基因只基因组序列图谱初稿的公布，但是，基因只 是遗传信息的载体，蛋白质才是生物细胞赖是遗传信息的载体，蛋白质才是生物细胞赖 以生存的各种代谢和调控途径的主要执行者。以生存的各种代谢和调控途径的主要执行者。 而蛋白质的差别也比基因差别更大， 精选课件24 生物间蛋白质数的差别生物间蛋白质数的差别 基因数差别基因数差别 10 1-3 蛋白质组可能是生物蛋白质组可能是生物 复杂性进化的基础复杂性进化的基础 “失之毫厘，差之

14、千里失之毫厘，差之千里” 因此，生物间蛋白质数的差别约是基因数差 别的10到1000倍， 可谓是：“失之毫厘，差 之千里”，因此，蛋白质组可能是生物复杂 性进化的基础。 精选课件25 翻译后修饰翻译后修饰 相互作用相互作用 构象变化构象变化 翻译后拼接翻译后拼接 移位移位 胞质 胞核 蛋白质的多样性蛋白质的多样性 而作为生命的执行者，蛋白质又具有多样性，可谓是而作为生命的执行者，蛋白质又具有多样性，可谓是 生命的万花筒。比如它可以经过翻译后修饰的到不同生命的万花筒。比如它可以经过翻译后修饰的到不同 作用的蛋白质；然后经过相互作用与不同的蛋白或者作用的蛋白质；然后经过相互作用与不同的蛋白或者 其

15、他分子形成功能复合体。而不同的构象则直接影响其他分子形成功能复合体。而不同的构象则直接影响 蛋白质的功能；此外经过翻译后拼接，不同蛋白质还蛋白质的功能；此外经过翻译后拼接，不同蛋白质还 可以成为融合蛋白，然后移位到合适的位置进一步发可以成为融合蛋白，然后移位到合适的位置进一步发 挥功能。挥功能。 精选课件26 用基因表达连续分析法研究对数生长期啤酒酵母的用基因表达连续分析法研究对数生长期啤酒酵母的80 个基因个基因,结果没有发现翻译和转录丰度有明显相关结果没有发现翻译和转录丰度有明显相关; 对某些基因对某些基因,相同的相同的mRNA 丰度翻译成蛋白的量的差异丰度翻译成蛋白的量的差异 可达可达5

16、0 倍倍; 而相等的蛋白量可由丰度相差而相等的蛋白量可由丰度相差40 倍的倍的 mRNA 转录而来。转录而来。 这说明转录和翻译水平对蛋白的含量有几乎相同的重要这说明转录和翻译水平对蛋白的含量有几乎相同的重要 性性 精选课件27 精选课件28 精选课件29 由此可见，由此可见，基因虽然是遗传信息的源头，而功能基因虽然是遗传信息的源头，而功能 性蛋白却是基因功能的执行体。性蛋白却是基因功能的执行体。基因组计划的实现固基因组计划的实现固 然为生物有机体全体基因序列的确定，为未来生命科然为生物有机体全体基因序列的确定，为未来生命科 学研究奠定了坚实的基础，但是却不能够告诉人们那学研究奠定了坚实的基础

17、，但是却不能够告诉人们那 些基因在何时何地以何种程度表达，也就是说基因组些基因在何时何地以何种程度表达，也就是说基因组 它并不能直接提供认识各种生命活动的分子基础，其它并不能直接提供认识各种生命活动的分子基础，其 间必须研究生命活动的执行体间必须研究生命活动的执行体-蛋白质这一重要环节。蛋白质这一重要环节。 蛋白质组的研究应运而生！蛋白质组的研究应运而生！ 精选课件30 精选课件31 精选课件32 了解某种特定的细胞、组织或了解某种特定的细胞、组织或 器官制造的蛋白质种类；器官制造的蛋白质种类； 明确各种蛋白质分子是如何明确各种蛋白质分子是如何 形成类似于电路的网络的；形成类似于电路的网络的；

18、 描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其 结构上的关键部位，如与药物结合并且决结构上的关键部位，如与药物结合并且决 定其活性的部位。定其活性的部位。 精选课件33 蛋白质组表达模式蛋白质组表达模式 The study of global changes in protein expression Proteomics 蛋白质组功能模式蛋白质组功能模式 The systematic study of protein- protein interactions through the isolation of protein complexes 蛋白质组研究包括两个方面：

19、蛋白质组研究包括两个方面： 精选课件34 精选课件35 蛋白质组学的分类蛋白质组学的分类 精选课件36 精选课件37 蛋白质组研究的宗旨将组织或细胞所有蛋白质蛋白质组研究的宗旨将组织或细胞所有蛋白质 （至少是大部分）分离与鉴定（至少是大部分）分离与鉴定 精选课件38 蛋白质组的技术基础蛋白质组的技术基础 （三大支撑技术）（三大支撑技术） （使数以千计的蛋白得到有效的分离）（使数以千计的蛋白得到有效的分离） （精确（精确 测定生物大分子相对质量及多肽序列）测定生物大分子相对质量及多肽序列） 计算机为基础的图像分析及相应数据库分析计算机为基础的图像分析及相应数据库分析 精选课件39 蛋白质组学研究

20、的手段蛋白质组学研究的手段 蛋白质组研究的核心蛋白质组研究的核心分离技术分离技术 (Separation ) 蛋白质组的百科全书蛋白质组的百科全书数据库数据库 (Database) 蛋白质组研究的支柱蛋白质组研究的支柱鉴定技术鉴定技术 (Identication) 蛋白质组技术的规模蛋白质组技术的规模高流通量筛选高流通量筛选 (HTS) 精选课件40 蛋白质研究基本路线：蛋白质研究基本路线： 样品制备与分离样品制备与分离 图像分析图像分析 蛋白质成分的分析与鉴定蛋白质成分的分析与鉴定 数据库检索数据库检索 精选课件41 各国政府支持，国际著名研究和商业机构各国政府支持，国际著名研究和商业机构

21、加盟：加盟： 19961996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白 质组研究中心（质组研究中心（Australia Proteome Australia Proteome Analysis FacilityAnalysis Facility，APAFAPAF） 精选课件42 美国国立癌症研究院（美国国立癌症研究院（NCINCI）投资）投资1 0001 000万万 美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋 白质组数据库。白质组数据库。 NCINCI和和FDAFDA共同投资共同投资数百万数百万美元建立癌症不同美元建立癌症不同 阶段的蛋白质

22、组数据库。阶段的蛋白质组数据库。 英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成 或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋 白质组研究。白质组研究。 精选课件43 CeleraCelera公司投资上亿美元独自启动了全公司投资上亿美元独自启动了全 面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体 液中的蛋白质及其异构体，构建新一代液中的蛋白质及其异构体，构建新一代 的蛋白质表达数据库的工作。的蛋白质表达数据库的工作。 精选课件44 精选课件45 蛋白质的基本组成单位氨基酸及其连接方式蛋白质的基本组成单位氨基酸及其连接方

23、式 蛋白质的一级、二级、三级、四级结构，模体、蛋白质的一级、二级、三级、四级结构，模体、 结构域结构域 蛋白质一级结构与空间结构和功能的关系蛋白质一级结构与空间结构和功能的关系 蛋白质的理化性质及其提取、纯化的原理蛋白质的理化性质及其提取、纯化的原理 蛋白质氨基酸序列和空间结构的测定蛋白质氨基酸序列和空间结构的测定 精选课件46 二、蛋白质的生物学重要性 1.1.蛋白质是生物体重要组成成分蛋白质是生物体重要组成成分 蛋白质蛋白质(protein)(protein)是由许多氨基酸是由许多氨基酸(amino (amino acids)acids)通过肽键通过肽键(peptide bond)(pep

24、tide bond)相连形成的高分相连形成的高分 子含氮化合物。子含氮化合物。 精选课件47 1 1）作为生物催化剂）作为生物催化剂 2 2）代谢调节作用）代谢调节作用 3 3）免疫保护作用）免疫保护作用 4 4）物质的转运和存储）物质的转运和存储 5 5）运动与支持作用）运动与支持作用 6 6）参与细胞间信息传递）参与细胞间信息传递 精选课件48 组成蛋白质的元素： 主要有主要有C (50%-55%)、H(6%-8%)、O(19%- 24%)、N(13%-19%)和和S(0-4%)； 有些蛋白质含有少量有些蛋白质含有少量磷磷或金属元素或金属元素铁、铜、铁、铜、 锌、锰、钴，钼锌、锰、钴，钼，

25、个别蛋白质还含有，个别蛋白质还含有碘碘。 第第 一 节节 精选课件49 各种蛋白质的含氮量很接近，平均为各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。 由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只 要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下 公式推算出蛋白质的大致含量：公式推算出蛋白质的大致含量： 100克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数每克样品含氮克数 6.25100 1/16% 蛋白质元素组成的特点 精选课件50 一、氨基酸 蛋白质的基本单位 存在自然界中的氨基酸有存在自然界中的氨

26、基酸有300300余种，但组余种，但组 成人体蛋白质的氨基酸仅有成人体蛋白质的氨基酸仅有2020种，且均属种，且均属 L-L- - -氨基酸氨基酸（甘氨酸除外）。（甘氨酸除外）。 氨基酸的化学结构具有共同的特点：碳原氨基酸的化学结构具有共同的特点：碳原 子上除连接子上除连接1 1个羧基个羧基，还有，还有1 1个氨基个氨基，故称为，故称为- - 碳原子碳原子。此外还有。此外还有1 1个侧链（个侧链（R R基团）。基团）。 精选课件51 1.非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸： 在水中溶解度较小在水中溶解度较小 包括：包括： 带有脂肪烃侧链氨基酸（丙、缬、亮、异亮）带有脂肪烃侧链氨基酸（丙、缬、

27、亮、异亮） 含芳香环的氨基酸（苯丙）含芳香环的氨基酸（苯丙） 含硫氨基酸（甲硫）含硫氨基酸（甲硫） 亚氨基酸（脯）及亚氨基酸（脯）及 甘氨酸甘氨酸 （一）氨基酸的分类（一）氨基酸的分类 根据根据侧链侧链R R基团的结构和理化性质基团的结构和理化性质可分为四类：可分为四类： 精选课件52 甘氨酸甘氨酸 glycine Gly G 5.97 丙氨酸丙氨酸 alanine Ala A 6.00 缬氨酸缬氨酸 valine Val V 5.96 亮氨酸亮氨酸 leucine Leu L 5.98 异亮氨酸异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02 苯丙氨酸苯丙氨酸 phenylalanine

28、 Phe F 5.48 脯氨酸脯氨酸 proline Pro P 6.30 非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸 精选课件53 含有具有一定极性的含有具有一定极性的R基团，在水中溶解度较非基团，在水中溶解度较非 极性疏水性氨基酸大。极性疏水性氨基酸大。 包括：包括： 有羟基的氨基酸（丝、苏）有羟基的氨基酸（丝、苏） 有酰胺基的氨基酸（谷氨酰胺、天冬酰胺）有酰胺基的氨基酸（谷氨酰胺、天冬酰胺） 含巯基的氨基酸（半胱）含巯基的氨基酸（半胱） 芳香族氨基酸（酪、色）芳香族氨基酸（酪、色） 2. 极性中性氨基酸极性中性氨基酸： 精选课件54 色氨酸色氨酸 tryptophan Try W 5.89 丝

29、氨酸丝氨酸 serine Ser S 5.68 酪氨酸酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66 半胱氨酸半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07 蛋氨酸蛋氨酸 methionine Met M 5.74 天冬酰胺天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41 谷氨酰胺谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65 苏氨酸苏氨酸 threonine Thr T 5.60 2. 极性中性氨基酸极性中性氨基酸 精选课件55 有两个羧基，在生理条件下带负电荷。有两个羧基，在生理条件下带负电荷。 包括：天冬氨酸和谷氨酸包括：天冬氨酸和谷氨酸 3. 酸性氨基酸酸性氨基酸 4. 碱性

30、氨基酸碱性氨基酸 在生理条件下带正电荷在生理条件下带正电荷。 包括：侧链含包括：侧链含 - -氨基的赖氨酸氨基的赖氨酸 R R基团含一个带正电荷胍基的精氨酸基团含一个带正电荷胍基的精氨酸 R R基团含一个弱碱性咪唑基的组氨酸基团含一个弱碱性咪唑基的组氨酸 精选课件56 天冬氨酸天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97 谷氨酸谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22 赖氨酸赖氨酸 lysine Lys K 9.74 精氨酸精氨酸 arginine Arg R 10.76 组氨酸组氨酸 histidine His H 7.59 3. 带负电荷的酸性氨基酸带负电荷的

31、酸性氨基酸 4. 带正电荷的碱性氨基酸带正电荷的碱性氨基酸 精选课件57 几种特殊氨基酸 脯氨酸脯氨酸 （亚氨基酸）（亚氨基酸） CH2 CHCOO- NH2+ CH2 CH2 CH2 CHCOO- NH2+ CH2 CH2 精选课件58 -OOC-CH-CH2-S +NH3 S-CH2-CH-COO- +NH3 -OOC-CH-CH2-S +NH3 S-CH2-CH-COO- +NH3 半胱氨酸半胱氨酸 + 胱氨酸胱氨酸 二硫键二硫键 -HH -OOC-CH-CH2-SH +NH3 -OOC-CH-CH2-SH +NH3 HS-CH2-CH-COO- +NH3 HS-CH2-CH-COO-

32、+NH3 精选课件59 ( (二二) )氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质 1.1.物理性质物理性质 都是白色晶体，熔点较高。能溶于强酸和强都是白色晶体，熔点较高。能溶于强酸和强 碱溶液；在水中的溶解度各不相同。碱溶液；在水中的溶解度各不相同。 2.2.两性解离与等电点两性解离与等电点 氨基酸是两性电解质，其解离方式取决于所氨基酸是两性电解质，其解离方式取决于所 处溶液的酸碱度。处溶液的酸碱度。 精选课件60 两性解离及等电点两性解离及等电点 所有的氨基酸都含有碱性的所有的氨基酸都含有碱性的-氨基氨基（或亚（或亚 氨基）和酸性的氨基）和酸性的-羧基羧基，可在酸性溶液中与，可在酸性溶液中与 质子（

33、质子（H+）结合）结合成带正电荷的阳离子，也可成带正电荷的阳离子，也可 在碱性溶液中在碱性溶液中失去质子失去质子变成带负电荷的阴离变成带负电荷的阴离 子，因此氨基酸是一种子，因此氨基酸是一种两性电解质两性电解质，具有两，具有两 性解离的特性。性解离的特性。 氨基酸在溶液中的解离方式取决于其所处氨基酸在溶液中的解离方式取决于其所处 溶液的酸碱度。溶液的酸碱度。 精选课件61 等电点等电点(isoelectric point, pI) 在某一在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳的溶液中，氨基酸解离成阳 离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼 性离子，呈电中性。此时溶

34、液的性离子，呈电中性。此时溶液的pH值值称称 为该氨基酸的为该氨基酸的等电点等电点。 氨基酸的等电点由氨基酸的等电点由-氨基、氨基、-羧基和羧基和R R基基 团的解离状态共同决定。团的解离状态共同决定。 精选课件62 pH=pI +OH- pHpI +H+ +OH- +H+ pH1000个蛋白质个蛋白质 可得到等电点、相当分子质量信息可得到等电点、相当分子质量信息 可得到蛋白质表达谱可得到蛋白质表达谱 可平行运行多个胶可平行运行多个胶 费时、费力；不易自动化费时、费力；不易自动化 疏水、酸性、碱性、疏水、酸性、碱性、200kDa 蛋白易丢失蛋白易丢失 样品负载量受限制样品负载量受限制 2D-

35、HPLC 快速快速 可分离各种蛋白质可分离各种蛋白质 易于自动化易于自动化 样品在液相；馏分易收集样品在液相；馏分易收集 可做样品制备或浓缩可做样品制备或浓缩 不能得到等电点、相对分子质量信息不能得到等电点、相对分子质量信息 尚未实现平行操作尚未实现平行操作 不易得到蛋白质表达谱不易得到蛋白质表达谱 分辨率不够高分辨率不够高 精选课件136 二维色谱分离蛋白质的优势：二维色谱分离蛋白质的优势：快速；可分离各快速；可分离各 种蛋白质；样品在液相，馏分易收集；易于自动化；种蛋白质；样品在液相，馏分易收集；易于自动化； 可做样品制备或浓缩可做样品制备或浓缩 二维色谱分离蛋白质有多种组合模式：二维色谱

36、分离蛋白质有多种组合模式：第一维第一维 色谱一般是离子交换色谱色谱一般是离子交换色谱/凝胶过滤色谱，第二维通凝胶过滤色谱，第二维通 常是反相色谱常是反相色谱 精选课件137 1.2 二维色谱串连质谱分离鉴定细胞蛋二维色谱串连质谱分离鉴定细胞蛋 白质白质 采用二维色谱串连质谱技术可以采用二维色谱串连质谱技术可以对混合蛋白质物对混合蛋白质物 进行直接分离与鉴定进行直接分离与鉴定。 步骤如下：样本蛋白质混合物步骤如下：样本蛋白质混合物-蛋白酶裂解蛋白酶裂解-二维二维 色谱分离色谱分离-质谱分析鉴定蛋白质质谱分析鉴定蛋白质 精选课件138 优势：优势：识别和鉴定低丰度蛋白、膜蛋白、酸性蛋识别和鉴定低丰

37、度蛋白、膜蛋白、酸性蛋 白、碱性蛋白以及相对分子质量大的蛋白质白、碱性蛋白以及相对分子质量大的蛋白质 不足：不足：通过蛋白质直接酶切得到的肽段混合物过通过蛋白质直接酶切得到的肽段混合物过 于复杂，较难实现对细胞全部蛋白质的识别与鉴于复杂，较难实现对细胞全部蛋白质的识别与鉴 定定 精选课件139 2. 同位素标记（同位素标记（ICAT）-亲和色谱亲和色谱-质谱技术质谱技术 ICAT，isotope-coded affinity tagging： 不但可以实现对细胞差异表达蛋白质的定量分析，不但可以实现对细胞差异表达蛋白质的定量分析， 而且可以大大简化被分析样品的复杂性而且可以大大简化被分析样品的

38、复杂性 ICAT方法的关键是方法的关键是ICAT试剂的应用：试剂的应用：半胱氨酸半胱氨酸 生物素标签生物素标签 连接部分连接部分 （重链或轻链）（重链或轻链） 巯基特异反应基团巯基特异反应基团 ICAT试剂示意图试剂示意图 精选课件140 方法：蛋白质进行方法：蛋白质进行ICAT试剂标记试剂标记-蛋白酶切蛋白酶切-亲和色谱分离（只有亲和色谱分离（只有 被同位素标记的肽段能被色谱柱保留）被同位素标记的肽段能被色谱柱保留）-进入质谱进行鉴定进入质谱进行鉴定 通过比较标记重链和轻链试剂肽段在质谱图中信号的强度，通过比较标记重链和轻链试剂肽段在质谱图中信号的强度，可以实现可以实现 对差异表达蛋白质的定

39、量分析对差异表达蛋白质的定量分析，采用串连质谱技术测定肽段的序列，采用串连质谱技术测定肽段的序列， 可以实现蛋白质的可以实现蛋白质的定性鉴定定性鉴定 当同采用ICAt技术进行蛋白质的定量分离与鉴定时，首先是对蛋白 质进行ICAT试剂标记，然后进行蛋白酶切，对蛋白酶切后的多肽混 合物进行亲和色谱分离，混合物中仅仅被同位素标记的肽段能够被 色谱柱保留并进入质谱进行监督，其他大量肽段都不被色谱柱保留。 通过比较标记重链和轻链试剂肽段在质谱图中信号的强度，可以实 现对差异表达蛋白质的定量分析，采用串连质谱技术测定肽段的序 列，可以实现蛋白质的定性鉴定 优势：优势：可以实现对不同条件处理的细胞差异蛋白质

40、的定量分析，而且大大简化了被分离样品的复可以实现对不同条件处理的细胞差异蛋白质的定量分析，而且大大简化了被分离样品的复 杂程度杂程度 不足：不足：无法分析和鉴定不含半胱氨酸的蛋白质；试剂的高价位无法分析和鉴定不含半胱氨酸的蛋白质；试剂的高价位 精选课件141 三、一维电泳（色谱）质谱技术 1.一维一维SDS-PAGE电泳（色谱）质谱电泳（色谱）质谱分离鉴定蛋白质复分离鉴定蛋白质复 合物合物 蛋白质复合物的蛋白质复合物的分离与鉴定分离与鉴定是功能蛋白质组研究的核心内是功能蛋白质组研究的核心内 容；容； SDS-PAGE电泳结合电泳结合MALDI-TOF-MS技术，或者蛋白酶技术，或者蛋白酶 切结

41、合切结合LC-MS-MS技术直接分离和鉴定蛋白质复合物被技术直接分离和鉴定蛋白质复合物被 证明是一种有效的方法。证明是一种有效的方法。 该方法的基本过程如图所示。从生物样本中获得该方法的基本过程如图所示。从生物样本中获得 的蛋白质混合物采用免疫沉淀或者免疫亲和提取的蛋白质混合物采用免疫沉淀或者免疫亲和提取 的方法获得蛋白质复合物，的方法获得蛋白质复合物，SDS-PAGE电泳对蛋白电泳对蛋白 质复合物进行分离、染色、胶上原位酶切，质复合物进行分离、染色、胶上原位酶切， MALDI=TOF-MS分析肽质量指纹普并鉴定蛋白分析肽质量指纹普并鉴定蛋白 质或者对蛋白质复合物直接进行蛋白酶切，对获质或者对

42、蛋白质复合物直接进行蛋白酶切，对获 得的肽段混合物进行得的肽段混合物进行LC-MS-MS分析，通过测定太分析，通过测定太 片段的序列鉴定蛋白质。片段的序列鉴定蛋白质。 精选课件142 2. 一维一维IEF电泳质谱电泳质谱分离鉴定蛋白质分离鉴定蛋白质 与质谱方法相比，与质谱方法相比，SDS-PAGE测定蛋白质相对分子测定蛋白质相对分子 质量误差大，分辨率差，质量误差大，分辨率差，更重要的是，更重要的是，很难获得翻很难获得翻 译后修饰蛋白质相对分子质量变化的准确信息；译后修饰蛋白质相对分子质量变化的准确信息； 精确测定全细胞蛋白质的相对分子质量是难题；精确测定全细胞蛋白质的相对分子质量是难题； 一

43、维一维IEF电泳质谱技术：电泳质谱技术：采用采用IPG胶条进行等电聚胶条进行等电聚 焦电泳，焦电泳，MALDI-TOF-MS对胶条对胶条进行表面直接分析进行表面直接分析。 将一维将一维IEF电泳与准确、灵敏、高分辨率的相对分子电泳与准确、灵敏、高分辨率的相对分子 质量测定技术相结合，误差质量测定技术相结合，误差0.1-0.2 精选课件143 18861886年年GoldsteinGoldstein发明早期质谱仪的离子源，发明早期质谱仪的离子源，1942 1942 年第一台商品化质谱仪出现年第一台商品化质谱仪出现分析小分子化合物。分析小分子化合物。 2020世纪世纪8080年代末期的两项软电离质

44、谱技术年代末期的两项软电离质谱技术电喷电喷 雾电离质谱（雾电离质谱（ESI-MS)ESI-MS)和基质辅助激光解吸电离飞和基质辅助激光解吸电离飞 行时间质谱行时间质谱(MALDI-TOF-MS(MALDI-TOF-MS) )分析蛋白质，分析蛋白质，具有具有 高灵敏度（高灵敏度（pmol）和高质量检测范围（几万到几十万）和高质量检测范围（几万到几十万 Da） MALDI-TOF-MS:MALDI-TOF-MS:高通量，肽指纹图谱，须数据库匹配高通量，肽指纹图谱，须数据库匹配。 ESI-MS:ESI-MS:肽序列标签，特异性高，混合肽测定，操作繁琐。其特肽序列标签，特异性高，混合肽测定，操作繁琐。

45、其特 点之一是可以和液相色谱、毛细管电泳等高效分离手段联用，点之一是可以和液相色谱、毛细管电泳等高效分离手段联用， 因而可以实现复杂化合物分离与鉴定的联机操作。因而可以实现复杂化合物分离与鉴定的联机操作。 精选课件144 MALDI-TOF ：常用飞行时间质量分析器，所构成的仪器常用飞行时间质量分析器，所构成的仪器 成为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪；成为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪；特点是对盐和特点是对盐和 填加物的耐受能力强，且操作简单，测定速度快，易于实现填加物的耐受能力强，且操作简单，测定速度快，易于实现 高通量，谱峰与样品成分的质量有一一对应关系，图谱容易高通量，谱峰与样品

46、成分的质量有一一对应关系，图谱容易 解析解析 离子阱（离子阱（ion trap）质谱仪和傅立叶变换离子回旋共振）质谱仪和傅立叶变换离子回旋共振 （fourier transform ion cyclotron resonance, FTICR） 质谱质谱 电喷雾四极杆飞行时间质谱仪：电喷雾四极杆飞行时间质谱仪：大大提高了仪器的分辨大大提高了仪器的分辨 率和灵敏度率和灵敏度 带有串连质谱功能的带有串连质谱功能的MALDI-TOF质谱仪：引进了源后裂解质谱仪：引进了源后裂解 或碰撞诱导解离装置，或碰撞诱导解离装置，可进行肽序列测定可进行肽序列测定 精选课件145 二、2-DE胶上蛋白质识别与鉴定技

47、术 精选课件146 MALDI-TOF-MS：优点是易于实现高通量，优点是易于实现高通量， 适合于胶上蛋白质的高通量、大规模识别与适合于胶上蛋白质的高通量、大规模识别与 鉴定；但不适合分析蛋白质混合样品或新蛋鉴定；但不适合分析蛋白质混合样品或新蛋 白，且准确度要求较高白，且准确度要求较高 ESI-MS-MS：优点是特异性高，且适合混优点是特异性高，且适合混 合样品的蛋白识别与鉴定；与液相色谱相合样品的蛋白识别与鉴定；与液相色谱相 连可实现分离、鉴定一体化操作；但分析连可实现分离、鉴定一体化操作；但分析 速度慢且操作复杂速度慢且操作复杂 精选课件147 三、生物质谱新技术三、生物质谱新技术 带带

48、MALDI源的四极杆飞行时间质谱源的四极杆飞行时间质谱 仪仪(MALDI QqTOF) 将将MALDI离子源与四极杆飞行时间串离子源与四极杆飞行时间串 连质谱仪连接，连质谱仪连接，从而实现了样品靶上的同从而实现了样品靶上的同 一个样品在同一台质谱仪上的肽质量指纹一个样品在同一台质谱仪上的肽质量指纹 谱分析与肽序列标签分析同时进行。谱分析与肽序列标签分析同时进行。 1.已经成功用于已经成功用于2DE胶上蛋白质的鉴定。胶上蛋白质的鉴定。 精选课件148 2. MALDI-TOF-TOF质谱仪质谱仪 该仪器将该仪器将MALDI-TOF肽质量指纹谱分析的高肽质量指纹谱分析的高 通量与碰撞诱导解离（通量

49、与碰撞诱导解离（collision-induced dissociation, CID）获得的丰富碎片信息相结）获得的丰富碎片信息相结 合，对同一样品相进行肽质量指纹谱分析，接合，对同一样品相进行肽质量指纹谱分析，接 着进行串连质谱分析，着进行串连质谱分析，使得在微量样品水平上使得在微量样品水平上 对蛋白质的鉴定在数秒内完成。对蛋白质的鉴定在数秒内完成。 精选课件149 4.1 4.1 蛋白质的提取蛋白质的提取 精选课件150 精选课件151 精选课件152 3、样品裂解液新鲜制备，并且分装冻存于、样品裂解液新鲜制备，并且分装冻存于-80C， 不要反复冻融样品；不要反复冻融样品； 4、通过超速

50、离心清除所有的杂质，主要去除盐、小、通过超速离心清除所有的杂质，主要去除盐、小 分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、 脂类、酚类等脂类、酚类等 5、加入尿素之后，加温不要超过、加入尿素之后，加温不要超过37C，以防蛋白，以防蛋白 质氨甲酰化。质氨甲酰化。 精选课件153 1、温和裂解的方法：、温和裂解的方法： 适用于组成比较简单的样品或分析特定的细胞器适用于组成比较简单的样品或分析特定的细胞器 （1）渗透裂解：）渗透裂解：通常用于血细胞、组织培养细胞等通常用于血细胞、组织培养细胞等 低渗溶液细胞；低渗溶液细胞； （2）冻融裂解：）冻融裂解：液氮快

51、速冻融，然后在液氮快速冻融，然后在37C融化融化, 反复几次反复几次,适合于细菌、组织培养细胞；适合于细菌、组织培养细胞； （3）去污剂裂解：）去污剂裂解：溶解细胞膜释放内含蛋白质，主溶解细胞膜释放内含蛋白质，主 要针对组织培养细胞；要针对组织培养细胞； （4）酶裂解：）酶裂解：在等渗溶液中用酶去除细胞壁，常用的在等渗溶液中用酶去除细胞壁，常用的 酶有溶菌酶酶有溶菌酶(细菌细菌)、纤维素酶、纤维素酶 + 果胶酶果胶酶(植物植物)、 溶细胞酶（酵母）。溶细胞酶（酵母）。 （一）细胞裂解的方法（一）细胞裂解的方法 精选课件154 2、剧烈的细胞裂解方法、剧烈的细胞裂解方法 主要针对难破碎的细胞、酵

52、母细胞和细胞亚组织主要针对难破碎的细胞、酵母细胞和细胞亚组织 （1）超声裂解法：）超声裂解法：利用超声波产生的切应力破碎细胞，利用超声波产生的切应力破碎细胞， 但要注意产生热量和气泡；但要注意产生热量和气泡； （2）研磨法）研磨法:加液氮和沙进行研磨，适合于固体组织和加液氮和沙进行研磨，适合于固体组织和 微生物细胞；微生物细胞； （3）机械匀浆法：）机械匀浆法：破碎固体软组织和动物组织（切成小破碎固体软组织和动物组织（切成小 片），同时要加入预冷的匀浆溶液；片），同时要加入预冷的匀浆溶液； （4）玻璃珠匀浆法：）玻璃珠匀浆法：适用细胞悬液或微生物，目的在于适用细胞悬液或微生物，目的在于 破碎细

53、胞，提取内含蛋白质。破碎细胞，提取内含蛋白质。 精选课件155 3、蛋白酶抑制剂防止蛋白酶裂解、蛋白酶抑制剂防止蛋白酶裂解 常用的蛋白酶抑制剂常用的蛋白酶抑制剂 （1）PMSF：苯甲磺酰氟，工作浓度苯甲磺酰氟，工作浓度1mM，能不可逆灭活丝氨，能不可逆灭活丝氨 酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中失活。酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中失活。 （2）AEBSF：可在水溶液中使用，工作浓度可在水溶液中使用，工作浓度4mM，作用于，作用于 PMSF相似，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但相似，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但 可能改变蛋白质的等电点。可能改变蛋白质的等电

54、点。 （3）EDTA、EGTA：乙二氨四乙酸和乙二醇双四乙酸的工作乙二氨四乙酸和乙二醇双四乙酸的工作 浓度为浓度为1mM，通过螯合自由的金属离子来抑制金属蛋白酶活性。，通过螯合自由的金属离子来抑制金属蛋白酶活性。 精选课件156 （1）硫酸铵盐析）硫酸铵盐析 原理：高盐溶液中蛋白质倾向于聚合，并从高盐溶液沉淀出原理：高盐溶液中蛋白质倾向于聚合，并从高盐溶液沉淀出 来，从而与核酸分离；来，从而与核酸分离； 步骤：蛋白质浓度步骤：蛋白质浓度1mg/ml1mg/ml，缓冲溶液浓度，缓冲溶液浓度50mM(50mM(含含EDTA),EDTA),缓缓 慢加入慢加入(NH4)(NH4)2 2SOSO4 4至

55、饱和至饱和, ,搅拌搅拌10-30min10-30min，离心分离。，离心分离。 注意点：只用作预分离和富集，且注意点：只用作预分离和富集，且(NH4)(NH4)2 2SOSO4 4会干扰会干扰IEFIEF （2）TCA沉淀沉淀 三氯乙酸（终浓度三氯乙酸（终浓度10-20%10-20%）加到提取液中混均，置冰上）加到提取液中混均，置冰上30min30min， 最后用丙酮或乙醇清洗沉淀除最后用丙酮或乙醇清洗沉淀除TCATCA。该法不易造成蛋白质变性和。该法不易造成蛋白质变性和 化学修饰。化学修饰。 精选课件157 （3）丙酮沉淀）丙酮沉淀 这种有机溶剂通常用来沉淀蛋白，以清除杂质如去污剂、脂类。

56、这种有机溶剂通常用来沉淀蛋白，以清除杂质如去污剂、脂类。 于提取物中加入于提取物中加入3 3倍体积的冰丙酮，倍体积的冰丙酮，-20-20沉淀沉淀2 2小时，离心空气干小时，离心空气干 燥去丙酮。燥去丙酮。 （4）丙酮）丙酮/TCA沉淀沉淀 用丙酮在用丙酮在10%10%的的TCATCA中重悬样品溶液（含有中重悬样品溶液（含有0.010.01的的-巯基乙醇或巯基乙醇或 20mmol/L),-2020mmol/L),-20沉淀沉淀45min,45min,离心分离离心分离, ,丙酮清洗沉淀丙酮清洗沉淀, ,空气干燥。空气干燥。 （5）苯酚提取）苯酚提取 蛋白质提取到饱和酚中，加到甲醇溶液中蛋白质提取到

57、饱和酚中，加到甲醇溶液中NHNH4 4CACA沉淀，然后先用沉淀，然后先用 NHNH4 4CACA洗涤，再用丙酮洗涤，空气干燥去丙酮。本法适合于高杂质的洗涤，再用丙酮洗涤，空气干燥去丙酮。本法适合于高杂质的 植物样品。植物样品。 精选课件158 （1）盐、残留的缓冲液和电性小分子）盐、残留的缓冲液和电性小分子 盐等带电物质会干扰电泳过程、增大溶液电导率，盐等带电物质会干扰电泳过程、增大溶液电导率，通常用透析、通常用透析、 凝胶过滤、沉淀凝胶过滤、沉淀/ /重悬的方法脱盐重悬的方法脱盐，但易使样品丢失。，但易使样品丢失。 （2）内源性小分子）内源性小分子 这些物质通常带负电，使阳极侧的聚焦不全，

58、可采用这些物质通常带负电，使阳极侧的聚焦不全，可采用丙酮丙酮/TCA/TCA 沉淀去除沉淀去除。 （3）离子去污剂）离子去污剂 SDSSDS等离子去污剂，易和多肽形成复合物而干扰等离子去污剂，易和多肽形成复合物而干扰IEFIEF，低温（低温（- - 20200 0C C）的丙酮溶液可除去。）的丙酮溶液可除去。 精选课件159 （4）核酸（）核酸（RNA、DNA） （5）多糖）多糖 精选课件160 （6）脂类）脂类 脂类易和膜蛋白结合成复合物，改变蛋白溶解性、脂类易和膜蛋白结合成复合物，改变蛋白溶解性、 等电点和分子量，采用大量等电点和分子量，采用大量去污剂可除去去污剂可除去。 （7）酚类）酚类

59、 通常出现在植物组织中，通过氧化反应修饰蛋白质，通常出现在植物组织中，通过氧化反应修饰蛋白质， 可用沉淀法去除，或加可用沉淀法去除，或加抑制剂灭活抑制剂灭活多酚氧化酶。多酚氧化酶。 （8 8）不溶物质）不溶物质 不溶物质能阻碍凝胶孔径，通过不溶物质能阻碍凝胶孔径，通过离心离心可去除这些不可去除这些不 溶物质。溶物质。 精选课件161 精选课件162 精选课件163 精选课件164 具体的操作步骤如下：具体的操作步骤如下： 第一步第一步水溶液的提取：水溶液的提取：5-15mg细胞加入细胞加入2ml裂解液裂解液I（40mM Tris）。反复冻融）。反复冻融3-4个循环，加入适量的个循环，加入适量的

60、DNase I和和RNase A， 振荡混匀。离心收集上清，冷冻干燥器中抽干后即为第一步提取振荡混匀。离心收集上清，冷冻干燥器中抽干后即为第一步提取 物。物。 第二步第二步含尿素含尿素/CHAPS/DTT溶液的提取：溶液的提取：向第一步的沉向第一步的沉 淀中加入淀中加入500ul的裂解液的裂解液II（8M尿素，尿素，4%CHAPS， 100mMDTT，40mM Tris等），剧烈震荡混匀，离心收集上清等），剧烈震荡混匀，离心收集上清 即为第二步提取物。即为第二步提取物。 第三步第三步含硫脲含硫脲/SB3-10/TBP溶液的提取：溶液的提取：将上一步的所余将上一步的所余 的沉淀用的沉淀用40mM