尿液中囊泡的提取和鉴定概要

1、尿液中exosome的提取和鉴定exosome的提取（一） 实验准备1. 试剂：Sigma P2714，三乙醇胺，NaOH，蔗糖，去离子水 耗材：超速离心管 50mL， 15mL2. 配制 Isolation solution 50 mL1. 10 mM Triethanolamine （三乙醇胺）（MW 185.7）0.093 g2. 250 mM Sucrose （蔗糖）（MW 342.3）4.28 g3. 加去离子水至45 mL4. 1 M NaOH调 pH至7.6220 卩L5. 加去离子水至50mL6. 加 protease inhibitors day of isolation3.

2、 3. 5X SDS-Laemmli for Western Blot 50 mL1. SDS3.75g2. Glycerol15 mL3. 1 M Tris-HCl,pH 6.82.5 mL4. Bromophenol溴酚蓝dab5. DTT60 mg/mL6. 去离子水至50 mL（二） 实验步骤（Pisitkun 2004; Gonzales, Zhou et al. 2010）1. 将80C冻存的尿液取出解冻，涡旋，分装在50mL离心管中。2. 从-20 C中取出Sigma P2714蛋白酶抑制剂，加入5mL二次水混匀。3. 每50mL尿液中加入625卩L溶解后的蛋白酶抑制剂（12.5

3、卩L/mL Urine ）。4. 于4C, 17000 x g离心15 min。（新鲜尿液25C离心）（超速离心机型号 Hitachi CP80MX5. 取上清液置于超速离心管中，装3管，每管分装8mL, 4 C 200 000 x g离心1 h。（同上新鲜尿液25C）6. 离心后弃上清，再取 17000 x g上清各8mL分置3管中，同上述条件离心。7. 弃上清,3管中各加50卩L isolation solution，涡旋混匀 30 s,转移到一个 1.5 mL Eppendrof 离心管中。8. 加 1 mL 200 mg/mL DTT 95 C孵育 2 min。9. 将上述溶液转移至高

4、速离心管中，并加入 8 mL isolation solution 17000x g超高速离心10min。10. 弃上清，加 50 L isolation solution 溶解沉淀物，在 17 000 x g 离心 15 min。取上清做 1D SDS/PAGE.11. Bradford 法测蛋白总浓度。12. 按1:4体积比加入 5 x SDS-Laemmli缓冲液(含 60 mg/mL DTT),涡旋混匀。13.60 C加热 10 min , -80 C保存。(for western blot )朱墨桃师姐提取 exosome方法(Zhu, Li et al. 2012)1.2,000

5、g for 10 min at 4C ，除去死细胞；2. 取上清， 4 C 10,000 g 离心 30 min ，除去细胞碎片；3. 取上清， 4 C 110,000 g 离心 70 min ，弃上清；4. PBS清洗并重新分散，-80 C保存。5. microbicinchoninic acid assay (Applygen Technologies Inc, China)测定蛋白含量。负染电镜分析(一)实验准备4%paraformaldehyde 多聚甲醛(in PBS pH 7.4 ),1 %Ura nyl acetate 乙酸双氧铀 in dd-WO, 石蜡膜， 200 目镍网(二

6、)实验步骤1. 将20卩L exosomes小体悬样与 4%多聚甲醛(in PBS , pH 7.4 ) 1： 1混匀。2. 取10卩L混合物滴于石蜡膜上，将 200目镍网置于液滴中悬浮 10min。3. 用毛边滤纸从侧面吸干多余液体。4. 在20卩L PBS液滴中悬浮 5min,重复。5. 在20卩L去离子水液滴中悬浮 5min，重复。6. 1%乙酸双氧铀负染液负染1 min，用毛边滤纸从侧面吸干多余液体。7. 将镍网正面朝上置于滤纸上,在有盖的玻璃皿中干燥 15min。8. 样品准备完毕，进行 EMI分析。三、 1D SDS-PAGE一)实验准备储存液配制：1) 2 M Tris-HCl2

7、) 100 g/L SDS 溶液3) 75%( v/v )甘油4) 10 g/L 溴酚蓝溶液 电泳工作液配制：1 ) Acr-Bis 液(2) 4 X分离胶缓冲液3) 100 g/L 过硫酸铵溶液(4) TEMED成品液(5) 5X样品缓冲液(6) 10X电泳缓冲液12%电泳胶的配制考马斯亮蓝染色液和脱色液（二）实验步骤1. 制胶装好灌胶器，在分别在两个洁净小烧杯 （离心管也可）内配制分离胶和浓缩胶混合液（注意灌胶时再加 AP和TEMED,配方见SDS-PAGE溶液配制及具体流程。以枪头搅 拌约10-20 sec,灌胶分离胶。在胶面上小心地铺上几毫米厚的水层，然后常温凝固30 min（胶面与水

8、层间界面清晰说明胶已凝好）。此时倒出水层，浓缩胶混合液加入AP和TEMED枪头搅拌均匀，加入灌胶器，上覆水层，然后插入梳子，凝固2h。2上样跑胶打开固定玻璃板的塑料夹，取出梳子，取下胶板装入电泳槽，在电泳槽中加入电泳缓冲液，上槽灌满，下槽电泳缓冲液的量根据电泳胶数目参照电泳槽上的刻度线确定。根据蛋白定量结果，每条泳道上样量在 15卩g左右。2 X样品缓冲液与样品1：1混合，上 样体积一般为 15-20卩L,插入上样梳上样。电泳条件： step 1: 80V 5min,step 2: 150V 2h, 注意观察溴酚蓝的位置，一般半小时左右完成。3. 染色及脱色关闭电源，取出电泳后的胶板，用刮胶板

9、小心撬开玻璃板将胶取下（不可用蛮力，用二次水润湿比较容易取下来），置于带盖的玻璃皿中，加入染色液（以刚没过凝胶即可），于微波炉加热约 40-70 sec至染色液微沸（注意盖子不要盖的太紧以防染色液爆 沸喷溅），然后于脱色摇床上继续染色约10 min。染色液请倒入专用的回收容器内。淋洗凝胶冲去剩余染料，然后倒入适量的脱色液，微波加热至微沸后于摇床上脱色约10 min，重新换上脱色液室温摇床脱色至完全去除背景色。4. 扫描及后处理脱色后的凝胶置于扫描仪上扫描凝胶图像并保存，不立即酶解的凝胶在二次水中4C冰箱保存。（尽快处理，防止蛋白扩散和变质）四、1D SDS-PAG蛋白质条带胶内酶解（一）实验准

10、备脱色及脱水1.25 mM NH 4HCO 3100 mg NH4HCO3, 50 mL dd H 2O2. 25 mM NH 4HCO 3/50 % ACN100 mg NH4HCO3, 25 mL ACN , 25 mL dd H 2O3. Stock Solution : 1 % 甲酸990 Ldd H2O, 10 yL甲酸4. 0.1 %甲酸100 yLStock solution , 900 yLdd H2O还原和烷基化5. 10 mM DTT1.5 mg DTT/25 mM NH 4HCO 36. 55 mM 碘乙酰胺10 mg 碘乙酰胺 / 25 mM NH 4HCO 3胰酶消化

11、7. Trypsin ( Promega V5113)12.5 ng trypsin/25 mM NH 4HCO3提取肽段8. 50 % ACN/0.5 甲酸500 stock solution , 500 LACN质谱准备9. Millipore ZipTip C18 Pipette Tips ?10. Stock solution : 1% 甲酸11. Equilibration and washing : 0.1 % 甲酸12. Wetting and elution : 50 % ACN/0.1 % 甲酸 100 Ltock solution , 500(1LACN, 400 (iLd

12、d H2O(二)实验步骤1. 将胶条用手术刀片或保险刀片按顺序切下，每条带约1.5 mm大小，7 cm胶条约切12 15 条；2. 将胶条切成1-2 mm2的小块，置于1.5 mL EP管中，记录条带号及相应的位置；3. 用200卩L MilliQ 超纯水振荡清洗 5 min，重复一次；4. 脱色(1) 加入100卩L 25 mM NH 4HCO 3/50 % ACN，涡旋并孵育 10 min,吸干上清；(2) 重复(1)至蓝色褪去，胶粒萎缩变白；(3) 真空干燥胶粒至全干(20min )。5. 还原烷基化(1) 向干胶粒中加入 50卩L 10 mM DTT/25 mM NH4HCO3,涡旋。

13、56C还原反 应1 h，冷至室温；(2) 弃掉上清，立即加入 50卩L 55 mM碘乙酰胺，涡旋后避光室温反应45 min ；(3) 弃掉上清，加入100卩L 25 mM NH4HCO3涡旋并孵育10 min清洗胶粒；(4) 弃掉上清，100卩L 25 mM NH4HCO 3/50 % ACN涡旋并孵育10 min以脱去 胶粒中的水分，重复1次；(5) 真空干燥胶粒至全干(20min )。6. 胶内酶解(1) 加入3倍于胶粒的酶解液冰浴 30 min(或放4C冰箱)，使胶粒复水；(2) 除去过量的Trypsin溶液后，用50卩L 25 mM NH4HCO3清洗胶粒几次， 最后用50卩L 25

14、mM NH4HCO3覆盖胶粒；(3) 涡旋，37C反应过夜。7. 提取肽段(1) 将酶解后上清液转移至 1.5 mL离心管中；(2) 向胶粒中加入30卩L 50 %乙腈/0.1 卿酸，涡旋孵育30min，并超声5 min ；(3) 吸取上清与第一次的上清合并；(4) 重复步骤(2) (3)；(5) 涡旋后冷冻浓缩至 5-10卩L (30min)。加入0.1 %甲酸15卩L,涡旋。五、质谱鉴定1. ZipTip Protocol? ?(1)将50卩L样品加入到96孔板，每个样品一个孔；(2)将20L elution solution加入到干净的离心管中，每个样品一个；(3)Wetti ng Zi

15、pTip :吸10卩L wetti ng solution入针尖，打出，重复操作;(4)Equilibrate ZipTip:吸10卩L平衡液，打出，重复操作；（ 5） Binding ：来回吸、打样品 10 次；（6）Washing :吸 washing solution，打掉；重复 2 次；2. Elution :将离心管中 20卩L elution solution 吸打10次，不要引入空气;3. 将样品浓缩至5卩L加入15卩L 0.1 % 甲酸，混匀后进样；4. 根据质谱结果搜库。六、IEF/SDS-PAGE双向电泳（一）第一向等电聚焦（7cm胶条，pH 3-10）1. 从冰箱中取-2

16、0 C冷冻保存的水化上样缓冲液（1）（不含DTT,不含Bio-Lyte ）小管（1mL/管），置室温溶解。2. 在小管中加入 0.01g DTT , Bio-Lyte 4/6、5/7各2.5卩L,充分混匀。3. 从小管中取出200卩L水化上样缓冲液，加入 50卩L样品，充分混匀。4. 从冰箱取-20 C冷冻保存的IPG预制胶条）7cm pH 3-10 ）,于室温放置10分钟。5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品（7cm胶条一般加125-250卩L,10-100卩g）。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。6.

17、当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。7. 分清胶条的正负极，轻轻地将 IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使 得胶条的正极（标有 +）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液 弄到胶条背面的塑料支撑膜上， 因为这些溶液不会被胶条吸收。 同样还要注意不使胶条下面 的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条， 直到气泡被赶到胶条以外。8.在每根胶条上覆盖1.5 mL矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物 油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。9. 对

18、好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。7cm胶条水化12 小时）18C）主动水化）50V）或被动水化S050V rapid12h水化（若被动水化，此步省却）S1250Vlinear30min除盐S2500Vrapid30min除盐S34000Vlinear3h升压S44000Vrapid20,000Vhr聚焦S5500Vrapid99h保持10.聚焦结束的胶条应立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳,否则将胶条置于样品水化盘中，-20 C冰箱保存。（二）第二向 SDS-PAGE 电泳1. 配制12%勺丙烯酰胺凝胶两块。配 12mL凝胶溶液，每块凝胶 6mL将溶液分别注入玻璃 板夹层中，上部

19、留1cm的空间，用MilliQ 水封面，保持胶面平整。聚合 30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的 MilliQ 水，用 MilliQ 水冲洗。3. 从-20 C冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。4. 配制胶条平衡缓冲液 I 。 5在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸 用 MilliQ 水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余 样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。2.5mL 胶条平衡缓冲液I 。并用滤纸吸取6. 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在

20、有胶条的槽中加入I 。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃 15 分钟。7. 配制胶条平衡缓冲液 II 。8. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液 多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面） 。再加入胶条平衡缓冲 液 II ，继续在水平摇床上缓慢摇晃 15 分钟。9. 用滤纸吸去SDS-PAG糜丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。10. 将琼脂糖封胶液进行加热溶解。11将10X电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1X电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。1 2 .第二次平衡结束后，

21、彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II 。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面） 。13将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1X电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。14将放有胶条的SDS-PAG瞬胶转移到灌胶架上， 短玻璃板一面对着自己。 在凝胶的上方加 入低熔点琼脂糖封胶液。15. 用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完 全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。 在用镊子、 压舌板或平头针头推胶条时， 要注 意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面

22、。16. 放置 5 分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。17. 在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。18. 在电泳槽加入电泳缓冲液后， 接通电源，起始时用的低电流 （ 5mA/gel/1 7cm ）或低电压， 待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm ）, 待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。19. 电泳结束后， 轻轻撬开两层玻璃， 取出凝胶， 并切角以作记号 （戴手套， 防止污染胶面） 。20. 进行染色（按照伯乐染色试剂盒上的操作步骤）Bradford 法测蛋白总浓度检测原理 : Bradford 与蛋白质四级结构 , 特殊氨基酸结合 , 由棕色变成蓝色 ,595nm 检测。该 方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的 , 但不使用于小分子碱性多肽的定量 , 如核糖核 酸酶或溶菌酶 ,去污剂的浓度超过 0.2%影响测定结果 ,如 TritonX-100,SDS,NP-40 等 Bradford 法浓染液的配制：将100mg