大豆幼苗期耐盐碱性的鉴定与关联分析硕士学位论文

1、 硕 士 学 位 论文 大豆幼苗期耐盐碱性的鉴定与关联分析 指导教师 专业名称 作物遗传育种 研究方向 大豆耐逆遗传与生物统计 答辩日期 evaluation and association mapping for soybean salt- alkaline tolerance at seeding stage by zhang wenjie the thesis submitted to nanjing agricultural university nanjing p.r.china in partial fulfillment of the requirements for the m

2、aster degree supervised by prof. zhang yuan-ming completed in june 2012 原 创 性 声 明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究工作所取得 的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发 表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以 明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者(需亲笔)签名： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向 国家有关部门或机

3、构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 保密，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密。 (请在以上方框内打“”) 学位论文作者(需亲笔)签名： 年 月 日 导师(需亲笔)签名： 年 月 日 目 录 摘 要 .i abstract.iii 符号说明(英文缩略词).v 第一章 文献综述.1 1.盐碱胁迫对大豆生长的影响.1 1.1 盐胁迫对大豆生长发育的影响.1 1.2 碱胁迫对大豆生长发育的影响.1 2 大豆耐盐、碱性鉴定及大豆种质资源耐盐、碱

4、性评价.2 2.1 大豆耐盐碱性鉴定.2 2.1.1 耐盐碱的鉴定方法.2 2.1.1.1 田间鉴定.2 2.1.1.2 室内鉴定.2 2.1.2 大豆盐害鉴定指标.3 2.1.2.1 相对盐害指数法.3 2.1.2.2 形态伤害评价法.3 2.1.2.3 综合指数法.4 2.1.2.4 测定钠离子、氯离子浓度法.4 2.2 大豆种质资源耐盐碱性评价.5 3 大豆耐盐性遗传、qtl 定位和耐盐机理研究进展.5 3.1 经典遗传学研究.5 3.1.1 单基因控制.5 3.1.2 多基因控制.6 3.2 大豆耐盐碱 qtl 定位的研究进展 .6 3.2.1 大豆耐盐性 qtl 定位研究进展.7 3

5、.2.2 大豆耐碱性 qtl 定位研究进展.8 3.3 大豆耐盐机理研究进展.9 3.3.1 盐胁迫下盐离子的吸收、外排和转运.9 3.3.2 渗透调节机制.9 3.3.3 野生大豆的耐盐机理.10 4 关联分析的研究进展.10 4.1 关联分析的原理.10 4.1.1 连锁不平衡.11 4.1.2 连锁不平衡的度量.11 4.1.3 影响连锁不平衡的因素及 ld 衰减 .12 4.2 关联分析特点.13 4.3 关联分析的方法、步骤与注意事项.13 4.3.1 关联分析的方法.13 4.3.2 关联分析的步骤.15 4.3.3 关联分析需注意的问题.16 4.4 关联分析在大豆中的应用.17

6、 5 本研究的目的与研究内容.18 第二章 试验材料与分析方法.21 1 材料与方法.21 1.1 实验材料.21 1.2 大豆幼苗期耐盐碱相关性状考察.21 1.3 ssr 全基因组扫描 .21 1.3.1 实验仪器.21 1.3.2 dna 提取.21 1.3.2.1 试剂配制.21 1.3.2.2 dna 提取步骤.22 1.3.3 pcr 扩增.22 1.3.4 凝胶电泳检测.23 1.3.4.1 试剂配制.23 1.3.4.2 凝胶电泳.24 2 数据的分析方法.25 2.1 表型数据分析.25 2.2 连锁不平衡分析.25 2.3 群体结构分析.26 2.4 关联分析.26 第三章

7、 结果与分析.29 1 大豆幼苗期耐盐碱相关性状的表型特征、方差及相关分析.29 1.1 大豆幼苗期耐盐碱相关性状的表型特征分析.29 1.2 方差分析.31 1.3 相关和偏相关分析.33 1.4 连锁不平衡分析.33 2 大豆幼苗期耐盐碱性鉴定.35 3、盐碱指数的定位结果.38 3.1 主根长耐盐、碱指数结果.38 3.2 根鲜重耐盐、碱指数结果.38 3.3 根干重耐盐、碱指数结果.39 3.4 下胚轴长耐盐、碱指数结果.39 3.5 幼苗生物量耐盐、碱指数结果.43 4 原始表型性状的定位结果.43 4.1 主根长定位结果.44 4.2 下胚轴长定位结果.44 4.3 根干重定位结果

8、.45 4.4 根鲜重定位结果.48 4.5 优异等位基因的挖掘.48 第四章 讨论.51 1.与前人耐盐、碱性 qtl 定位结果的比较.51 2.相关分析与 qtl 成簇现象.52 3.与拟南芥耐盐、碱基因的比较.54 4.与现有大豆耐盐、碱基因的比较.55 5.指数与原始性状定位结果的比较.58 6 方法间的比较.63 第五章 全文结论及创新点.65 1 全文结论.65 2 创新点.66 参考文献.67 附 表.79 致 谢.81 攻读硕士期间发表的学术论文.82 大豆幼苗期耐盐碱性的鉴定与关联分析 摘 要 土壤盐碱化是世界范围内影响农作物生产的主要非生物胁迫因子，同时也是降低 作物产量的

9、主要因子。全世界大概有 20%的农业灌溉用地受到盐碱的影响。近年来， 由于不合理农业灌溉进一步加重了耕地盐碱化。为保持大豆在盐碱化土壤环境的持续 生产，培育新品种是一种有效途径。然而，其先决条件是解析大豆耐盐碱性的遗传机 制。 大豆耐盐碱性遗传研究主要是利用双亲分离群体，其结果对作物育种贡献有限。 为克服这一缺陷，利用品种资源群体进行关联分析是一种有效的方式。为此，本研究 以分层随机抽样方法抽取的 257 份大豆品种为研究材料，在大豆幼苗期分别以浓度 为 100 mm 的 nacl 溶液和 10 mm 的 na2co3溶液作为盐、碱处理液，以蒸馏水处理 作为对照，大豆幼苗期主根长、下胚轴长、根

10、鲜重、根干重和幼苗生物量的表型值以及 各性状的耐盐、碱指数为指标，鉴定各大豆品种的耐盐碱性；利用 135 个 ssr 标记扫 描该品种群体获得分子标记数据，通过上位性关联分析方法（eam）和两种改进的压 缩混合线性模型方法（ecmlma 和 ecmlm）进行大豆耐盐碱性的关联分析；利用关 联分析结果，发掘优异等位基因与载体品种，并实施设计育种。其主要结果如下： 1、以大豆幼苗期根鲜重耐盐和耐碱指数为指标，鉴定出两年表现基本一致、重复 性好的耐盐品种 2 个：枫紫田岸豆和白秋 1 号；鉴定出耐碱品种 8 个：临安八月白、嵊 县田埂豆、遵义棕子豆、北川乌眼窝、枫紫田岸豆、广西大粒豆、合豆 6 号和

11、冀豆 13。 枫紫田岸豆既耐盐又耐碱。 2、以耐盐碱指数为指标，通过 ecmlm 方法检测到 129 个 qtls，其中主根长、 根鲜重、根干重、下胚轴长和幼苗生物量分别有 35、24、19、33 和 18 个；通过 eam 方 法共检测到 154 个 qtls，其中主根长、根鲜重、根干重、下胚轴长和幼苗生物量分别 有 28、31、22、33 和 40 个。两种方法共同检测到 30 个 qtls，以 qtl环境互作为主， 贡献率为 0.68%-9.38%。以原始观测值为指标，通过 ecmlma、ecmlm 和 eam 方 法共同检测到 20 个 qtls，其中主根长、下胚轴长、根干重和根鲜重分

12、别有 6、10、1 和 3 个。上述两种结果间既有相同的 qtl，又有一定的互补性。 本研究获得的大豆耐盐碱性部分关联标记与拟南芥耐盐基因的大豆同源基因连 锁，例如 satt453、satt656、satt411、satt687、satt256、satt413、sat_153、satt672 和 satt102。 3、利用关联分析结果，估计各 qtl 的等位基因效应，挖掘优异等位基因与载体 品种，例如，主根长耐盐与耐碱指数减效最大的等位变异分别为 353 bp（sat_256）和 401 bp（sat_344），其载体品种分别为德兴老鼠牙和徐豆 10 号。发现白秋 1 号和北川乌 眼窝均携带耐

13、盐、耐碱的优异等位变异，具有育种利用价值。 关键词：大豆；耐盐碱性；抗性鉴定；关联分析;优异等位基因 evaluation and association mapping for soybean salt-alkaline tolerance at seeding stage abstract soil salinization is an important abiotic stress for crop production worldwide, and seriously reduced crop yield as well. about 20% of the agricultural

14、irrigation land was affected by salt and alkaline. in recent years, soil salinization is more and more serious owing to unsuitable irrigation. to maintain a sustainable production of soybean in a salt stress environment, developing alkaline-salt tolerant cultivars is an efficient way. however, the p

15、rerequisite for the breeding is to elucidate genetic mechanism of the tolerance. previous studies on soybean alkaline-salt tolerance focus on bi-parental segregation populations, and its results have a limited role in crop breeding. to overcome the shortcoming, an alternative approach is to conduct

16、genome-wide association studies (gwas) in in soybean cultivar resource. in this study, therefore, 257 soybean cultivars randomly selected from china, along with 135 ssr marker information, were used to carry out gwas for the tolerance using enriched compression mixed linear model (ecmlm) and epistat

17、ic association mapping (eam) approaches. evaluation of soybean alkaline-salt tolerance was carried out based on length of main root (lr), fresh and dry weights of roots (fwr and dwr), biomass of seedlings (bs) and length of hypocotyls (lh) for healthy seedlings after treatments with control, 100 mm

18、nacl and 10 mm na2co3 for about one week under greenhouse conditions. using results from gwas, genetic effects of all the alleles for each locus were estimated so that elite allele and its cultivar could be found and breeding by design could be performed. the main results were asd follows. first, us

19、ing fwr index at seedling stage, two cultivars (zifengtianandou and baiqiuno.1) have a stable saline tolerant performance, and eight cultivars (linanbayuebai, shengxiantiangengdou, zunyizongzidou, beichuanwuyanwo, zifengtianandou, guangxi- dalidou, hedou no.6 and jidou no.13) have a stable alkaline

20、tolerant performance in 2009 and 2010. note that zifengtianandou has the above two performances simultaneously. second, with alkaline-salt tolerant indices, a total of 129 main-effect qtl: 35 for lr, 24 for fwr, 19 for dwr, 33 for lh and 18 for bs, were detected by the ecmlm method, whereas a total

21、of 154 qtl: 19 for lr, 27 for fwr, 18 for dwr, 26 for lh and 32 for bs, were identified by the eam. it should be noted that there are 30 common qtl with the heritabilities of 0.68%-9.38%, which are mainly qtl-by-environment interaction. with original observations for the alkaline-salt tolerance, 20

22、common qtl: 6 for lr, 10 for lh, 1 for dwr and 3 for fwr, were identified by ecmlma, ecmlm and eam approaches. some same qtl were observed between the above two kinds of results. more importantly, some alkaline-salt tolerance genes in arabidopsis thaliana and soybean are found to be around the toler

23、ance-associated markers in this study, i.e., satt453, of satt656, satt411, satt687 satt256, satt413 sat_153, satt672, and satt102. finally, the above results from gwas were used to estimate allelic effects so that novel allele and its cultivar could be mined, for example, elite alleles for lr alkali

24、ne-salt tolerance indices were 353 bp (sat_256) and 401 bp (sat_344) and their corresponding cultivars were dexinlaoshuya and xudou no. 10. note that baiqiuno.1 and beichuanwuyanwo have the tolerance to salt and alkaline stresses simultaneously, which are of use in soybean breeding. key words： soybe

25、an; tolerance to alkaline-salt stresses; resistance measurement; genome-wide association study; novel allele 符号说明(英文缩略词) 缩写英文名称中文名称 ctabcetyltrimethyl ammonium bromide溴代十六烷基三甲胺 edtaethylene diamine tetra-acetic acid乙二胺四乙酸 pvppolyvinyl pyrrolidone聚乙烯吡咯烷酮 tristris(hydroxymethyl) aminomethane三(羟甲基)氨基甲烷

26、 dnadeoxyribo nucleic acid脱氧核糖核酸 acracrylamide丙烯酰胺 bisbis-acrylamide甲叉双丙烯酰胺 apammonium persulfate过硫酸铵 temedn，n，n，n-tetramethylethlenediaminen，n，n，n-四甲基乙二胺 masmolecular marker-assisted selection分子标记辅助选择 pcrpolymerase chain reaction聚合酶链式反应 ssrsimple sequence repeats简单序列重复 snpsingle nucleotide polymorp

27、hism单核苷酸多态性 aflpamplified fragment length polymorphism扩增片断长度多态性 rapdrandom amplified polymorphic dna随机扩增多态性 dna rflprestriction fragment length polymorphism限制性片段长度多态性 estexpressed sequence tags表达序列标签 qtl quantitative trait locus数量性状基因座 ldlinkage disequilibrium连锁不平衡 gwasgenome-wide association study全

28、基因组关联分析 glmgeneral linear model一般线性模型 mlmmixed linear model混合线性模型 namnested association mapping巢式关联作图 cmlmcompressed mixed linear model压缩的混合线性模型 eamepistatic association mapping上位性关联分析 ecmlmenriched compressed mixed linear model改进的压缩混合线性模型 ecmlmaenriched compressed mixed linear model advanced 改进的压缩混

29、合线性模型的提高 第一部分 文献综述 第一章 文献综述 1. 盐碱胁迫对大豆生长的影响 盐胁迫对植物生长的影响主要分为两个阶段。第一阶段，主要通过渗透胁迫抑 制植物幼叶的生长，该过程相对较快。当植株根际的盐溶液浓度达到临界水平时 （大豆的临界值大约为 40 mm nacl） ，植株茎和叶的生长量开始下降，新叶、新芽 的形成减缓，甚至处于休眠状态，形成的侧枝也相应减少。在单子叶植物中，盐胁 迫的影响主要表现在植株分蘖数下降，从而降低植物总叶面积；而在双子叶植物中 则主要是植株的叶片变小，分支数下降。第二阶段为离子毒害，虽然该过程比较缓 慢，但加速了成熟叶片的衰老进程。当植株成熟叶片中盐浓度达到离

30、子毒害浓度时， 老叶衰亡。因此，当老叶的死亡速率大于新叶的生长速率时，植株光合作用提供的 碳水化合物不能满足新叶的要求，导致植株生长率降低。盐胁迫通过两种不同的作 用方式影响植物生长：第一，土壤中高浓度的盐使得植株根系难以从土壤中吸取水 分。第二，植物体内高浓度的盐对植株产生离子毒害，根系外的盐间接地影响细胞 生长，以及相关的代谢(munns and tester 2008)。 1.1 盐胁迫对大豆生长发育的影响 大豆属于中度耐盐碱作物，盐和碱的胁迫效应主要表现在抑制大豆生长(maas and hoffman 1977)。在大豆中，高浓度的盐胁迫使种子发芽率，植株生物量，作物 产量大幅下降；根

31、、茎的生长减缓，茎节数减少，根冠比提高和干物质的积累下降， 甚至导致植株衰亡(abel and arnold 1964; parker et al. 1983; yang and blanchar 1993; panneerselvam et al. 1998; 罗庆云和於丙军 2001; phang et al. 2008; 贺莉等 2011) 。 但也有研究表明：耐盐性较强的品种(lee 68)在低盐(50mm nacl)胁迫下，株高反而 有所提高(罗庆云和於丙军 2001)。盐胁迫还会降低植株根的渗透调节能力以及钠离 子的外排和水分的吸收(an et al. 2001; joly 198

32、9) 。除此之外，盐胁迫对大豆根瘤的 形成也有较大影响。有研究表明：盐胁迫能显著地降低根瘤数和根瘤干重(bernstein and ogata 1966; singleton and bohlool 1984)，致使根际间可利用的有效氧下降，刺激 植株无氧呼吸途径(serraj et al. 1994)从而导致根瘤生长受到抑制。盐胁迫还能显著的 增加大豆叶片中氯离子和钠离子含量，而降低钾、钙、镁的累积(abel 1969; an et al. 2001; essa 2002)。还有研究表明：盐胁迫下大豆植株体内的可溶性糖，溶性蛋白质， 氨基酸，脯氨酸等有机小分子也会发生相应的变化(el-sam

33、ad and shaddad 1997)。 1.2 碱胁迫对大豆生长发育的影响 植株受到碱胁迫的最显著的变化是叶片黄萎和植株矮化。前人在水稻(yang et al. 1994)、小麦 (millar et al. 2007)和番茄(biatczyk et al. 1994)等作物中均有研究。也有 研究表明：碱胁迫通过降低植物对营养物质的吸收，间接地影响植物生长。高浓度 的碳酸氢盐导致向日葵 (alcntara et al. 1988)、花生(zuo and zhang 2008)和玉米 (celik and vahap katkat 2008)出现铁离子缺乏症。 碱对大豆的影响主要体现在三个方

34、面：第一，高 ph 值；第二，高浓度的钠离子 造成的渗透胁迫和离子毒害；第三，营养缺乏症(tuyen et al. 2010)。由高 ph 值引发 的大豆营养缺乏已有较多报道(coulombe et al. 1984; hansen et al. 2003; norvell and adams 2006;rogovska et al. 2007; zocchi et al. 2007)。 2 大豆耐盐、碱性鉴定及大豆种质资源耐盐、碱性评价 2.1 大豆耐盐碱性鉴定 盐、碱被认为是世界范围内限制大豆生产的主要因子。因此，鉴定、筛选耐盐 碱的优质种质资源直接为生产利用或为育种提供耐盐、碱亲本，对生

35、产或进一步研 究大豆耐盐性具有重要意义。 2.1.1 耐盐碱的鉴定方法 大豆的耐盐碱性鉴定的方法根据鉴定环境的不同主要分为田间鉴定和室内鉴定。 2.1.1.1 田间鉴定 田间鉴定一般在海水倒灌区利用抽提地下咸水与淡水配比成不同浓度的盐溶液 处理大豆植株，从而鉴定不同品种的耐盐性。邵桂花等(1986)在海水倒灌区利用抽提 地下水与淡水配比作为处理液，1 行区，行长 1-1.5m，每行播种 50 粒，每 20 行设 1 行对照，不设重复，在出苗期、苗期和花荚期，分别用电导率 10-15ds/m、15- 17ds/m 和 20-24ds/m 的处理液进行大豆品种耐盐性鉴定。马淑时和王伟(1994)在

36、大豆 第三片复叶展开时，利用浓度为 9.0，电导率为 10ds/m 的盐碱水进行处理，处理前 调查苗数，处理 5 天后调查症状，试验为双行区，行长 2 米行距 35 厘米每行 30 粒 种子，重复 3 次对照品种为吉林 20，以类似于邵桂花等(1986)的相对盐害指数为指 标鉴定大豆耐盐性，并把品种耐盐性分为高耐、耐、中耐、敏感和高敏 5 种类型。 田间鉴定更接近于实际大田生产的环境，但是实验条件难以控制，年份间差异可能 较大，需多年多点同时进行鉴定。 2.1.1.2 室内鉴定 室内鉴定一般在温室或者在光照培养箱中进行。罗庆云和於丙军 (2001) 在玻璃 温室中，将事先催芽48小时的大豆选取

37、胚根长度一致的大豆芽转入盛有厚度为10 cm 石英砂的塑料杯中，每一杯播种8粒，覆盖0.5cm的石英砂，然后将其转入液面高度 为5 cm的1/2 hoagland营养液的周转箱中，培养至两叶一心后定苗，以含nacl浓度分 别为0、20、100和150 mm的1/2 hoagland营养液分别进行培养，14天后，以植株植株 衰亡叶面积占总叶面积的百分率为指标鉴定了6个栽培大豆品种的苗期耐盐性。 valencia等(2008)在温室分别用0、40、80、120和160 mm的nacl培养，鉴定了已知的 吸氯品种（williams、clark、hbkr4924和dare）和排氯品种(s-100、le

38、e 68和 hbkr5525)，并确定浓度为120 mm的nacl溶液是区分吸氯品种和排氯品种最佳浓度。 lee等(2008)将处于v2和v3（2-3片复叶）时期的大豆苗栽植于盛有沙土的塑料盆中用 100 mm的nacl溶液处理以叶面枯萎程度和叶氯含量为指标鉴定了hutcheson (敏感)、 s-100和forest(耐盐)等14个大豆品种。那桂秋等(2009)分别用110 mm的nacl和37.5 mm的na2co3溶液为处理液，分别进行盐、碱胁处理。对照用蒸馏水代替，在 251的光照培养箱中进行发芽试验。在处理后的第7天测定发芽率，然后根据种 子发芽率计算盐、碱害指数，然后进行耐盐碱性分

39、级。室内鉴定具有时间短、容量 大、重复性强和环境影响小等优点。 表1-1 大豆幼苗期耐盐、碱性分级标准（马淑时和王伟 1994) table 1-1 the standars of salt and alkaline index on soybean seeding stage (ma and wang 1994) 级别 level 盐碱害指数 salt or alkaline injury index 耐盐碱类型 salt or alkaline tolerance type 1020.00高耐 high tolerance（ht） 220.0140.00耐 tolerance（t） 340

40、.0160.00中耐 middle tolerance（mt） 460.0180.00敏感 sensitivity（s） 580.01100.00高敏 high sensitivity（hs） 2.1.2 大豆盐害鉴定指标 2.1.2.1 相对盐害指数法 在大豆萌发期测定发芽率，将发芽率换算为相对盐、碱害指数，是对照发芽率 与处理发芽率的差值占对照发芽率的百分比，然后依据盐碱害指数将大豆品种分为 高耐、耐、中耐、敏感和高敏 5 种类型（表 1-1）(邵桂花等 1986; 马淑时和王伟 1994;那桂秋等 2009)。 2.1.2.2 形态伤害评价法 通过测定盐碱胁迫下大豆的生长状况以及形态表现

41、进行耐盐碱级别划分。盐害 调查方法有两种：（1）单株分类记载法（表 1-2） ，通过计算盐害指数评定耐盐级别； （2）田间直接分级法：依据调查标准按品种盐害症状在田间直接分级(邵桂花等 1986，1987；马淑时和王伟 1994)。lee 等(2004)用 f2:5群体定位大豆耐盐 qtl 时， 将盐害级别划分为 05 级(0：所有植株死亡；3：出现盐斑；5：植株叶片正常绿色)。 pantalone 等(1997)和 an 等(2001)将大豆单株盐害症状分为 5 级：1=正常(没有明显 盐斑)，2=轻微盐斑(25%的叶面积出现盐斑)，3=中度盐害(50%的叶面积出现盐斑)， 4=严重失绿(7

42、5%的叶面积出现盐斑)，5=死亡(植株变褐萎焉)，每个品种植株平均值 作为该品种的耐盐级别。 2.1.2.3 综合指数法 寇贺等（2007）通过测定大豆萌发期的发芽率和幼苗期各形态指标并将发芽率 作为因变量进行通经分析，建立了大豆耐盐性鉴定的综合指标体系。 2.1.2.4 测定钠离子、氯离子浓度法 通过测定地上部分或根部各组织的离子浓度鉴定大豆品种的方法(罗庆云和於丙 军 2001; lee et al. 2008; valencia et al. 2008; 刘光宇等 2011)。 单株分类记载法： 表 1-2 大豆幼苗期单株盐害症状分类标准（邵桂花等 1986） table 1-2 the

43、 standard of classification of salt damage on soybean seeding stage（shao et.al. 1986） 盐害级别 （level） 盐害症状 salt stress symptoms in individual plant 0植株生长正常，叶片率，无盐害症状 1植株生长正常，受害叶面积10%或有 4 片绿叶 2植株生长基本正常，受害叶面积 25%或有 3 片绿叶 3植株生长受抑制，受害叶面积 50%或有 2 片绿叶 4植株生长严重受抑制，受害叶面积 75%或有 1 片绿叶 5植株死亡或仅有心叶存活，受害叶面积 75%以上 注：绿

44、叶是指完全展开叶，且有一半叶片未受害 出苗期以受害叶面积为标准，苗期则以绿叶数为分类标准。 盐害指数的计算： 盐害指数（%）=分类记载的株数该级别数值乘积的总和100 调查株数5 2.2 大豆种质资源耐盐碱性评价 邵桂花等（1986）在1983-1985年三年间通过萌芽期、苗期和花荚期的鉴定共鉴 定了4000多份大豆品种。其中分析统计了1716个耐盐和比较耐盐的品种，鉴定出在 不同生育阶段耐盐和比较耐盐品种415个。其中，出苗期242个占14.1%，苗期和花荚 期各占5%左右分别为85和82个；筛选出文丰7号、晋豆33、铁丰8号、单豆2号以及美 国大豆mansoy、morse和一些盐敏感品种h

45、ark和union等。马淑时和王伟 (1994)在 1986-1990年间，对1020份大豆品种进行了耐盐性鉴定，经重复鉴定，筛选出芽期和 苗期耐盐品种42份，高耐盐品种11份，试验表明：大豆品种发芽期耐盐碱性与苗期 耐盐碱性无相关性。罗庆云和於丙军(2001)在大豆苗期考察了nacl胁迫对大豆苗期生 长状况和发育进程，以及大豆体内的钾离子，钠离子，氯离子的分配情况表明：lee 68和南农1138-2的耐盐性较强，南农88-31为中度耐盐大豆品种苏协1号和jackson的耐 盐性较差，中子黄豆乙耐盐性最弱。於丙军和罗庆云(2001)在发芽期和苗期两个阶段 利用发芽指数、盐害指数和耐盐系数等指标

46、鉴定出苗期耐盐性较强的是n5461和lee 68，耐盐性较弱的有n23232和n23674等。王聪等(2009)在苗期以nacl致死浓度为评 价指标，从15个菜用大豆品种中筛选出2个耐盐品种（绿领特早和天峰） ，2个眼敏感 品种（理想高产95-1和绿领3号） 。那桂秋等(2009)分别用不同浓度的盐和碱处理以盐 害指数为指标鉴定了100份大豆品种，筛选出高耐盐品种5个，耐盐品种21个，中度 耐盐品种41个，敏感品种22个，高度敏感品种11个；高耐碱品种7个，耐碱品种16个， 中度耐碱品种24个，敏感品种37个，高度敏感品种16个，且同一品中耐盐碱趋势基 本一致。刘光宇等(2011)通过大豆叶片

47、盐害症状分级鉴定出耐盐大豆品种科丰14号、 文丰7号、冀豆12、豫豆18和avery等品种。 3 大豆耐盐性遗传、qtl 定位和耐盐机理研究进展 3.1 经典遗传学研究 植物耐盐碱性的遗传机制比较复杂。abel（1969）研究认为单一显性基因控制 大豆品种 lee 的耐盐性。邵桂花等(1994)的研究也表明：大豆的耐盐性受一对基因控 制，且耐盐为显性，盐敏感为隐性，正反交组合表现完全一致，表明属核基因控制， 不存在母本或细胞质效应。但是，也有研究表明植物的耐盐、碱性受多基因控制。 在拟南芥(katori et al. 2010)、番茄(foolad et al. 1997)、水稻(wang e

48、t al. 2011)和大豆 (chen et al. 2008)的耐盐性均受多基因控制。 3.1.1 单基因控制 在大豆中，abel 在 1969 年首先研究了大豆耐盐性的遗传机理，分别以吸氯品种 (jackson、n53-505 和 b54-842)与排氯品种（lee 和 n53-509) 杂交，通过亲本及其后 代群体鉴定耐盐性。研究结果表明：cl-积累能力相似的亲本间杂交衍生的 f2、f3代 家系表现与亲本的耐盐性表现一致。在 cl-积累能力不同的亲本间的 8 个杂交组合中， f2代排氯和吸氯的分离比为 3:1，f2代的排氯植株的分离比为 1:2，吸氯植株没有分 离。无论轮回亲本是排氯品

49、种还是吸氯品种，f1代回交排氯和吸氯的分离比为 1:1， 说明大豆耐盐性受单个显性基因控制。其中基因 ncl 控制排氯，ncl 控制吸氯。邵桂 花等（1994）也通过耐盐性品种和盐敏感品种杂交研究了大豆耐盐性。在盐碱地结 合浇灌盐水和淡水配比为 1:1 的混合液，鉴定了 1716 份中国大豆和 260 份美国大豆。 结果表明：当双亲是耐盐品种时，f1、f2和 f3表现为耐盐。当双亲是盐敏感品种时， f1、f2和 f3表现为盐敏感。当耐盐品种与盐敏感品种杂交时，f1表现为耐盐。f2代 耐盐与盐敏感的分离比为 3：1。大豆的耐盐性受一对基因控制，且耐盐为显性，盐 敏感为隐性，正反交组合表现完全一致

50、，表明属核基因控制，不存在母本或细胞质 效应，研究结果与 abel 在 1969 年的结论相似。 在野生大豆中，lee等(2009)以耐盐品系pi483463和s-100以及盐敏感品种 hutcheson分别杂交，亲本和其衍生的后裔群体用100mm的nacl溶液处理评估耐盐性。 在pi483463与hutcheson杂交衍生的f2后代中，耐盐与盐敏感的分离比为3:1，f 2:3 家 系耐盐和盐敏感的分离比为1:2:1。用pi483463与s-100杂交衍生的f2代耐盐和盐敏感 的分离比为15：1，这说明两个不同种质资源的携带的耐盐基因不同。他们认为 pi483463受单一显性基因控制耐盐性，这

51、与s-100中携带的耐盐基因不同。这说明 ncl2是一个新的耐盐性等位基因。 3.1.2 多基因控制 随着研究的深入，研究者们发现大豆耐盐碱性受多基因控制。罗庆云等 （2004）以栽培大豆南农1138-2(耐盐)和南农88-31(较耐盐)分别与jackson(盐敏感) 2 套杂交组合，通过pl、p2、fl、f2和f2：3苗期植株耐盐性调查，利用主基因+多基因混 合遗传模型联合分离分析了栽培大豆耐盐性的遗传规律。结果表明：南农88- 31jackson和南农1138-2南农88-31耐盐性遗传均符合加性-显性-上位性多基因遗 传模式，在高世代选择耐盐性植株的效率较高，从f2:3估计南农88-31

52、jackson组合 的nac1耐性微效基因遗传率为82.13%；南农1138-2南农88-31组合的耐盐性微效基 因遗传率为67.47%。chen et al. (2008)也发现大豆耐盐性受主效qtl和微效qtl共同 作用。 3.2 大豆耐盐碱 qtl 定位的研究进展 目前已有很多关于植物耐盐性基因克隆的报道(munns 2005)。这些基因在调节植 物耐盐性生理的过程中起到了关键作用。在拟南芥中，quesada (2002)以 102 个野生 品种和 ler-0 和 col-4 杂交衍生的 100 个 f8 个体组成的 ril 群体分析了拟南芥的耐 盐性。他们检测到了 6 个萌发期耐盐的

53、qtls 以及 5 个营养生长期耐盐的 qtls，并 分析了与 qtl 相关的候选基因。clerkx 等(2004)用 landsberg erecta (ler) shakdara (sha)衍生的 114 个 f9 个体组成的 ril 群体定位了一个位于 5 号染色体上的萌发期耐 盐的 qtl，该 qtl 解释了 49.4%的表型变异。derose-wilson and gaut (2011)在拟南 芥萌芽期和幼苗期结合 qtl 作图、关联作图和表达谱数据定位了耐盐相关的基因组 区域，并分析了可能的候选基因。目前，很多调控拟南芥耐盐性的基因也被成功克 隆。ren 等(2010)利用自然变异

54、的拟南芥品种定位了一个萌发期和幼苗期耐盐并且对 脱落酸（aba）敏感的 qtl，该 qtl 与拟南芥根长（root length）和绿苗率 （percentage of green seedlings）相关。用 landsberg erecta (ler; 盐、aba 敏感) shakdara (sha; 耐盐、aba)衍生的重组自交群体进行 qtl 作图并克隆了主效 qtl- ras1（response to aba and salt 1） 。同时还分析了 ras1 的作用模式：ras1 通过 提高拟南芥对 aba 萌发期和幼苗期敏感性提高其耐盐性。sos（salt overly sensi

55、tive）是盐胁迫下调节离子平衡的主要途径，sos2 控制着 sos1 (atnhx7)介导 钠离子从细胞质的外排和液泡的 na+ /h+反转运子介导的将 na+截留到液泡中(shi et al. 2000; qiu et al. 2004)。拟南芥中 athkt1 的作用是调节钠离子和钾离子平衡 (berthomieu et al. 2003)。在水稻中，wang 等(2011)发现了 16 个控制水稻种子发芽期 的耐盐性 qtls，每一个 qtl 解释了 4.643.7%的表型变异。lin 等(2004)报道了两 个效应较大的主效 qtls：qsnc-7 是控制水稻茎秆钠离子浓度的 qtl

56、，qskc-1 是控 制水稻茎秆部钾离子浓度的 qtl，这两个 qtl 分别解释了 48.5%和 40.1% 的总变异。 ren 等(2005)成功克隆了一个水稻耐盐 qtl-skc1。skc1 编码了一个 hkt 类型的选 择性向木质部转运（卸载）na+的转运子。huang 等(2009)克隆了一个负向调节水稻 气孔关闭的基因dst（drought and salt tolerance） 。该基因缺失导致水稻气孔关闭， 气孔密度下降，以增强耐旱耐、耐盐性。thomson 等(2010)以 ir29 和 pokkail 衍生的 140 个重组自交系（ril）定位了一个位于 1 号染色体的水稻苗

57、期耐盐的 qtl，主要 调节茎部 na+/k+离子平衡。 3.2.1 大豆耐盐性 qtl 定位研究进展 目前也有较多关于大豆耐盐碱遗传研究的报道，但是研究还相对比较薄弱。lee 等（2004）年首先以盐敏感品种 s-100 和耐盐品种 tokyo 杂交，同时利用盐渍土和 温室盆栽方法对 f2:5群体的耐盐性进行鉴定，通过多重回归分析，发现位于 n 连锁 群上分子标记 sat_091 与耐盐性紧密关联。利用 mapmanager 软件将该基因定位于 satt237 和 sat_091 之间，区间大小 3.6 cm。该 qtl 在大田、温室和联合环境中分别 解释了 41、60和 79遗传变异。ch

58、en 等(2008)以科丰 1 号（耐盐，salt tolerant）与南农 1138-2（盐敏感，salt sensitive）杂交衍生的 184 个 f7:11家系组成的 重组自交系作为作图群体，用 winqtlcart 软件检测到了 8 个大豆耐盐 qtls，其中 一个主效 qtl 在大田和温室环境中均被检测到，该主效 qtl 位于 g 连锁群的 sat_164 和 sat_358 标记之间。hamwieh 和 xu (2008)以盐敏感的栽培大豆 jackson 与 耐盐的野生大豆 jws156-1 杂交衍生的 f2群体（n=225），发现了一个位于 n 连锁群 的耐盐性主效 qtl，

59、位于 satt339 与 satt237 之间，该 qtl 具有较强的显性效应，解 释了 68.7%耐盐性的表型变异。他们认为耐盐性 qtl 对盐敏感具有显性作用，耐盐 qtl 在野生和栽培大豆中都是保守的。hamwieh 等(2011)利用 ft-abyara9c01 和晋 豆 no.690197 杂交衍生的两个重组自交系群体（ril）群体发现了一个位于 n 连锁群 上的 qtl，位于标记 sat_091 与 sat_304 之间，该 qtl 在两个群体中分别解释了 44.0 和 47.1%的大豆耐盐性的总变异。lee 等(2009) 报道了野生大豆 pi483463 有一 个不同于栽培大豆

60、 s-100 的显性基因控制大豆耐盐性。xu 和 tuyen（未发表）以栽 培大豆 jackson 与野生耐盐大豆 jws061-1 杂交衍生的 117 个 f6代 ril 的群体用于耐 盐性 qtl 定位，研究发现了一个耐盐的主效 qtl，该 qtl 解释了 31.5%的耐盐性 的表型变异，位于 n 连锁群的标记 sat_091 与 satt339 之间。该结果证明了在野生大 豆和栽培大豆之间耐盐性基因的保守性。陈华涛等(2011)利用科丰 1 号和南农 1138-2 为亲本构建的重组自交系群体进行大豆苗期耐盐性的遗传及 qtl 定位分析。研究以 每个家系的平均存活时间为耐盐指标，采用主基因