m6A甲基化研究方法

1、标准实用文案RNA甲基化修饰（m6A ）研究思路及方案设计RNA 甲基化修饰约占所有 RNA 修饰的60%以上，而 N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是高等生物 mRNA 和IncRNAs 上最为普遍的修饰。目前发现 microRNA ，circRNA, rRNA, tRNA 和 snoRNA 上都有发生 m6A 修饰。 m6A 修饰 主要发生在 RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能由“编码器（Writer） ”、“消码器（Eraser） ”和“读码器（Reader） ”决定1。“编码器（Writer） ”即甲基转移酶，目前已知这个复合物的 成分有 METTL3，

2、METTL14, WTAP 和KIAA1429 ;而 ALKBH5和FTO作为去甲基酶（消 码器）可逆转甲基化；m6A由m6A结合蛋白识别，目前发现 m6A结合蛋白（读码器）有YTH 结构域蛋白（包括 YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3 ，YTHDC1 和 YTHDC2 ）和核不均一 蛋白 HNRNP 家族（HNRNPA2B1 和 HNRNPC ）。m6A酶系统METTL3是早先被鉴定为结合SAM的组件，其缺失引起小鼠胚胎干细胞、Hela细胞和HepG2 细胞中m6A peaks 的减少。METTL3及其同源蛋白 METTL14 定位在富含剪切因 子的细胞核内亚细胞器核小斑（Nucl

3、ear speckle ）上，显示m6A修饰可能和RNA的剪切加工相关。 WTAP与METTL3 -METTL14 二聚体相互作用，并共定位于核小斑，影响 甲基化效率，参与 mRNA剪。而KIAA1429 作为候选的甲基转移酶复合体的新亚基，是整 体甲基化进程所必须的2。FTO是ALKB家族的成员，作为第一个被发现的去甲基酶，可 影响剪切因子SRSF2的RNA结合能力，进而调控pre-mRNA 的剪切加工过程3。目前已 发现FTO调节异常与肥胖、大脑畸形和生长迟缓相关，揭示m6A可能对这些疾病具有重要的调节功能4-6。ALKBH5是ALKB家族中被发现具有去甲基作用的另一个成员，以 RNase

4、 A敏感的方式与核小斑共定位，它可直接催化m6A-甲基化腺苷去除甲基而不同于FTO的氧化去甲基化7.此外，ALKBH5和它的去甲基化活性影响新生mRNA合的成和剪切效率7，且ALKBH5敲除雄性小鼠表现出精子发生异常，这可能是精子发生相关基因 表达改变的结果7。m6A mRNA 修饰执行其功能主要通过两个途径：|精细调控甲基化转录本的结构，以阻止或诱使蛋白-RNA相互作用；或被直接由 m6A结合蛋白识别，诱发后续反应。目前一类含有 YTH功能结构域的蛋白被鉴定为m6A修饰的结合蛋白。其中YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3 , YTHDC1 和 YTHDC2 己被证实是m6A的结合蛋白

5、 YTHDF1主要影响m6A修饰基因的翻译，YTHDF2主要影响m6A修饰基因的降解，而YTHDC1结合m6A修饰的基因后影响其剪接。HNRNPC是一种丰富的核 RNA结合蛋白，参与pre-mRNA 的加工8，且研究表明 HNRNPC 通过m6A与RNA结合调控目标转录 本的丰度和选择性剪切9.WritersFigure 1 | The writer, eraser and reader proteins of mW图1 m6A 修饰的酶系统10m6A生物学功能越来越多的证据表明 m6A修饰在哺乳动物中发挥重要的生物功能。例如，在转录后水平上调控RNA的稳定性11、定位12、运输、剪切13和翻

6、译14。 Claudio R.等发现依赖 METTL3的pri-miRNA 甲基化，会促进DGCR8识别和加工，从而促进 microRNA 的成熟 15。此外，m6A 识别蛋白 HNRNPA2B1 促进 pri-miRNA 加工成 pre-miRNA 16。 另外，环状 RNA上m6A的修饰能促进环状 RNA的翻译17。 m6A修饰在基因表达调控 中起着重要的作用，其调控机制的异常可能与人类疾病或癌症相关。目前发现m6A可能会影响精子发育（ALKBH5，METTL3，Ythdc2 ）、发育（METTL3、FTO、ALKBH5 ）、免疫（METTL3 ）、UV诱导的DNA 损伤反应（METTL3

7、，FTO）、肿瘤生成（YTHDF2 ）或转移（METTL14 ）、干细胞更新（METTL14 ）、脂肪分化（FTO）、生物节律、细胞发育分化、 细胞分裂及其它的一些生命过程。例如，ALKBH5敲除的雄性小鼠增加了 mRNA中的m（6）A 修饰，其特点是凋亡影响减数分裂中期的精子细胞，引起生育能力受损7。 METTL3和METTL14增加弱精症精子的 m6A水平18，在生殖细胞中，METTL3的敲除严重抑制精 子分化和减数分裂的发生，转录组和m6A分析显示精子发生相关基因的表达和选择性剪接发生了改变19。YTHDC2可促进靶基因的翻译效率，并降低其mRNA的丰度，在精子发生过程中起关键作用。当减

8、数分裂开始时YTHDC2表达上调，YTHDC2敲除小鼠的生殖细胞没有经过偶线期的发育导致小鼠不育20。在DNA损伤反应中，METTL3可促进DNA聚合酶k（ Pol k）与核酸剪切修复途径快速定位到UV弓|起的DNA损伤位点，当缺失METTL3时，细胞无法迅速修复UV照射引起的突变，并且对 UV照射更加敏感25。在淋巴细胞性小鼠过继转移模型中，Mettl3缺陷通过影响mRNA m6A修饰，降低SOCS家族mRNA衰减，增加 mRNA和蛋白表达水平，从而抑制IL-7介导的STAT5活性和T细胞内稳态增殖和分化，进而抑制肠炎的发生21。在肝癌中，METTL14 通过调控pri-miRNA文档标准实

9、用文案Pli-inRhfA的m6A修饰，影响 MiR-126 的生成加工，从而抑制肝癌的转移22。在乳腺癌细胞中，低氧刺激能促进依赖低氧诱导因子HIF的ALKBH5的表达，而 ALKBH5过表达降低了NANOG mRNA的m6A修饰，从而稳定 mRNA提高NANOG 的表达水平，最终增加乳腺癌干细胞所占的比例23。此外，低氧诱导乳腺癌细胞中依赖ZNF217的NANOG 和KLF4的mRNA m6A甲基化抑制，且ALKBH5敲除显著降低免疫缺陷小鼠乳腺癌的肺转移24。在肺癌中，METTL3能够促进肺腺癌细胞的生长、生存和侵袭，但还不清楚它是否作为m6A调节器或效应器发挥作用25。在急性髓细胞白血

10、病(AML )患者中，mA 调控基因的突变或拷贝数变化与 TP53突变存在密切联系，且 m (6) A 调控基因的改变与 AML不良预后相关26。此外，FTO在AML中高表达，它通过降低 mRNA 转录本中的 m(6)水平，调节ASB2和RARA等靶点的表达，增强了白血病癌基因介导的细胞转化和白血病形成，并抑制全反式维甲酸(ATRA)诱导的AML细胞分化27。在脂肪形成过程中，FTO 表达与m6A水平成负相关，促进脂肪形成 3。在胶质细胞瘤样细胞中， ALKBH5通过IncRNA FOXM1介导FOXM1基因pre-mRNA 上的m6A修饰维持胶质瘤细胞的成瘤性 28。此外，甲基转移酶 MET

11、TL3或METTL14的敲除，能够改变m6A的富集和ADAM19 的表达，极大地促进了胶质瘤细胞的生长、自我更新和肿瘤形成29。kiltiei mi k Illi iiidr-h Mild rtiiKiiinn/in1,A WHiuklir啊DPI. iiRNAdber l jiopinMiiH 胃ud盼 and fundings图2 m6A RNA 修饰和介导的功能30m6A的研究方向(1 )主要是通过研究 m6A修饰相关的甲基化、去甲基化酶和识别蛋白的功能，进而研究m6A修饰的生物学功能和作用机制： 一般通过敲除 m6A酶分子，研究下游功能 基因分子的表达和 m6A甲基化情况，通过介导相关

12、基因异常(可变剪切、稳定性、 翻译、miRNA调控)影响细胞表型和功能特征。(2) m6A修饰图谱构建及作用机制：通过m6A甲基化测序(MeRIP-Seq, miCLIP )构建疾病细胞模型或者发病组织的m6A修饰谱，分析m6A的motif, peaks 数量及分布，Peak关联基因的特征，联合RNA-seq研究m6A甲基化与表达的关系。m6A研究思路文档豔体甲基化榆测甲基化酶与下游基因及前休表达、甲基化的关系谛选异常表达的甲基化陷甲基化醉与下游基因加工或 表达调控因子的关系确定甲基化騎的临床奁义和细胞功能下游基因或调控因子对肿瘤细胸表型和功能的影晌下游基因的谛选m6A研究方案研究案例研究案例

13、一(m6A修饰图谱分析)Berulava T, Rahma nn S, Rademacher K, Klein-Hitpass L, Horsthemke B:N6-ade nosi ne methylatio n in MiRNAs. PLoS One 2015, 10( 2):e0118438.在许多不同种类的 RNA中，都已观察到 N6 -腺苷(m6A)的甲基化，但其在 microRNAs 中 还没有被研究。研究者在FTO1C1, FTO2D4 和FTO3C3细胞系中，通过敲除m6A甲基转 移酶FTO筛选到表达差异的 microRNA,说明miRNA受m6A甲基化的调控。进一步通过MeR

14、IP-Seq 发现相当一部分的 microRNA 具有m6A修饰。通过motif分析，他们发现了区分甲基化和非甲基化microRNA 的一致序列。该文章所述的表观遗传修饰在基因表达的转录后调控的复杂性上增加了一个新的层次。10图1 FTO敲除对甲基化的 miRNAs的稳定状态的影响。研究案例二（机制研究）IF=13.2Ma JZ, Ya ng F, Zhou CC, Liu F, Yua n JH, Wang F, Wang TT, Xu QG, Zhou WP, Sun SH:care inomabyMETTL14 suppresses the metastatic potential of

15、 hepatocellularmodulati ngN6-methylade nosin e-depe ndentprimary MicroRNAprocess ingHepatology 2017, 65 (2):529-543.m6A修饰已被证明具有重要的生物学功能，但其在癌症上的作用还未得到较好的研究。为探索m6A修饰是否参与肝癌的调控，作者利用试剂盒检测发现m6A整体甲基化在肝癌下调，分离RNA做m6A免疫印迹验证 m6A水平在肝癌中下调。为研究哪些因子导致 m6A在肝癌的下调，作者在 20例肝癌及癌旁中检测 m6A甲基化酶 和去甲基酶的表达，发现 METTL14在肝癌显著下调，进一步

16、通过 130例病人分析发现 METTL14作为肝癌预后因子，细胞实验发现其敲除可增强肝癌转移。接下来作者研究 METTL14抑制肝癌转移的机制，由于已有研究显示m6A修饰能够增强DGCR8蛋白识别pri-miRNAs ，促进miRNAs的成熟，因此作者在 METTL14敲除细胞中检测miRNA和pri-miRNAs的表达，发现miR-126下调。通过免疫沉淀反应发现METTL14与DGCR8依赖RNA相互作用，且 CLIP实验显示 DGCR8与m6A-RNA 相互作用且敲除 METTL14后结合作用降低，说明METTL14通过m6A修饰促进DGCR8识别pri-miR-126.最后细胞实验证明

17、MiR-126 能够回复 METTL14的肝癌细胞转移抑制功能，证明了METTL14通过m6A修饰促进 miR-126 加工，从而抑制肝癌细胞转移。图1 METTL14 在肝癌中下调图2 METTL14 依赖的m6A通过 DGCR8 调控miR-126 加工研究案例三（机制研究）IF=27.4Zhang S, Zhao BS, Zhou A, Lin K, Zheng S, Lu Z, Chen Y, Sulman EP,Xie K, Bogler O et al :m6A Demethylase ALKBH5 Mai ntai nsTumorige nicityof Glioblastoma

18、 Stem-likeCells by Sustai ning FOXM1 Expressio n and Cell Proliferatio n Program.Can cer Cell2017, 31 (4):591-606 e596.DNA甲基化异常是胶质瘤的表观遗传调控因子，但RNA甲基化在肿瘤包括恶性胶质瘤（GBM）中的调控还尚未清楚。 为研究m6A调节可能导致 GBM患者临床疗效不佳， 作者通过TCGA数据库，发现ALKBH5在恶性胶质瘤样干细胞 （GSCs）中高表达且与GBM病人不良预后相关，干扰ALKBH5 降低GSCs细胞的自我更新能力且抑制GSCs增殖，进步体内验证敲除ALK

19、BH5可抑制肿瘤生长。为研究ALKBH5的m6A作用机制，作者利用芯片和m6A-seq 筛选到胶质瘤增殖相关的F0XM1，最后通过 qPCR、WB、免疫荧光、核质分离 WB/qPCR、RIP和MeRIP等实验证明ALKBH5通过去甲基化初期转录本调节F0XM1在GSCs中的表达。为研究ALKBH5对F0XM1的作用是否受其他因子的调节，作者研究了F0XM1的邻近基因，发现IncRNA F0XM1-AS 与F0XM1序列互补，且共表达、共定位，进一步通过 RIP, RNA pull down等实验证明lncRNA FOXM1-AS促进ALKBH5和FOXM1初级转录本的相互 作用。最后通过细胞实

20、验进一步验证ALKBH5在IncRNA FOXM1-AS 的作用下维持FOXM1的表达和细胞增殖程序，从而维持GSCs的干性。G3C1113SC17阴丁 3WKA *Da iLnAqLS rrA r*w- ui c-GrmrKans rcF-nr*AQGACLk m Acy20l6i iJME-EFrwrwfli图 1 ALKBH5敲除细胞中 UiCrl I KFHFiDm6A修饰的特征和基因表达的变化1. Fu Y, DominissiniD, Rechavi G, He C: Gene expressionregulationmediatedthrough reversible m(6)A

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26、cturalswitches regulate8.Cie nikovaZ, DambergerFF, Hall J,AllainFH, Maris C: Structuralandmecha ni sticin sightsinto poly(urid ine)tractrecognitionby thehn RNP CRNA recog niti on motifJ Am Chem Soc2014,136 (41):14536-14544.9.LiuN,DaiQ,ZhengG,HeC,Parisie nM,PanT:RNA-protein in teractio ns.Nature 2015

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