采后苹果与炭疽菌的相互作用及病害控制机理研究

1、采后苹果与炭疽菌的 相互作用及病害控制 机理研究 Contents 引言引言 病原侵入过程与互作病原侵入过程与互作 实验操作流程实验操作流程 结果分析及展望结果分析及展望4 1 2 3 引言 苹果炭疽病是黄河故道地区苹果树三大病害(轮纹病!炭疽病和早 期落叶病)之一,近年来,随着主栽品种的更迭,质优但感病品种的栽 培面积不断扩大,该病的发生与危害日趋严重,给苹果生产造成了 很大的损失,严重影响了苹果的质量和产量。 果实采后腐烂是一个全球性问题,新鲜水果在采收、分级、包装、 运输、贮藏、批发、零售整个采后流通过程中都有可能腐烂损失。 果实产品变质腐烂的原因可以归结为三个方面: 1、果实组织的生理

2、失调或衰老 2、病原微生物侵染 3采收及采后环节中的机械损伤 三者相互影响,但最终是病原微生物侵染引起果蔬采后腐烂 病原介绍 Glomerella cingulata(Stonem)Spauld et Schrenk为子囊菌小丛 壳菌。无性世代Gleosporium fructigenum Berk.为半知菌黑盘孢 目，果生盘长孢菌。 温度、湿度、PH对病原菌的影响 一、炭疽菌适应于高温高湿“菌丝在20一30生长良好,生长最 适温度为28,最低和最高温度分别为10 和35 分生抱子萌 发以为25 最好。 二、相对湿度小于80%时菌丝不能生长，分生抱子萌发对湿度要 求严格,仅在自由水和有水膜的情

3、况下萌发。 三、 pH3一H范围内均可营养生长,pH2一11范围内抱子均可萌发， 酸性条件下抱子萌发率较碱性条件下高。 形成感染泡形成感染泡 感染泡产生菌丝感染泡产生菌丝 穿透角质层和细胞壁穿透角质层和细胞壁 附着胞下方附着胞下方 炭疽菌侵入结构与过程 接触后顶端膨胀接触后顶端膨胀 具有厚壁具有厚壁 分生孢子单细胞分生孢子单细胞 湿润环境湿润环境t 产生 单一 芽管 产生附着胞 穿透菌丝 初生菌丝初生菌丝 炭疽病菌具有潜伏侵染特性炭疽病菌具有潜伏侵染特性, 苹果幼果苹果幼果 期感染后期感染后,病菌常以侵染丝在果皮中滞病菌常以侵染丝在果皮中滞 育育,不发病不发病,待果实近成熟时或贮运期间待果实近

4、成熟时或贮运期间 才陆续发病才陆续发病果实发病一般从果点即皮果实发病一般从果点即皮 孔开始发病孔开始发病 病原真菌致病机制 植物病原真菌通常可向外分泌细胞壁降解酶、毒素、激素、多糖 等物质,它们在致病过程中起重要作用,称为致病生化因子。 植物细胞壁一般分为3部分:中胶层、初生壁和次生壁,其主要组成 成分为果胶化合物、纤维素及半纤维素,这些成分构成了植物体的 天然屏障,阻碍了病菌的侵入。 病原分泌能够降解植物细胞壁的酶(CWDE),包括果胶酶、纤维素 酶、蛋白酶、淀粉酶、磷酸脂酶等类型，这些胞壁降解酶协同作 用可引起寄主组织浸解,参与病害的扩展。植物细胞的大规模死亡 和组织的崩溃,细胞死亡的原因

5、是裂解酶木身的毒性或酶分解的果 胶(peetin)或多聚半乳糖普(polygalaetose)片段激发寄主的过敏 反应。 主要介绍如下： 一、胞壁讲解酶（果胶酶、纤维素酶） 二、其他致病因子（毒素、激素） 果胶酶与纤维素酶 果胶酶是病原菌引起果蔬采后腐烂病斑或软腐过程中起关键作用 的一组胞外酶。 果胶酶依据降解底物不同!a一糖营键的分裂机制以及在果胶上断裂的位置分为两 类: (1)果胶甲基酷酶(peetinmethylesterase),(2)果胶水解酶(peetiehydrolases)和果 胶裂解酶(peetielyases) 果胶甲基酯酶(简称PME)作用是从果胶质中除去甲基基团以产生果

6、胶酸。 果胶水解酶和果胶裂解酶的共同作用特点是使a一1,4糖营键断裂但水解酶作用 部位是a一1,4键。 半乳糖醛酸酶(peetinmethylgalacturonase,简称pMG)和多聚半乳糖醛酸 (polygalaeturonase,简称pG)是两种分别以果胶质和果胶酸为基质的水解酶。 苹果成熟后,组织中果胶甲酷酶活化,使果胶脱去甲基,在病原的多 聚半乳糖醛酸酶作用下,组织崩溃加速“成熟的苹果容易受到病原 菌侵染,原因就在于此。 纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和-葡萄糖苷酶三 种主要组分。 胞壁降解酶作用机制 降解酶侵入植物组织浸离和 细胞死亡的作用 (l)对侵入的作用：产生角

7、质酶, 形成侵入孔 (2)对组织浸离的作用：果胶降 解酶能使组织中细胞分离,导 致组织浸离 (3) 对细胞死亡的作用： 直接作用：细胞壁降解后,丧 失对原生质体的支持力，膨 压增加引起膜伸展和破裂 间接作用是：胞壁降解酶作用 于植物组织后释放有毒物质 造成细胞死亡 胞壁降解酶的合成受底物或 底物降解产物的诱导和抑制 (1)诱导作用：有些降解酶,病原 物产生的基础水平很低但当 有底物存在时,基础水平酶作 用后的产物对该病原物的产 酶活性有明显增强作用。 (2)抑制作用：病原物降解酶受 底物或底物降解产物诱导,但 当该底物降解产物浓度很高 时,又会抑制这些酶的活性,这 种现象称为代谢物抑制。 植物

8、抗病机制 植物抗病性按作用机制不同可分为被动抗性和主动抗性两类。 被动抗性：指植物被病原物侵染前即已具备的抗病性。抗病组分：角质层、蜡质、木栓质、 木质素、酚类化合物、生物碱和水解酶。 主动抗性：病原物侵染所诱导的抗病性。 真菌细胞壁降解酶在植物防御反应中,几丁质酶(Chitinase)和一l,3一葡聚糖酶(B一l,3一 glueanase)能降解病原真菌细胞壁。 寄主主要防御酶 苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia一lyase,PAL) 是连接初级代谢和苯丙烷类代谢!催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶,是苯丙烷类代谢的关键 酶和限速酶,参与植保素和木质素的合成 多酚氧化酶(p

9、olyPhenoloxidase,PPO) 氧化寄主或寄生物的重要代谢产物,如酚类物质!酶及毒素!IAA等的能力POD能催化木质素 前体如松柏醇脱氢氧化(Whitemore,1978),木质素能提高细胞壁的机械强度和钝化病菌产生 的细胞壁降解酶,阻止病原菌的侵入扩展“ 过氧化物酶(Peroxidase,POD PPO和POD两种酶参与了植物一病原菌互作的寄主植物生理过程这些生理过程包括酚类化 合物的氧化!木质化!细胞壁组分的交联!伤口的愈合!生长素的氧化和系统抗性的诱导. 与抗性相关的生化物质 糖是植物光合作用的产物，苹果采后,随着淀粉转化成糖, 果肉组织可溶性糖含量提高,果实组织衰老和物质泄

10、漏增加,导 致炭疽菌可利用的营养物质增多。 酸性物质有利于细胞的木质化,主要抑制病菌在果实内的扩 展。 木质素木质化作用的病理功能: 一、木质素使细胞壁增强了抗真菌机械侵入的能力, 二、可抵抗真菌酶的降解,另外,木质素沉积所形成外壳,减少了 细胞壁降解酶与多糖接触的机会; 三、限制真菌酶和真菌毒素向寄主的扩散 四、可以钝化真菌的生长点,限制真菌的生长。 酚类物质小分子量的酚类化合物可破坏病原菌的细胞膜,使 其菌丝体在胞壁内聚合,降低病原菌生长所需的粘度。某些酚类 物质还可使病原菌体内的一些酶失活,从而抑制其活动,防止毒 素的产生 实验操作材料 采后苹果果实采后苹果果实,五个品种五个品种: 红富

11、士、黄金帅、乔纳红富士、黄金帅、乔纳 金、嘎啦、辽伏金、嘎啦、辽伏 。苹果苹果 炭疽菌。炭疽菌。 供试供试 苹果苹果 与菌与菌 株株 马铃薯葡萄糖琼脂培养马铃薯葡萄糖琼脂培养 基基(PDA)、 查彼查彼 (ezaper)培养基、牛肉培养基、牛肉 膏蛋白陈培养基膏蛋白陈培养基 供试供试 培养培养 基基 o.25moL/LNaCL,0.05moL/LTris一一HCL缓冲液缓冲液(pHS.o),o.osmouL 醋酸一醋酸钠缓冲液醋酸一醋酸钠缓冲液(pHS.0),1%果胶果胶,l%CMC,0.2moL/L醋酸缓冲醋酸缓冲 液液(pH=5.0),0.1%愈创愈创 木酚木酚,0.08%HZO:溶液溶液

12、,0.o5M磷酸缓冲液磷酸缓冲液(pH=6.8),o.oZM邻苯二酚邻苯二酚 溶液溶液,10,0聚乙烯毗咯烷酮聚乙烯毗咯烷酮(pVp),石英砂石英砂,0.IM硼酸缓冲液硼酸缓冲液(pH一一 5.7),o.6xlo一一,mmoL/LL一苯丙氨酸一苯丙氨酸,6moL/LHeL,0.IM柠檬酸一柠檬酸一 o.ZMN处处HpO4(pHS.0),10,0(W丹丹)昆布糖昆布糖,lg/loomL 酶活酶活 性测性测 定主定主 要试要试 剂剂 蕙酮试剂蕙酮试剂,3,5一二硝基水杨酸一二硝基水杨酸(DNS)试剂试剂,0.lmoULNaOH,酚酞指酚酞指 示剂示剂,70%甲醇甲醇,FoLLin试剂试剂,1%醋酸

13、醋酸,丙酮丙酮,72%硫酸硫酸,0.05m0L/L重重 铬酸钾一硫酸铬酸钾一硫酸,淀粉指示剂淀粉指示剂,考马斯亮蓝考马斯亮蓝G一一250试剂试剂 生化生化 物质物质 测定测定 试剂试剂 实验方案设计与分析 主要实验内容： 一、病情指数测定 二、苹果炭疽病致病机理研究 （1）活体外炭疽病细胞壁降解酶培养与提取 （2）罹病组织细胞壁降解酶提取 （3）PMG活性测定 （4）Cx活性测定 （5）还原性糖与蛋白质测定 三、苹果提取液对孢子萌发的影响 四、不同品种苹果对炭疽病抗病机制研究 （1）接种方法 （2）真菌细胞壁降解酶活性测定（1,3葡 聚糖和几丁质酶） （3）寄主主要防御酶测定（PoD、PPO、

14、PAL） （4）与寄主抗性有关生化物质测定（可溶性 糖、有机酸、木质素、绿原酸） 结果与分析： 一、品种抗病性鉴定 二、苹果炭疽病致病机制研究： （1）活体外炭疽菌细胞壁降解酶活性 （2）活体内炭疽菌的细胞壁降解酶活性 三、苹果提取液对孢子萌发的影响 四、不同苹果品种抗性机制研究 （1） 1,3葡聚糖活性测定 （2）感染后POD活性变化 不同品种间的差异性 距离菌斑不同距离的差异 （3）感染后PPO活性变化 不同品种间的差异性 距离菌斑不同距离的差异 （4）感染后PAL活性变化 不同品种间的差异性 距离菌斑不同距离的差异 五、与抗性有关生化物质活性变化 六、总结 病情指数测定方法 成熟期果实,

15、每个品种用菌丝圆片作皮孔刺伤贴菌处理,每个处理 设3个重复,每个重复10个果实,每个果实接种3点。处理后25放 置,保湿48h。刺伤接种第5d时,按下列分级标准调查。计算病情 指数用新复极差法进行显著性方差分析, 对品种抗性分级 0:未发病 1:病斑直径=5mm,且病斑向果心扩展的距离=lmm 2:病斑直径=5一10mm,且病斑向果心扩展的距离=l一5mm 3:病斑直径10mm,或病斑向果心扩展的距离5mm 结果分析病情指数调查 品种抗病 性鉴定 1、(P=0.01） 方差分析达 极著水平。 2、据发病程度可 将其抗性分为 四类: 红富士（感病） 嘎啦（中感） 乔纳(中感) 金次(中感) 辽伏

16、(抗病) 6.2.2.2.1活体外炭疽菌细胞壁降解酶的培养和提取 炭疽菌在25下PDA平板上培养7d,用打孔器在菌落边缘打菌碟, 每个250mL 三角瓶盛100mL改良的查彼培养液(果胶酶以果胶为诱导物,纤维 素酶以CMC为诱导物),接2片菌碟,25下震荡培养(120转/分,每 天早晚各震荡一次,每次两小时)。分别在培养第1一I0d过滤除去 菌丝,410000 rpm下离心25min取上清夜作为活体外待测果胶 酶和纤维素酶液“ 6.2.2.2.2罹病组织中细胞壁降解酶的提取 针刺接种1又105个/mL的苹果炭疽菌抱子悬浮液20uL于健康果实, 未接种的为对照。每处理选取10个苹果,设3次重复。

17、25保湿贮 藏。分别在第1一10d于接种发病组织病健交界处切取约lg组织,加 4mL0.25m0L/LNaCL提取液(用0.05mouLTris一HcLpHS.0缓冲 液配制),加适量石英砂在冰浴中研磨至匀浆“410000rpm离心 25min,取上清夜作为活体内待测酶液。 PMG和Cx活性测定 5.2.2.4.3聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性的测定 反应混合液为:0.5mL酶液、1.0mL醋酸一醋酸钠缓冲液 (0.05moL/L,pH5.0)、0.5mL1%果胶,于50水浴锅中 反应30min,在520nm处测定其活性。PMG酶活单位为 50下催化底物释放1g/min还原糖所需酶量。还原

18、糖测定采用DNS比色法“酶蛋白浓度按考马斯亮兰G一 250法测定。 5.2.2.4.4羧甲基纤维素酶(Cx)活性的测定 反应底物改为0.5mL1%CMC,其余同上“Cx酶活单位为 50下催化底物释放1g/min还原糖所需酶量。 活体外炭疽菌产生的细胞壁降解酶活性 PMG与Cx活性分析 1、随着培养天数的增加炭疽菌分泌的聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)的活性 变化显著,呈上升趋势,分别在第5天和第8天有一个峰值,可能与菌丝干 重的不断增加有关。 2、图2中梭甲基纤维素酶(Cx)活性先升后降,第5天达到峰值后即开始下 降,后期活性低,可能与培养基的酸度降低有关 活体内细胞壁降解酶的变化 实验分析 1、

19、感病和中感品种的 PMG活性显著提高。 可见PMG在侵入过 程中与寄主组织分 解起重要作用。随 后酶活性下降，可 能与可分解组织减 少有关。 2、抗病品种发生过敏性 坏死反应，酶活性 急剧下降，比对照 还要低。可能激活 寄主防御酶，产生 抑菌作用 3、空白对照组存在PMG， 且活性稳定 4、Cx活性也变相类似 苹果果实提取液对炭疽菌抱子萌发的影响 分别取抗、感品种苹果的健果及接种第1、3、5、7、 9d的病果组织1g,加适量无菌水和少量石英砂,研磨匀浆 后,4000rpm离心20min,上清夜即为果实提取液。然后 采用玻片抱子萌发法测定:在凹玻片上滴一滴抱子悬液 (20一25个抱子/10 x1

20、0视野),再加一滴果实提取液(对 照加无菌水),置于25e保湿培养,处理后4.5h镜检和统计 抱子萌发率“芽管长度等于或大于抱子长度一半时,算是 萌发”。 苹果果实提取液对炭疽菌袍子萌发的影响 实验分析 1、萌发率从高到低为： 清水对照感病 中感抗病。 2、提取液中同时存在抑 制萌发的酚类和促进 萌发的糖类。 3、随天数增加，病原菌 侵入寄主改变PH等， 激发抗菌物质使得萌 发率产生波动。以红 富士、乔纳金和辽伏 比较明显 6.2.2.4不同品种苹果对炭疽菌的抗性机制研究 6.2.2.4.2真菌细胞壁降解酶活性的测定 B一1,3一葡聚糖酶(B一1,3一glucanase)活性的测定 不同品种苹

21、果接种炭疽菌后1一8d取样每克鲜组织加入4mL0.1M柠檬 酸0.2MNa2HPO4(pH5.0),4冰浴研磨至匀浆15000rpm离心15min, 取上清液置于冰箱中保存,用于酶活性测定“ 酶活性测定: 参照AbcLes等人(1970)方法酶液1mL,0.1M柠檬酸一0.2M磷 酸氢二钠缓冲液(pH5.0)2.5mL,l%(W/V)昆布糖o.5mL,30保温1h,蕙酮 法 测定糖生成量,以每h形成1mg葡萄糖为1个酶活力单位。 几丁质酶(Chi血ase)活性的测定 提取方法同上 “酶活性测定:50uL酶液,加lmL胶态几丁质(lg/100mL)于40反应1h,再加 入l.5mL DNS,于沸

22、水浴中反应5min,立即用流动水冷却,在520nm紫外光 下比色”根据标准曲线求出还原糖的含量“一个酶活力单位(u)定义为每分 钟水解几丁质产生1umoL还原糖所需的酶量。 活体内真菌细胞壁降解酶的变化 实验分析 1、图6看出，不同品 种苹果1,3葡 聚糖酶和几丁质 酶，较对照组明 显增加。 2、图6中抗病品种黄 金帅第六天下降， 可能与病原物产 生抑制物有关。 3、对照组含量稳定 主要防御酶测定POD和PPO活性 苹果果实感染后过氧化物酶(POD)活性的变化 1、POD活性都有所上升，分别达到峰值后，酶活性迅速下降。 2、无论抗感品种，病斑出的POD活性都是最高的，抗性品种黄金帅病斑处酶活性

23、远高于 非病斑处。 3、病斑处抗病品种POD活性显著高于感病品种。 苹果果实感染后多酚氧化酶(PPO)活性的变化 主要防御酶测定PAL活性 苹果果实感染后PAL活性的变化 可溶性糖和有机酸测定 与抗性有关的生化物质糖 木质素和绿原酸含量测定木质素和绿原酸含量测定 与抗性有关的生化物质木质素 与抗性有关的生化物质绿原酸 绿原酸是重要酚类物质，未成熟果实中含量很高，对抵抗病菌侵入和拓展有 重要作用。 健康果实绿原酸含量与品种病情指数显著负相关,相关系数(R2)为一0.9939,抗 病品种黄金帅健康果实绿原酸含量最高为0.045%接种炭疽菌后,果实绿原酸 含量都略有上升,抗病品种增幅高于感病品种 分析总结 本文通过病情指数分析,对采后五种苹果品种进行了抗性鉴定,结 果表明,品种间抗性差异显著,分别表现出感病(S)、中感(MS)、中 抗(MR)和抗病(R),其中抗病品种甚至发生