抗体纯化大全

1、抗体的纯化 第一节硫酸铵沉淀法 基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。 高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋 白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大， 温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。试剂及仪器-组织培养上清液、血清样品或腹水等-硫酸铵（NH4 SO4-饱和硫酸铵溶液（SAS-蒸馏水-PBS（含L叠氮钠）（见附录一）-透

2、析袋-超速离心机-pH计-磁力搅拌器 实验步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33% 50%、配制饱和硫酸铵溶液（SAS 将767g（ NH4 2SO4边搅拌边慢慢加到 1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到。此即饱和度为 100%的硫酸铵溶液（mol/L, 25 C）;1、二、沉淀样品（如腹水）20 000 g离心30 min，除去细胞碎片;2、保留上清液并测量体积;3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1: 1 （V/V ）;4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6小时或搅拌过夜（4

3、 C）,使蛋白质充分沉淀。三、透析1蛋白质溶液10 000 g离心30 min （4 C）。弃上清保留沉淀;2、将沉淀溶于少量（10-20ml ） L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对L叠氮钠透析24-48小时（4 C）,每隔3-6小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。应用提示一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。1、边搅拌边慢慢加 SAS到样品溶液中，使浓度为:1（V/V）2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时 或过夜（ 4 C）;3、3000 g离心30 min （4 C）,保留上清液;4、上清液再加 SAS到:1 （V/V），再次离心

4、得到沉淀。将沉淀溶于PBS同前透析，除去硫酸氨;5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效 的;二、为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1);三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。参考文献1、 Burd, ., Raymond, ., Ratz, C. A and Dunn, (1993) A rapid procedure for purifyingIgM monoclonal antibodies from murine ascites using a DEAE- disk. Hybridoma 12,135

5、.2、 . 库珀着，徐晓利主译生物化学工具人民卫生出版社出版（ 1980）， 353。夏泉）表1.室温下硫酸氨饱和度由起始浓度（S1）提高到终浓度（S2）时需加硫酸氨的量（g/L ）0%10%20%25%30%33%35%40%45%50%55%60%65%70%75%80%90%57 86 118 137 150 183 216 251 288 326 365 406 449 494 592 64929 59 78 91 123 155 189 225 262 300 340 382 424 520 61930 49 61 93 125 158 193 230 267 307 348 390

6、 485 583 19 30 62 94 127 162 198 235 273 314 356 449 546 12 43 74 107 142 177 214 252 292 333 426 52231 63 94 129 164 200 238 278 319 411 506 31 63 97 132 168 205 245 285 375 46932 65 99 134 171 210 250 339 43133 66 101 137 176 214 302 392 33 67 103 141 179 264 35334 69 105 143 227 314 34 70 107 190

7、 27535 72 153 23736 115 198 77 157 79第二节DEAE离子交换层析法 基本原理离子交换层析是蛋白质纯化的常规方法，与硫酸氨沈淀法联合使用可以非常有效地纯化抗 体。DEAE是 一种阴离子交换剂，当蛋白质溶液通过DEAE柱时，带负电荷的蛋白质可以被DEAE附，带正电荷的蛋白质则不被吸附而随溶液流出。纯化抗体时可选择 等电pH值大于待纯化抗体点的缓冲液，此时抗体带负电荷可以通过电价键吸附于 浓度DEAE离子交换剂上，然后用增加盐的方法将抗体洗脱。可以用连续梯度法洗脱，也可以用不连续梯度（分段洗脱）法洗脱。本 文以腹水中mAb的纯化为例来介绍此方法。试剂及仪器-抗体样

8、品（小鼠腹水或经硫酸氨沉淀的抗体）-DEAE离子交换剂（阴离子交换齐9）-层析柱(? 20 cm )-缓冲液-缓冲液-缓冲液A : 25mmol/L Tris-HCl pHB : 25mmol/L Tris-HCl pHC : 25mmol/L Tris-HCl pH+35 mmol /L NaCl+70mmol /L NaCl+500 mmol /L NaCl-缓冲液D : 25mmol/L Tris-HCI pH-PBS （见附录一）-透析袋(MW CO 10 000)-磁力搅拌器-蠕动泵和部分收集器-紫外检测仪-梯度发生器-电导仪-pH计-离心机实验步骤整个层析过程最好在 4C 进行 ,

9、 可在冷室操作；1 、抗体样品对缓冲液 B 透析过夜（ 4 C）；2、按说明处理 DEAE离子交换剂。然后用缓冲液 A平衡。用20倍体积缓冲液A洗交换剂, 可用过滤或离心法反复洗到流出液的电导率等于缓冲液A；3、将处理好的DEAE离子交换剂悬浮在缓冲液 A中，装入层析柱。4、用等体积的缓冲液 D 稀释透析过的抗体样品，使之与缓冲液 A 的离子强度一致；5、稀释后的样品10 000 g离心10 min （4 C），除去沉淀变性的蛋白质；6、层析柱与蠕动泵、部分收集器及紫外检测仪连接；7、抗体样品以 1ml/min 流速上柱， 然后用缓冲液直到流出液在 280 nm 的吸光度小于；A 洗柱 1ml

10、/min ，将未吸附的蛋白质洗出。8、吸附的蛋白质，用连续增加NaCI的浓度来洗脱。或分段缓冲液（ 35、 70、 140、 280、 500 mmol/L NaCl ）洗脱。流速 1ml/min ，分部收集洗 脱液 2mI / 管 （图 2-4-1 ）；用线性梯度缓冲液 （ 35-500 mmol/L NaCl）9、椐紫外检测结果，将抗体峰部分合并。装入透析袋对（视抗体的稳定性而定）；PBS（含L叠氮钠）4 C透析或冷冻10、DEAE离子交换剂可按照商品说明再生使用。图 2-4-1 DEAE 离子交换柱层析纯化小鼠IgG流速： 1ml/min 样品：腹水检测方法1、大部分小鼠的单克隆抗体 I

11、gG 可在50200mmol/L NaCl 浓度之间洗脱。2、可用SDS-PAGE或定量免疫学方法（RIA、ELISA）检测各部分洗脱液的抗体存在及效价。实验要点及说明1、要得到满意的分离结果， 每ml DEAE离子交换剂所加样品中蛋白质总量最好不超过10mg。2、用经硫酸铵沉淀初步纯化的抗体代替小鼠腹水作为样品，可得到更好的纯化结果。3、如抗体与DEAE离子交换剂不能有效的结合，可将起始缓冲液的pH提高个单位 有效结合为止。, 直到可以4、如果没有合用的蠕动泵和部分收集器，可用手工上样和收集。洗脱液每管收集分光光度计测定各管 280nm波长的吸光度值。, 然后用5、该方法可按比例扩大。用适合

12、于高流速的大柱和相应的交换剂来纯化大量的蛋白质样 品。参考文献1. Corthier, G., Boschetti, E. and Charley-Poulain, J. (1984) Improved method for IgG purification from various animal species by ion exchange chromatography J. Immunol. Meth . 66, 75-79.2、张保真编译西安医科大学出版（1986）免疫组织化学理论与技术69-71 。夏泉）第三节 羟磷灰石层析纯化抗体基本原理羟磷灰石 Ca10（PO4）6（OH）2 吸

13、附蛋白质的机理，通常认为与其晶体表面的 Ca2+ 和 PO43- 两种基团相关。 因为带电基团紧密排列于晶体表面， 可能通过偶极子之间的相互作用来吸附 蛋白质。样品被吸附剂吸附后，用适当的洗脱液（较高浓度的盐溶液）冲洗，可使之解析。 解析下来的物质在流经层析柱的过程中向前移动， 遇到前面新的吸附剂可再被吸附。 在反复 的吸附解析再吸附再解析的过程中，由于待分离物质与吸附剂之间的吸附能力不同， 它们沿洗脱液流动方向移动的速度也不相同， 所以在洗脱过程中各组分便会由于移动速度不 同而被分离。抗体与其它蛋白质一样可以用羟磷灰石吸附柱层析进行纯化。-吸附缓冲液:-洗脱缓冲液:-PBS （见附录1)试剂

14、及仪器-抗体样品（腹水或培养上清液）-羟磷灰石（Hydroxylapatite有售）-层析柱（？ 20 cm ）20mmol/L磷酸钾缓冲液 含30mmol /L NaCI500mmol/L磷酸钾缓冲液 含30mmol /L NaCI-透析袋(MW CO 10 000)-磁力搅拌器-蠕动泵和部分收集器-紫外检测仪-梯度发生器-离心机 实验步骤10柱10倍稀释,1、羟磷灰石柱的准备：将羟磷灰石悬浮于吸附缓冲液中，使之充分水合后装柱。用 体积的吸附缓冲液洗柱；2、样品的预处理：含抗体的样品先在 4C对吸附缓冲液透析过夜或用该缓冲液 再将透析或稀释后的样品4 00 0 g离心15min （4 C）;

15、3、仪器安装：将蠕动泵、紫外检测仪和部分收集器与层析柱连接;4、上样：将样品上清液以1ml/min的流速加到柱上，然后用20柱体积的吸附缓冲液洗柱;5、抗体的洗脱：提高磷酸盐的浓度可以将抗体洗脱。常用的方法有两种：一种是用梯度发 生器进行线性浓度梯度洗脱，浓度为20500 mmol/L的磷酸钾缓冲液；另一种方法是用不连续浓度梯度洗脱，例如可以用35、70、140、280和500 mmol/L的磷酸钾缓冲液依次分段洗脱。收集洗脱液 2ml / 管（图2-4-2 ）;6、合并洗脱液中含抗体的部分（见下面检测）对PBS透析。根据抗体的稳定性 4C或冷冻防腐（ L 叠氮钠）保存；图 2-4-2 羟磷灰

16、石柱层析纯化单克隆抗体 IgG流速： 1ml/min 样品：腹水 1ml检测方法1、 单克隆抗体 IgG 通常在 200 400mmol/L 磷酸钾浓度之间洗脱。2、可用SDS-PAGE或定量免疫学方法（RIA、ELISA），检测各部分洗脱液的抗体。应用提示1、每 100ml 羟磷灰石可吸附大约 500 ml 细胞培养上清液或 3 ml 的腹水或血清中所含的抗 体。2、使用羟磷灰石柱较适合的柱长/直径 可以在5/1 15/1之间（典型尺寸：？ 20 cm柱长）。3、在吸附过程中应避免有对钙的亲和力大于磷酸盐的物质（如 以免减少羟磷灰石的吸附容量。EDTA和柠檬酸等）的存在,4、用过的羟磷灰石柱

17、可以用吸附缓冲液平衡再生后重复使用。或加入甲苯（ 氮钠（L）储存。%，v/v） 或叠5、如果没有合适的蠕动泵和部分收集器，可手工加样和收集洗脱液 度计2ml / 管，并用分光光测定各管在 280nm 波长的吸光度。6、与本方法类似的吸附和洗脱过程也可用来纯化其它蛋白质。参考文献Bukovsky, J. and Kennett, . (1987) Simple and rapid purification of monoclonal antibodies from cell culture supernatant and ascites fluids by hydroxylapatite chr

18、omatography on analytical and preparative scales. Hybridoma 6 ,219-228.夏泉）第四节 抗体的辛酸纯化法基本原理在人、羊或兔血清或 含有IgG的培养上清中及小鼠的腹水中加入辛酸 ，可与其中大部分蛋 白质形成沉淀，而对IgG的性质没有影响，因此是纯化IgG的有效途径。沉淀后经离心即可 获得IgG。辛酸沉淀法与硫酸铵沉淀法比较其主要优点为可减少聚合物的形成，但与其相同,所得的抗体纯度不够，还需用其它方法以进一步提高其纯度。试剂及仪器s腹水或细胞培养上清 s mol/L 醋酸钠缓冲液（）（见附录 1） s 1N HCIs 辛酸（ 正

19、-八碳酸，n-octanoic acid）s 1N NaOH s PBS （见附录）s 透析袋（MWCO 10,000 s电磁搅拌器 s离心机操作步骤1.2.用烧杯加20ml mol/L 醋酸钠缓冲液（）到 10ml腹水或细胞培养上清中;用1N HCI调节pH到，后滴加辛酸同时用力搅拌，具体用量参见表3.在室温下继续搅拌 30分;4.5 , 000 X g室温离心30分，保留上清;5.用1N NaOH调节pH至U;6.含有IgG的上清对PBS透析，然后分装、置-20 C保存。表1沉淀不同来源IgG的辛酸参考用量IgG来源 辛酸用量（每10ml腹水或上清）小鼠400卩1700 1700 1750

20、 1质量检察 上清中IgG的纯度可用SDS-PAGE分析及合适的酶标免疫测试法测定其免疫活性来确定。上清中可能存在少量杂质，可通过DEAE离子交换层析除去。参考文献1. Russo,C., Callegaro,L.,Lanza,E., and Ferrone,S. (1983) Purification of IgG monoclonal antibody by caprylic acid precipitation. J. Immunol. Meth. 65,269-2712. Steianbuch,M. and Audran,R. (1969) The isolation of IgG f

21、rom mammalian sera with the aid of caprylic acid. 134, 279-284朱正美）第五节 Sephadex 凝胶过滤纯化抗体 基本原理凝胶过滤又称分子筛层析。是一种借助分子筛效应将分子大小不同的混合物进行分离的方 法。交联葡聚糖凝胶 Sephadex 是常用的层析介质。它是一种含有许多网眼的球形小颗粒， 网眼大小分布均一。 当分子大小不同的混合物通过凝胶柱时， 其中较大的分子不能进入凝胶 网眼， 将毫无阻力或阻力很小地随洗脱液流出， 而小分子物则能扩散进入网眼， 被阻滞在层 析柱上，分子量越小，扩散出来所耗时间就越长。因此分子大小不同的MoAb

22、可以借助分子筛效应进行分离提纯。本文以IgM的纯化为例介绍此方法。IgM因分子特别大（900 kd）而不能进入凝胶颗粒的网孔，可首先被洗脱达到初步纯化的目的。试剂和器材Sephadex G 100 或 G 200粗制 IgM-MoAb 培养物或抗血清，腹水等洗脱缓冲液： L Tris-HCl 缓冲液 pH 含 0 .5mol /L NaCl-层析柱(cm? 30 cm 或？ 40 cm )透析袋 (MW CO 10 000)磁力搅拌器部分收集器紫外检测仪离心机 步骤1 样品处理：将腹水、抗血清或培养上清液离心4000 g20分钟，以除去细胞碎片。较稠的腹水和血清需适当稀释；2、装柱：根据样品量

23、选择合适的层析柱，将L pH 含0 .5mol /L NaCI 的Tris-HCI缓冲液加到柱长的 1/4 处，然后将漂洗溶涨的 Sephadex G 100 或 G 200 倾入柱中，自然沉降30 分钟， 再用同样的缓冲液平衡柱1小时，流速 min；3、仪器连接：将紫外检测仪和部分收集器与层析柱连接；上样和洗脱：待柱上平衡缓冲溶液接近凝胶上表面时，缓慢加入样品溶液 面接近凝胶上表面时，加少量缓冲液清洗柱壁，然后接上缓冲液洗脱并收集 280nm 检测的第一蛋白峰即为 IgM-MoAb。4、液min。当样品1-2 ml/ 管。5、浓缩与保存：将280nm检测的第一蛋白峰合并，移入透析袋在磁力搅拌

24、器上流动透析过夜。 透析后的溶液可经聚乙二醇或五氧化二磷真空干燥浓缩后， 保存备用。4C 对 PBS分装封管，-20C检测1可用SDS-PAGE或定量免疫学方法（RIA、ELISA）检测各部分洗脱液的抗体。2、 IgM-MoAb 一般在外水体积洗脱。应用提示1、凝胶过滤不变换洗脱液，一次装柱后可反复使用多次。操作简单，快速经济。2、实验可重复性高，样品回收几乎可达100%且方法温和，不易引起 生物样品变性失活,可进行大量样品的分离纯化。3、用于小分子物(如无机盐)从大分子物(MW2(000)分离的层析柱，柱体积应大于样品体积4-10倍，其高与直径的比例应为5:1-15:1 ;用于大分子物之间的

25、分离(如免疫球蛋白之间的分离)，则柱体积应大于样品体积25-100倍，高与直径的比例应为20:1-100:1 。4、Sephadex凝胶装柱时，应灌制均匀无断层和气泡。在整个操作过程中，凝胶应始终保持 在液面以下。5、提取的IgM浓度过低或反复冻融会引起变性，应分装后在-70C或-20C冻存，或者加L叠氮钠在4C可保存数月。6、如无合用的部分收集器，可手工收集1-2ml/管，用分光光度计测定各管吸光度值。参考文献1、周本正编着 层析技术及其应用湖北科学技术出版社(1992)28-30主编郑昌学，吴安然等译 分子免疫学 科学出版2、.阿塔西，.范奥斯，.阿勃索洛姆社(1988) 212-214第

26、六节 免疫球蛋白G的亲和层析纯化法(蛋白 A或蛋白G法)基本原理蛋白A是金黄色葡萄球菌的细胞壁(cell wall)(cell wall)成分。蛋白G是G组链球菌的细胞壁(cell wall)(cell wall)成分。这两种蛋白质分子可通过免疫球蛋白的FC区和大多数哺乳动物(mammal;mammalian)(mammal;mammalian)的IgG 结合(见表1)。利用基因工程 (Genetic Engineering)(Genetic Engineering)技术，将蛋白 A和蛋白 G分子中与 Fc 区结合的结构域部分的基因融合，所产生的融合蛋白，则具有更广泛的IgG结合特异性。蛋白A

27、蛋白G或融合蛋白A/G与免疫球蛋白Fc段的结合性能使它成为可用于IgG分离的、天然的亲和配基。将这些配基蛋白结合到固体支持物上，提供了应用亲和层析纯化抗体的一步法的基础。试剂及仪器l含igG的样品 l PBS(见附录) l装有2ml固相化的蛋白A、蛋白G或蛋白A/G的小型层析柱(有商品供应)l透析袋 (MWCO 10,000)结合缓冲液： L Tris-HCl + L NaCl分步收集器 （ 可按需要选用 ）洗脱缓冲液 :L Gly-HCl +L NaCl中和缓冲液： 1mol/L Tris-HCl pH蠕动泵 （ 可按需要选用 ） l UV 监测器l pH 计 操作步骤）。* 样品 （ 可为

28、血清、腹水、含有 IgG 的单克隆和多克隆抗体的细胞上清液1样品在4C,对结合缓冲液透析过夜，或将其与至少1: 1稀释的结合缓冲液混合;2如果条件充许，将层析柱与蠕动泵、分步收集器和UV监测器相连;3至少用 10ml 结合缓冲液 , 以 1ml/min 速度, 洗涤柱中的 2ml 亲和层析介质;4上样;5一旦样品进入凝胶，用结合缓冲液洗柱（至少 10个柱体积），直至 A280nm 小于;6用洗脱缓冲液洗脱所结合的IgG,分布收集2ml/管;7收集过程中 , 每管立即加入中和缓冲液，以中和洗脱所得的 IgG 液。8 冻保存。含IgG的各管对PBS透析,其后根据抗体的稳定性，加入防腐剂L叠氮钠），

29、置4C或冷实验要点及说明通常可通过SDS-PAGE分析或通过适当的免疫方法（如Western blot, ELISA等），对洗脱组分进行纯度鉴定和免疫活性测定。1. 上样量由层析柱的对特定免疫球蛋白的容量确定， 对于人 IgG 的容量约为 18mg;2ml 柱对于小鼠 IgG 的容量约 10mg，2. 柱上结合的抗体被洗脱的速度很快 ， 通常在第一洗脱流份中;3. 下列缓冲液也可用为结合缓冲液： 含 L NaCl 的 50mmol/L 硼酸钠 ， 或含 L NaCl 的 mol/L 磷 酸盐液。 高盐结合缓冲液( 1 mol/L NaCl )可能增加总的柱结合容量约50%;4. 应用的缓冲液作

30、为结合缓冲液，通常能增加蛋白A 对小鼠 IgG 的结合力；5.对于蛋白G的层析柱，可用低pH的结合缓冲液,如含mol/L NaCl的50mmol/L醋酸缓冲 液;6.或对pH敏感的抗体，需用比较温和的洗脱液，如：含L NaCI的LTris-醋酸或3mol/L KCI L KI 或 L MgCl2 ;7.蛋白G也能与IgG的CH1区结合,所以不能用于F(ab )2与Fc的分离;如果无蠕动泵和部分收集器可用 ， 也可利用重力进行上样及洗脱 ， 手动收集 2ml / 管， 用 分光光度计测定280nm的吸光度。8.参考文献1. Bjorck，L， And Kronvall，G. (1984) Pur

31、ification and some properties of streptococcal protein G， a novel IgG binding reagent. J. Immunol. 133，969-9742. Eliasson，M.，Olsson，A.，Palmcramtz，E.，Wiberg，k.，Inganas，M.，Guss，B.，Lindberg，M.， and Ulldh，M.(1988)Chimeric IgG-binding receptor engineered from staphylococcal protin A and streptococcal pro

32、tein张文利、朱正美)第七节 应用酶解从 IgG 制备 F( ab )2 的方法IgG 制备 F( ab )2 的方法。这两种酶均在免疫球 见图 1 )，裂解产物为三个片段，即两个相同的 Fab 分子量约 50000。基本原理 本文介绍应用胃蛋白酶及菠萝蛋白酶从 蛋白的绞链区双硫键的下方分解 IgG 段和一个Fc段，Fab段即抗原结合片段，含有一条完整的轻链和半条重链， 首选的酶是胃蛋白酶，它在 IgG 的绞链区二硫键的近 C 末端切断重链，生成大、小两个片 段，大片段为 Fab 双体，称为 F( ab ) 2 ，其功能与 Fab 相同。胃蛋白酶可用于大多数的 小鼠的IgG 1及IgG 2

33、a以及大鼠、人和兔的IgG抗体制备F( ab )2，但不能用于小鼠的 IgG 2 b抗体。应用本法，可通过 HPLC测定组分的大小来判定水解的程度。F( ab ) 2组分 在分子量 100000 部分洗脱，而 IgG 则在分子量 150000 的流分中。由于小鼠IgG 1抗体抗胃蛋白酶，或使酶水解为较小的肽段，因此可采用菠萝蛋白酶，或经过预试来选择确定合适的蛋白酶。图 2-7-1 IgG 不同蛋白酶水解部位示意图试剂及仪器l L TE8: L Tris-HCl + 10mmol/L EDTA，按要求稀释到 20mmol/L TE8l 2mol/L 醋酸 , ： 103ml 冰醋酸 + 克醋酸钠

34、用蒸馏水配至1Ll 70mmol/L 醋酸/ NaCl ，：70m mol/L ,50m mol/L , (22ml 用蒸馏水配至 1L冰醋酸 , 克醋酸钠，克 NaCl，l 胃蛋白酶： 10mg/ml 胃蛋白酶溶于 70m mol/L 醋酸 / NaCl液，现用现配l 1 mol/L Tris (121克 Tris 碱溶于 1L 蒸馏水，以 HCl 调至l 50m mol/L TE7 ：50m mol/L Tris-HCl + 2 mol/L EDTAl 2- 巯基乙醇l 碘乙酰胺储存液： 50 mmol / L 碘乙酰胺液l 50m mol/L TE7 碘乙酰胺应用液：（加 1%体积的碘乙

35、酰胺储存液到 50m mol/L TE7 中，现 用现配l 菠萝蛋白酶： 10mg/ml 的 50m mol/L TE7 液，在临水解前配制。加入2- 巯基乙醇至终浓度为卩mol/L，在37 C保温15分钟，以使酶活化l 10 , 000 MWCOg膜的浓缩装置l 分级范围的分子排阻层析 HPLC系统l 可分离 150000 蛋白质的凝胶过滤*，以30ml/小时的流速，来分离（分子排阻）柱。可用两根直径、凝胶床高80cm的柱子10-100mg 的 IgGl 水浴l透析带（10000 MWCO。用前在含L EDTA的蒸馏水中煮沸、清洗操作步骤一） 酶解 IgG 样品的用量通常酶解 50-200m

36、g IgG ，可生成 20- 100mgF(ab)2 。对于新抗体，可先用 以确定所用酶对抗体的水解能力；5-15 mg 试做，二) IgG 的浓度及予处理将IgG浓缩到10-15 mg/ml ，为进行胃蛋白酶水解，IgG要先对mol/L TE8 菠萝蛋白酶水解，IgG要先对50mmol/LTE7透析；透析，为进行胃蛋白酶水解法1.用2 moI/L醋酸(pH )将抗体液的pH调到，将胃蛋白酶终浓度稀释到30g/LW/W);2. 在37C水浴中保温酶解。每次取样10卩I通过HPLC测定水解组分的分子大小。 过程中，HPLC测定的洗脱峰应从IgG的单峰变成两个峰，分子量小的组分是F(ab解通常需要

37、 6-12 小时；在水解) 2。水3. 当水解到IgG浓度100g/L , 或F(ab ) 2 峰的大小不再增加时，加入1 mol/L Tris( pH )，调节反应液到 pH ，以终止反应。四)菠萝蛋白酶水解法对不同抗体，所需的酶浓5-40g/L (W/W) 之间;2 反应过程中，同胃蛋白酶水解法一样，用HPLC来监测水解的程度;3. 当水解到 IgG 浓度 100g/L ，或 mol/L ，终止反应。F(ab) 峰的大小不再增加时，加入碘乙酸至终浓度五)产物 F(ab) 2的分离1 . 用经过 mol/L TE8平衡的凝胶过滤柱，按分子量大小来分离水解组分2 分离后，将分子量100000

38、的 F(ab ) 2 峰合并、浓缩 .图 2-7-2 产物 F(ab ) 2 与 IgG 的分离1. 向抗体溶液中加入已活化的菠萝蛋白酶液，达到需要的浓度。 度要先用预实验来确定，一般的酶浓度在1. 胃蛋白酶的活性对 升，其活性则会明显下降；实验要点及说明pH高度敏感，在最适 pH范围外，pH下降其活性会明显增加，pH上2.大多数的IgGI的水解需6-12小时。也可将水解液置4C水解过夜。小鼠lgG3很难被酶 解消化成 F(a b) 2 ；3.当需要完全不含IgG或Fc段的F(ab ) 2时，水解产物还需通过抗-Fcy免疫吸附柱 纯化(请参阅参考文献 1)，或通过蛋白A-琼脂糖柱纯化；4. 水

39、解的程度也可通过非还原性的7. 5% SDS-PAGEf考马氏蓝染色来测定。参考文献1. Glennie, MJ., Tutt, AL. And Greenman, J. (1993) Preparation of multispecificF(ab )2 and F(ab )3 antibody derivatives. In Tumor Immuology. A Pratical Approch (eds. Gallagher, G., Rees, RC. And Reynolds, CW.). . Oxoford University Press. )2 fragments2. Lamo

40、yi, E. And Nisonoff, A. (1983) Preparation of F(abFrom mouse IgG of various subclasses. J. Immunol. Meth. 56, 235-243.朱正美) 第八节 从 F(ab)2 制备 Fab基本原理在F(ab )2绞链区的双硫键可用巯基乙醇使之还原，得到具有游离SH基的Fab,随后可用碘乙酸使Fab的游离SH基烷基化，从而防止其再氧化生成F(ab )2。试剂与设备l mol/L TE8: mol/L Tris-HCl, pH + 10m mol/L EDTAI 2-ME 还原溶液：220mmol/L

41、2-巯基乙醇+1 mmol/L EDTA (在通风橱中配置此溶液)l 250mmol/L 碘乙酸 : 250mmol/L 碘乙酸储存液l HPLC 系统及凝胶过滤柱(同前)l 透析袋。经过在含 L EDTA 水中煮沸及冲洗 操作步骤1. F(ab )2 的浓缩：将所得的 F(ab)2 液浓缩到 ml 范围；2. 还原：1) 向 F(ab )2 液中加入 1/10 体积的 2-巯基乙醇还原液(终浓度为 20m mol/L 2- 巯基乙醇)；在25C水浴中保温30分钟；加入 1/10 体积的250m mol/L碘乙酸，以封闭游离的SH基;在25C水浴中保温10分钟;（5）Fab6)用HPLC分析法

42、，通过比较 F(ab )2原液与还原生成的 Fab的量，来检测还原度。 在F(ab )2之后被洗脱，使得洗脱的峰形改变(见图 1)。Fab的分子量为 50000；3. Fab产物的分离：如果在制备液中仅存在少量的未还原的F(ab )2，是符合实验需要的，残余的2-巯(1)基乙醇和碘乙酸可通过对缓冲液透析以除去；(2)如果还原不够充分，或需要Fab完全与未还原的F(ab )2分离，则可在mol/L液中通过凝胶过滤法进行分离，合并、浓缩分子量为50000的Fab峰。TE8图2-7-4 Fab 产物与 F(ab )2的分离(图240)实验要点及说明1. 上述操作也会使 的连系，故不影响 可看到完整的

43、 FabIgG 的部分重链双硫键还原，但因非共价相互作用还可维持重链与轻链Fab段与重链的结合性能。然而，在非还原性SDS-PAGE分析图谱中,(分子量大约 50000Da)及轻链(大约 25000Da)两条条带；2. 可用 100g/L 的非还原性 SDS-PAGE 来检测反应液中 F(ab)2 的还原程度。 F(ab 条带约分子量100000Da, Fab在50000 Da，而已还原的重链及轻链分子量为25000 Da ,条带容易分辨。）2参考读物Glennie, MJ., McBride, HW,. Worth, AT. And Stevenson, GT. （1987） Prepara

44、tion andPerformanee of bispecific F（ab丫 ）2 antibody containing thioether- linked Fabfragments. J. Immunol. 139, 2367-2375.第九节免疫球蛋白 A 纯化基本原理免疫球蛋白A (IgA)可由多种组织和器官产生，如粘膜，骨髓，淋巴结等。血中IgA以单体或聚合体形式存在， 含量约为210 80mg骨髓瘤病人血清中IgA水平增加。IgA分IgA1在大多数的情况下，大于 950g/L 的 F(ab)2 被还原为 Fab。和lgA2两种亚型，其中IgAI亚型占总IgA的90%上，并在铰链区

45、结合有特征性的C连接寡糖链。（见第六篇，第二章）。实验中常需对总 IgA 及 IgA1 亚型进行分离、纯化和鉴 定。 IgA 纯品价格昂贵，如能自己制备，则可节省资金。一、 IgA 的抗体亲和层析分离 原理 利用 IgA 抗体对 IgA 抗原的特异结合特性。 溴化氰活化的 Sepharose-4B 凝胶与多克隆抗 IgA 抗体，或抗 IgA1 亚型单抗共价交联制备亲和层析柱。 经亲和柱分离， 即可得到总 IgA 或 IgA1 亚型纯品。试剂和仪器多克隆抗 IgA 抗体，或抗 IgA1 亚型单抗抗体 Sepharose-4B 偶联胶：制备过程参见（第二篇，第一章），或购买成品胶层析柱l L 硼酸钠， pH l L 甘氨酸盐酸缓冲液， pH l Tris-HCl 缓冲液， pH l PBS 缓冲液保存液：含 % NaN3 的 L 硼酸钠， pH试管紫外分光