一种新型沉淀剂去除肝素钠中蛋白质的条件研究

1、一种新型沉淀剂去除肝素钠中蛋白质的条件研究江燕张力跃徐天瑞杨高潮摘 要 目的 :探索 ynb 9921 沉淀剂去除粗品肝素钠中蛋白质的作用条件 。方法 : 通过效价测定 、蛋白质鉴定和吸收度检测 ,考察不同条件下 ynb 9921 沉淀剂的沉淀效果 。结果 :用 0 . 05 %沉淀剂 、5 %肝素钠溶液 、效价 80u sp u/ mg 以上的粗品和 p h3 . 0 的条件 ,可有效地去除蛋白质 ,肝素钠活性损失 2 %左右 。结论 :得出 ynb 9921 沉 淀剂的最适作用条件 ,去除蛋白质效果明显 。关键词 肝素钠 , 沉淀剂 , 吸收度中图分类号 r927 . 12study on

2、 condit ions f or el iminat ing proteins f rom heparin sodium with a ne w prec ipitantj iang yan , zhang liyue , xu tianrui , yang gaochaode p a rt m en t of b iol ogy , y u n n a n u ni ve rsi t y ( ku n m i n g 650091)abstract purpose : to eliminate p roteins f ro m crude heparin , t he reactive c

3、o nditio ns of p recipitantynb 9921 were investigated. methods : the met ho ds of potency analysis ,p roteins p recipitate and t ur2 bidit y identificatio n as well as abso rbance measurement at 260 nm and 280 nm were used. results :u n2 der t he co nditio ns of p h 3 . 0 ,5 % crude heparin so dium

4、and 0 . 05 % ynb 9921 ,t he p roteins co uld be e2 liminated. concl usion :the op timum co nditio ns of ynb 9921 were o btained. it s effect was o bvio us.key words heparin so dium , precipitant , abso rbance我国的肝素钠生产几乎全部采用猪小肠为原料 ,在制取肝素钠无蛋白质产品和精品时 ,通常采用 调低溶液 p h ,沉淀过滤去除酸蛋白的方法1 ,2 。此 工艺虽简单稳定 , 但会损失 5

5、%7 %的肝素钠活 性 。因此 , 寻找较好的方法 , 减少肝素钠活性的损 失 ,具有现实意义 。我们经反复研究 ,选择了一种较 为理想的蛋白质沉淀剂 ,并就其去蛋白的条件进行 了研究 ,解决了以上问题 。家 ;沉淀剂 , ynb 9921 型 ,系带负电荷的硫酯和硅化物的絮状沉淀剂 ,云南生物工程产业公司 ;其它试剂 均为国产分析纯 。1 . 2方法肝素钠效价的测定采用羊血浆法3 ,4 。粗品 、 半成品和成品溶液中蛋白质的定性鉴定参照美国药 典的三氯乙酸法3 , 并按中国药典方法5 , 分别在260 、280 nm 波长处测定吸收度 。2结果1材料与方法2 . 1沉淀剂浓度对去蛋白质和肝素

6、钠活性的影响在肝素钠浓度 4 . 5 % 、p h7 . 0 条件下 ,用不同浓 度的沉淀剂去除蛋白质 ,结果见表 1 。随着沉淀剂 浓度的增加 ,沉淀蛋白质的作用增强 ,但肝素钠活性 损失亦增加 。当沉淀剂增至 0 . 3 %以上时 , 即可较完全地去除酸蛋白 ,但活性收率只剩余 73 . 9 % 。2 . 2肝素钠溶液浓度对沉淀剂去蛋白效果的影响 在 p h7 . 0 时 ,不同浓度的肝素钠溶液对去除蛋白质效果的影响见表 2 。随着肝素钠溶液浓度的增1 . 1材料肝素钠标准品 , 359 u sp u/ ml , u sp inc , 批号30400 ,lot k24 ,配成 8 u ps

7、 u/ ml 溶液备用 ;肝素钠 粗 品 , 来自云南 、四川 、安徽和湖北的个体生产厂作者单位 650091 昆明 ,云南大学生物系( 江燕) ;中国科学院昆明动物研究所( 张力跃、徐天瑞) ; 湖北省医药保健品进出口公司( 杨高潮)收稿日期 1999212213 修回日期 2000204203江 燕 ,等. 一种新型沉淀剂去除肝素钠中蛋白质的条件研究241加 ,虽然活性损失减少 ,但去除蛋白质的效果也随之变差 。在 5 %浓度时 ,吸收度产生一个低谷 ,原因可 能是此浓度有利于沉淀剂作用 。表 1 不同浓度沉淀剂去蛋白质和对肝素钠活性的影响2 . 3粗品肝素钠效价对沉淀剂去蛋白效果的影响在

8、沉淀剂浓度 0 . 05 %及 p h7 . 0 的条件下 ,不同 效价的肝素钠去除蛋白的结果见表 3 。随着效价的 增高 ,沉淀剂的效果增加 , 肝素钠活性损失随之愈 少 。当效价达到 90 u sp u/ mg 以上时 ,活性损失在1 . 1 %以下 ; 达到 120 u sp u/ mg 以上时 ,还可较完 全地去除酸蛋白 。2 . 4p h 对沉淀剂去蛋白质的影响 在肝素钠溶液浓度 5 %和沉淀剂浓度 0 . 05 %的条件下 ,不同 p h 去除蛋白质的结果见表 4 。当 p h降到 3 . 0 以下 , 溶液出现蛋白质白色浑浊或沉淀 。 由表 4 可见 ,未加沉淀剂前 , 随着 p

9、 h 降低 , 蛋白质 去除效果增强 , 但活性损失也增加 。当 p h 为 1 . 5 时 ,可完全去除溶液中的酸蛋白 , 活性也降到 95 % 左右 。加沉淀剂后 , 在 p h3 . 0 时 , 即可较完全地去 除蛋白质 ,活性收率仍可在 98 %左右 。沉淀剂浓度( %)蛋白质鉴定肝素钠活性收率 ( %)a 260 nma 280 nm0 . 030 . 050 . 100 . 150 . 200 . 250 . 300 . 35+ + + + + + +-19 . 0917 . 4613 . 225 . 081 . 560 . 840 . 620 . 619 . 909 . 017

10、. 123 . 251 . 330 . 600 . 520 . 4999 . 898 . 997 . 594 . 390 . 082 . 173 . 965 . 2+ . 浑浊 ; - . 不浑浊 ; . 微有浑浊表 2 不同浓度的肝素钠溶液对沉淀剂去蛋白效果的影响肝素钠浓度 蛋白质 ( %) 鉴定活性收率( %) a 260 nma 280 nm3讨论+ + + + + + + + + + + + + + +0 . 51 . 02 . 03 . 04 . 05 . 06 . 07 . 08 . 014 . 5517 . 5619 . 7820 . 3818 . 5217 . 4918 . 1

11、819 . 4920 . 482 . 078 . 2714 . 3114 . 5214 . 1512 . 9414 . 3014 . 5917 . 0172 . 483 . 091 . 193 . 897 . 298 . 999 . 199 . 599 . 8本研究从沉淀剂用量 、肝素钠浓度 、粗品效价和p h 值四方面综合考察了去蛋白效果和活性收率的 情况 ,认为选用 0 . 05 %沉淀剂浓度 、5 %肝素钠溶 液 、效价 80 u spu/ mg 以上的粗品和 p h3 . 0 的条件 , 可有效地完全去除酸性蛋白质 。与不使用沉淀剂 、 p h 1 . 5 去蛋白的方法相比 ,沉淀剂不

12、但可以大大降 低吸收度 ,而且还可减少活性损失 。沉淀剂浓度为 0 . 05 % ; + . 浑浊 ; - . 不浑浊 ; . 微有浑浊表 3 粗品肝素钠效价对沉淀剂去除蛋白效果的影响效价使用沉淀剂前使用沉淀剂后 ( u sp u/ mg) 蛋白质鉴定a 260 nm a 280 nm 活性收率 ( %) 蛋白质鉴定a 260 nm a 280 nm 活性收率 ( %) 33 . 0+ + + +77 . 0342 . 96100 . 0+ + + +44 . 2825 . 2883 . 050 . 1+ + + +70 . 3838 . 61100 . 0+ + + +32 . 2822 .

13、 1091 . 166 . 0+ + + +52 . 9536 . 33100 . 0+ + + +28 . 3820 . 1593 . 880 . 0+ + +21 . 4517 . 46100 . 0+ +17 . 429 . 0498 . 290 . 8+ +16 . 3810 . 94100 . 0+11 . 466 . 2198 . 9108 . 0+9 . 106 . 61100 . 04 . 813 . 7399 . 1120 . 34 . 982 . 24100 . 0-3 . 701 . 9499 . 5142 . 73 . 071 . 14100 . 0-2 . 160 .

14、 8799 . 8沉淀剂浓度为 0 . 05 % ; + . 浑浊 ; - . 不浑浊 ; . 微有浑浊 1994-2013 china academic journal electronic publishing house. all rights reserved. 242中国生化药物杂志 chinese journal of biochemical pharmaceutics 2000 年第 21 卷第 5 期表 4 不同 p h 下沉淀剂去除蛋白质效果的比较使用沉淀剂前使用沉淀剂后p h 值蛋白质鉴定活性收率 ( %)蛋白质鉴定活性收率 ( %)a 260 nma 280 nma 26

15、0 nma 280 nm1 . 52 . 02 . 53 . 03 . 54 . 05 . 57 . 09 . 011 . 0-+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +9 . 8912 . 8916 . 1719 . 3521 . 0721 . 3621 . 3821 . 4521 . 4621 . 497 . 038 . 7110 . 4011 . 8216 . 1117 . 1517 . 2617 . 6417 . 6917 . 7594 . 896 . 697 . 599 . 3100 . 0100 . 0100 . 0100 . 0100

16、. 0100 . 0-+ + + + + + + + + + + + +3 . 191 . 781 . 161 . 144 . 0314 . 5117 . 4617 . 5217 . 5917 . 662 . 301 . 411 . 061 . 022 . 287 . 929 . 049 . 069 . 139 . 1792 . 693 . 096 . 398 . 198 . 798 . 899 . 199 . 399 . 399 . 4鉴定的样品溶液为过滤至清的溶液3 u sp. x1 . 19957367384 谢金明. 肝素钠生物效价测定中血浆凝固度形态判定方法介绍.中国生化药物杂志 ,

17、1992 , ( 2) 655 中华人民共和国药典委员会. 中华人民共和国药典 ( 二部) . 1995年版. 北京化学工业出版社 ,1995307308参 考 文 献1 张天民 ,吴梧桐 ,王友同 ,等. 动物生化制药学. 北京人民卫生出版社 ,19812232332 孙岩. 肝素钠精制工艺的探讨. 中国生化药物杂志 ,1998 ,19(1) 4142中国药学会生化药物专业委员会会议纪要中国药学会生化药物专业委员会在“2000 中国药学会学术年会”期间 ,于 2000 年 9 月 16 日在宁波召开了委员会议 。出席这次会议的有张天民 、唐永业 、袁勤生 、吴梧桐 、吴文俊 、王凤山 、王福

18、清 、孙欣 、高向东 、于 荣敏 、王、何兆雄 、朱杰荣 、张能荣 、苏普 、缪辉南 ,凌沛学副主任委员和杨光礼委员派代表参加了会议 。会议首先由主任委员张天民教授介绍了生化药物专业委员会作为 6 个专业委员会之一参加“2000 中国 药学会学术年会”的组织情况 。经过努力 ,我专业委员会共收到论文 87 篇 ,报名参加会议的人数近 160 人 ;经年会优秀论文评选委员会评选 ,我专业委员会有两篇论文获二等奖 、4 篇获三等奖 。 这次会议还就生化药物专业委员会下一步的学术活动计划等事宜进行了广泛的讨论 ,并达成了以下共识 :1 . 随着科学技术的发展 ,生化药物的范围已由传统分离提取的生化药物扩展到用生物技术手段生产的 生化药物 ,生化药物与生物技术药物密不可分 。为了更能反映本领域的内容 ,委员会一致同意吴梧桐副主任 委员的提议 ,即将“生化药物专业委员会”改名为“生化与生物技术药物专业委员会”。会后将专门写报告 ,请求批示 。2 . 为了总结过去 、展望未来 ,生化药物专业委员会拟编写一本反映生化药物的过去