天然脑活素促细胞增殖和抗细胞衰老作用的研究(一)

1、天然脑活素促细胞增殖和抗细胞衰老作用的研究 （一）作者：李映红吴正治吴伟康李明张晓丽陈茵杨敏 【摘要】目的：探讨天然脑活素对人胚肺二倍体成纤维细胞（MRC-5）增殖能力和复制性衰老的影响及其机理。方法：光镜下观察MRC-5 细胞衰老表型，常规计数细胞代龄、传代速度， MTT 法检测细胞增殖活 度，X-Gal染色法观察细胞衰老情况，计数衰老细胞百分率。结果：天 然脑活素可维持细胞的非衰老表型，增加MRC-5细胞代龄，天然脑活素孵育MRC-5细胞的细胞增殖能力较空白老龄对照组明显升高（Pv0.05），细胞的增殖速度显著加快。另外，天然脑活素连续培养的细胞 在老龄阶段衰老细胞数显著低于老龄对照细胞（

2、 Pv 0.01）。结论：天然脑活素可升高MRC-5细胞增殖能力，有效延缓细胞的复制性衰老。 【关键词】天然脑活素；人胚肺成纤维细胞； 增殖活度；复制性衰老； 延缓AbstractObjectiveToexploretheeffectsofNaturalCerebrolysinoncellproliferationactiv ityandreplicativesenescenceofhumanembryoniclungdiploidfibroblasts（MR C-5cells）anditsmechanism.MethodsToobservethechangesofsenescentphen

3、otypebylightmicroscope,countthepassageagesandvelocity,detectthepotent ialofcellproliferationbyMTT.ThechangesofcellssenescenceofNaturalCerebro lysin-effectedMRC-5cellswerestudiedbyX-Galstainingmethod,andthepositiv ecellratesofsenescencecellsweredetectedandanalyzed. ResultsNaturalCerebrolysinmaintaine

4、dunalteredcellmorphologyandincreasedlifespanofMRC -5byatleast18-21passages.Comparingwiththecontrolseniumcells,theprolife rationpotentialofMRC-5cellsincubatedwithNaturalCerebrolysinwasincrease dobviously(P0.05),andthepassagevelocitywasenhanceddoubleofthatofthec ontrolseniumcells(P0.01).Inaddition,the

5、positivecellrateofsenescencecellsw assignificantlylowerinlatepassagecellsinsequencedmultigenerationculturei nNaturalCerebrolysinthanthoseofcontrolseniumcells(P0.01),andsimilartoth oseofyoungcells.ConclusionAsaresult,weconcludedthatNaturalCerebrolysin couldnotablypromotetheproliferationactivityofMRC-

6、5cellsanddelaythecells replicativesenescenceefficiently. KeyWords NaturalCerebrolysin;Humanembryoniclungdiploidfibroblasts;Proliferationa ctivity;Delay;Replicativesenescence衰老(senescenee是细胞的重要生命现象之一，绝大多数正常细胞被 认为仅有有限的分裂能力，当其经过一定的倍增之后，将进入终末增 殖状态，称为细胞衰老。一般来讲，人类胚胎的成纤维细胞在达到衰 老时，能够复制50代左右(PopulationDoubli

7、ngs,PdS，由于这种衰老 是由分裂传代而达到的， 故又称之为复制性衰老 ( replicativesenescence) 1。探讨细胞衰老的分子机理是人类认识自我研究的重要组成部分，从分子水平研究衰老过程中基因及调控变化，已成为目前衰老机理研究 的主要方向，同时研究开发延缓衰老的药物将为提高人类生存质量提供重要保证，也为衰老相关疾病的防治提供理论基础和实验依据。 天然脑活素为结合临床经验和现代药效学正交实验优化筛选而成，本 研究在以往基础上以人胚肺二倍体成纤维细胞（MRC-5为研究对象，观察了天然脑活素对 MRC-5细胞表型、细胞代龄、传代速度、细胞生 长增殖能力及衰老相关指标的影响，旨在

8、探讨其延缓MRC-5细胞复制性衰老的作用及其机理。1 材料与方法1.1 材料1.1.1细胞株与动物MRC-5细胞是人胚肺成纤维细胞，由美国 ATCC细 胞库提供（ATCCNo:CCL-171并规定28代及以下为年轻细胞，50代 及以上为老年细胞，采用含10%胎牛血清（FBS的EMEM培养液培养。 新西兰家兔，雄性，体重（1.5 士 0.2 kg,购自广东省医学实验动物中 心，经 1 周的适应性饲养之后进行实验。1.1.2 药品及试剂研究用药天然脑活素由深圳市中西医结合临床研究所 进行生药鉴定并由西安杨森制药厂制备成临床安全级粉剂, 纯度为 98%。 胎牛血清、EMEM培养基购自美国Gibco公

9、司。MTT购自Sigma公司。 怜半乳糖苷酶细胞化学染色试剂盒购自美国KPL公司。其他试剂均为国产分析纯级。1.1.3主要仪器BIO-RAD68C型酶联免疫检测仪（USA, LeicaDM16000B 型图象分析系统（Germany）, SANYOMCO-15AC型二氧化碳培养箱Japan）。1.2 方法1.2.1 实验分组共分 5 组，年轻对照组；空白老龄对照组；天然脑活素 低剂量组；天然脑活素中剂量组；天然脑活素高剂量组，年轻对照组 和空白老龄对照组以含 10%正常空白血清的 EMEM 培养，天然脑活素 低、中、高剂量组分别以含 2.5%、5%、10%天然脑活素含药血清的 EMEM 培养液

10、培养，血清含量不足 10%的用正常空白血清补充。1.2.2 实验含药血清的制备含药血清的制备：将雄性新西兰家兔随机分 为天然脑活素灌胃组、空白对照灌胃组，每组 6 只，根据成人治疗量 换算为家兔用量灌胃。每个家兔每天灌药量相当于上述配成的成药液 23mL。连续灌胃1个月，末次给药后2h内后行颈动脉采血，离心分 离血清，无菌过滤，56 C灭活补体，即为含药血清，10mL分装后-70 C 保存备用。正常对照空白血清的制取是在灌胃相同体积的生理盐水及 相同的时间后，用同样方式提取分离保存。1.2.3细胞培养人胚肺二倍体成纤维细胞 MRC-5采用加入双抗的含10% 胎牛血清（FBS的EMEM培养液培养

11、，在饱和湿度、 37C、5%CO2 常规培养条件下培养，当细胞融合度约 90%时，按照 1:3或1:4传代。1.2.4细胞计数和细胞形态学检查从第 30代起，天然脑活素低、 中、高 剂量组、及空白老龄对照组细胞分别以含 2.5%、 5%、 10%天然脑活素 含药血清及10%正常空白血清EMEM培养液代替含10%FBS的EMEM 培养液继续培养传代。光镜下跟踪观察细胞形态大小、胞浆折光性、 浆内颗粒大小和密度以及细胞排列情况。细胞总传代次数按 刀Iog2（ D/Do/R）计算，D、Do分别为收获和接种时 的细胞密度，R为细胞贴壁率；细胞平均传代速度按公式（传代次数-28） /周数计算，细胞传代后

12、如 3 周内不能融合，定义为细胞复制性衰老终 末。1.2.5细胞增殖活度的检测一一MTT法测定将第52代MRC-5细胞以每 孔1.0 x 104/mL勺密度接种于96孔板，200L/孔，常规培养20h，待细 胞贴壁后，更换不同含药血清培养液 200L/孔，分别于培养48h后，加 入0.5%MTT溶液50L,置37C, 5%CO2条件下4h,出现蓝色结晶后， 弃上清，PBS洗 12次，加入DMSO150L孔,室温轻柔震摇23min以 充分溶解结晶，用酶标仪于 490nm测A （OD）值。1.2.6衰老细胞数的检测将各组 MRC-5细胞接种于盖玻片上，经干预处 理后，PBS洗1次，用40g/L多聚醛固定细胞45min，用X*乳糖苷酶（X-Ga）染液（含 20mmol/LX-gal、40mmol/L 醋酸-磷酸钠（pH6.0）、 5mmol/L铁氰化钾、5mmol/L亚铁氰化钾、150mmol/L氯化钠、2mmol/L 氯化镁），37C保温48h,然后用双蒸水冲洗2次，再固定4min （固 定液：体积分数为 70%乙醇、福尔马林、冰醋酸按 20:2:1 比例