临床生化检验：丙氨酸氨基转移酶测定（速率法 ）

1、丙氨酸氨基转移酶测定丙氨酸氨基转移酶测定 （速率法（速率法 ） 丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶 丙氨酸氨基转移酶（丙氨酸氨基转移酶（ALT）又称为谷丙转氨酶（）又称为谷丙转氨酶（GPT ）。是转移酶类的一种，能催化双底物分子之间基团）。是转移酶类的一种，能催化双底物分子之间基团 的转移，将供体分子基团或辅酶转移给受体分子。的转移，将供体分子基团或辅酶转移给受体分子。 主要存在于各种组织细胞中，以肝细胞中含量最多。主要存在于各种组织细胞中，以肝细胞中含量最多。 正常时只有极少量释放入血液中，故血清正常时只有极少量释放入血液中，故血清ALT活性很活性很 低。各种肝炎的急性期，药物中毒性肝细胞性坏

2、死等低。各种肝炎的急性期，药物中毒性肝细胞性坏死等 疾病时，肝细胞酶大量释放入血中，使血清疾病时，肝细胞酶大量释放入血中，使血清ALT活性活性 显著增高，因此它是显著增高，因此它是诊断病毒性肝炎，中毒性肝炎等诊断病毒性肝炎，中毒性肝炎等 肝病的重要指标。肝病的重要指标。 分析方法分类分析方法分类 终点法终点法 一点终点法一点终点法 二点终点法二点终点法 固定时间法（两点法）固定时间法（两点法） 连续监测法（速率法）连续监测法（速率法） 透射比浊法透射比浊法 连续监测法（速率法）连续监测法（速率法） 是将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下是将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下 孵育，每隔

3、一定时间（孵育，每隔一定时间（260s）连续测定酶促反）连续测定酶促反 应过程中某一底物或产物的特征信号的变化，从而应过程中某一底物或产物的特征信号的变化，从而 计算出每分钟的信号变化速率。计算出每分钟的信号变化速率。 是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续 选取时间选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以 此线性期的单位此线性期的单位吸光度变化值（吸光度变化值（A/min）计算结计算结 果。果。 实验目的实验目的 通过对通过对ALT测定，掌握测定，掌握NADH负向反应法测定的基负向反应法测定的基 本原理，以及

4、该测定法的注意事项；本原理，以及该测定法的注意事项； 掌握单、双试剂测定掌握单、双试剂测定ALT的原理和方法；的原理和方法； 熟悉熟悉ALT连续监测法测定的优缺点和方法学评价；连续监测法测定的优缺点和方法学评价； 了解利用了解利用NADH负向反应法测定其他项目的基本原负向反应法测定其他项目的基本原 理。理。 实验原理实验原理 NADHNADH -L- 乳酸丙酮酸 谷氨酸丙酮酸酮戊二酸丙氨酸 L L LDH ALT 上述偶联反应中，上述偶联反应中， NADH被氧化为被氧化为NAD+ ， NADH 的氧化速率与标本中酶活性呈正比，在的氧化速率与标本中酶活性呈正比，在340nm波长处，波长处， NA

5、DH呈现特征性吸收峰，而呈现特征性吸收峰，而NAD则没有。因此，可在则没有。因此，可在 340nm处连续监测到处连续监测到NADH的消耗量（即吸光度的下降的消耗量（即吸光度的下降 速率速率-A/min ），从而计算出），从而计算出ALT活性浓度。活性浓度。 反应式反应式 试剂与器材试剂与器材 R1试剂：试剂： Tris缓冲液缓冲液 100mmol/L L-丙氨酸丙氨酸 500mmol/L 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LDH) 2000U/L NADH R2试剂：试剂： -酮戊二酸酮戊二酸 15mmol/L 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH) 0.18mmol/L 标准液

6、：标准液：79UL 病人血清病人血清 紫外分光光度计紫外分光光度计 样品要求样品要求 样本为空腹血清、血浆（肝素抗凝、样本为空腹血清、血浆（肝素抗凝、EDTA抗凝）抗凝） 样本应在低温条件下运输保存，样本中样本应在低温条件下运输保存，样本中ALT在在2 8可稳定可稳定3天。天。 红细胞红细胞ALT比血浆高约比血浆高约7倍，溶血时红细胞内倍，溶血时红细胞内ALT 可进入血浆，导致测定结果偏高，故避免溶血。可进入血浆，导致测定结果偏高，故避免溶血。 操作步骤操作步骤 加入物加入物 B SB S U U 蒸馏水蒸馏水 240l - -240l - - 标准液标准液 - - 240l -240l -

7、血清血清 - 240l - 240l 试剂试剂R1 3ml 3ml 3ml R1 3ml 3ml 3ml 混匀，混匀，2525室温放置室温放置5 5分钟分钟 试剂试剂R2 750l 750l 750l R2 750l 750l 750l 混匀，室温混匀，室温25放置放置1分钟后，在波长分钟后，在波长340nm处，以处，以B管调零，管调零， 并计此时为并计此时为0点或起点，测定初始吸光度值，等待，再测定点或起点，测定初始吸光度值，等待，再测定1分钟后、分钟后、 2分钟后、分钟后、3分钟后的吸光度值，然后准确测定平均每分钟吸光度变分钟后的吸光度值，然后准确测定平均每分钟吸光度变 化值化值A/min

8、。 取取3支试管做好标记，按下表操作：支试管做好标记，按下表操作： 数据处理计算数据处理计算 管号管号 测定时间测定时间 平均平均 A/minA/min 第第0 0分钟分钟 第第1 1分钟分钟 第第2 2分钟分钟 第第3 3分钟分钟 S S U U 计算计算 L U 79 As/min Au/min )/( 血清LUALT 参考值参考值 男：（男：（540）U/L 女：（女：（535）U/L 临床意义临床意义 ALT常作为判断常作为判断肝细胞损伤肝细胞损伤的灵敏指标。的灵敏指标。 1、急性病毒性肝炎，可观察病情发展，作预后判断。、急性病毒性肝炎，可观察病情发展，作预后判断。 2、慢性病毒性肝炎

9、或脂肪肝，正常或轻度增高。、慢性病毒性肝炎或脂肪肝，正常或轻度增高。 3、肝硬化、肝癌时，、肝硬化、肝癌时，ALT轻度或中度增高，提示可能轻度或中度增高，提示可能 并发肝细胞坏死。并发肝细胞坏死。 4、其它原因引起的肝脏损害、骨骼肌损伤、多发性肌、其它原因引起的肝脏损害、骨骼肌损伤、多发性肌 炎等亦可引起炎等亦可引起ALT增高。增高。 方法学评价：方法学评价： 血清中也含有酮酸及血清中也含有酮酸及谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶( (GLDH)，可，可 以消耗以消耗NADH而使测定结果偏高，即存在以下两个而使测定结果偏高，即存在以下两个 副反应：副反应： 两个副反应两个副反应 血清中存在的血清中存在的

10、-酮酸（如丙酮酸）能消耗酮酸（如丙酮酸）能消耗NADH： NADHNADH乳酸丙酮酸 LDH 血清中存在谷氨酸脱氢酶（血清中存在谷氨酸脱氢酶（GLDHGLDH）增高时，在有氨存在）增高时，在有氨存在 的条件下，亦能消耗的条件下，亦能消耗NADHNADH： OHNAD-LNHHNADH- 2 GLDH 4 谷氨酸酮戊二酸 实验原理实验原理 对策：对策： 采用过量的采用过量的NADH（终浓度（终浓度0.140.2mmol/L），）， 将血清同不含将血清同不含-酮戊二酸的所有试剂一起预温，使酮戊二酸的所有试剂一起预温，使 其他副反应充分进行，再加入其他副反应充分进行，再加入-酮戊二酸以启动酶酮戊二酸

11、以启动酶 反应，监测光吸收的变化，可完全排除这种干扰。反应，监测光吸收的变化，可完全排除这种干扰。 性能指标性能指标 1、线性范围：、线性范围：0-400U/L范围内，剂量范围内，剂量-反应曲线线反应曲线线 性相关系数应不低于性相关系数应不低于0.9900 2、准确度：误差、准确度：误差10% 3、精密度：批内变异系数、精密度：批内变异系数6%，批间相对极差，批间相对极差 8% 4、空白吸光度：以蒸馏水为空白对照（、空白吸光度：以蒸馏水为空白对照（340nm； 1cm；37）应不小于）应不小于0.9 1操作中必须准确加入标准液及标本量，并严格控制反应操作中必须准确加入标准液及标本量，并严格控制反应 时间，准确读数。时间，准确读数。 2血清不宜反复冰冻保存，以免影响酶活性。血清置血清不宜反复冰冻保存，以免影响酶活性。血清置 4冰箱冰箱1周，酶活性无显著变化，不推荐冰冻保存周，酶活性无显著变化，不推荐冰冻保存ALT测测 定标本，而宜用新鲜血清标本。草酸盐、肝素、枸橼酸盐定标本，而宜用新鲜血清标本。草酸盐、肝素、枸橼酸盐 虽不抑制酶活性，但可引起反应液轻度混浊。血液混浊时虽不抑制酶活性，但可引起反应液轻度混浊。血液混浊时 可影响测定结果或无法测定（如血脂过高、血清蛋白变质可影响测定结果或无法测定（如血脂过高、血清蛋白变质 等）。红细胞内等）