一种适用于脐带干细胞培养的方法及其使用专利申请

1、一种适用于脐带干细胞培养的方法及其使用专利申请专利申请信息确认表人脊髓间充质干细胞（hUMSCs）是一个多能细胞群，可以从一些成人类型的组织轻松分离如骨髓、脂肪组织，也可从医疗废物如脐带和胎盘中分离。这些具有分化成多种细胞的潜能（即成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌腱细胞和肌细胞，具有用于干细胞治疗的前景。近年来,人脐带间充质干细胞治疗是再生医学中再生和机体修复受损组织的的前沿目标。由于脐带间充质干细胞这些优越的性能，它的增殖和分化的技术正在受到密切关注。新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）是一种在短期内出生或出生后缺乏氧气和血液供应引起的脑损伤，其死亡率，致残率高，给.和家庭带来严重负担。目前还未有

2、有效治疗措施。然而使用hMSCs移植技术，可通过干细胞多功能分化的特点来再生以及修复损伤组织，加快脑功能的恢复，提高新生儿脑缺血缺氧的存活率，致残率。说明书一种适用于脐带间充质干细胞的制备方法及其使用技术领域本脐带间充质干细胞的制备及其使用涉及生物技术领域。背景技术人脊髓间充质干细胞（hUMSCs）是一个多能细胞群，可以从一些成人类型的组织轻松分离如骨髓、脂肪组织，也可从医疗废物如脐带和胎盘中分离(Ding D,et al,2021)。有报道从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们

3、的关注。这些具有分化成多种细胞的潜能（即成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌腱细胞和肌细胞(Ding D,et al,2021)，具有用于干细胞治疗的前景。近年来,人脐带间充质干细胞治疗是再生医学中再生和机体修复受损组织的的前沿目标。它是一种很有前途的治疗技术，其中的移植的干细胞产生的组织覆盖受损的组织，以达到修复和再生的原始组织的的能力（Strauer BE，et al,2021）。此外，正在调查他们的潜力来产生完整的器官为器官移植提供可靠路径。这一迅速发展的治疗领域，在治疗无法治愈的疾病，如帕金森氏病(Roybon L,et al,2021)，阿尔茨海默氏病(McGinley LM,et al

4、,2021)，和糖尿病(Chatterjee S,et al,2021)中有很大的前景。由于脐带间充质干细胞这些优越的性能，它的增殖和分化的技术正在受到密切关注。新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）是一种在短期内出生或出生后缺乏氧气和血液供应引起的脑损伤。(W?rle H, et al, 1984)在发达国家，新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）的发病率约为足月新生儿1.5/1000，15% 20%在新生儿期死亡。此外，25% 30%的幸存者有长期的神经发育后遗症，严重威胁新生儿的生命和健康，给家庭和.带来很大的负担。(CAI Qing, et al,2021)因此，深入研究新生儿缺氧缺血性脑病的发病机制

5、和寻找有效的预防和治疗在围产医学领域的一个重要问题。现在，HIE的治疗主要是控制惊厥和脑水肿，支持对症治疗（Guillet R， et al，2021），如供氧、通气支持、纠正酸中毒、低血糖、保持血压稳定，保证足够的脑血流灌注，多巴胺滴注，亚低温治疗降低脑代谢，高压氧治疗（Zhang Zh，et al，2021），自由基清除剂和拮抗剂、钙通道阻滞剂(Meng X, et al,2021)等。然而，目前的措施是对症治疗，所以他们的影响是极其有限的。因此，使用hMSCs移植技术，可通过干细胞多功能分化的特点来再生以及修复损伤组织，加快脑功能的恢复，提高新生儿脑缺血缺氧的存活率，致残率。脐带间充质干

6、细胞制备的具体实施步骤11材料足月剖腹产胎儿的脐带来自本院(遵照医院规定并经家属同意获取)；II型胶原酶(2 000 Urag)、DMEM-LG培养基、HEPES 购于Gibco公司；Percoll细胞分离液购自Pharmacia公司；胎牛血清(FBS)为杭州四季青公司产品；CDl4、CD29、CD34、CD44、CD45单抗为BD公司产品；DMSO为Sigma公司产品，C02 培养箱为美国Heraeus公司产品；倒置相差显微镜为上海海鸥公司产品；96孔培养板为中国毕龙公司产品。1.2 PMSCs的分离与体外培养取足月剖腹产胎儿的脐带，在无菌条件下剪取8-10cm，PBS冲洗，去除血迹，剪成碎

7、片(1 mm3左右)，加入型胶原酶，37消化30 min，取上清液800 rrain离心5 min，收集细胞沉淀，用DMEMLG培养基稀释后移人预先置有Percoll细胞分离液(1073 gmL)的离心管中，900 rmin离心15min，吸取白膜层，洗涤2次，收集离心获得的细胞，以2xl(Pcm2 接种至含15FBS的DMEMLG培养基，在37。C、饱和湿度、5CO2：培养箱中培养，3 d后首次换液，去除未贴壁细胞，以后每3-4 d换液一次，在相差硅微镜下逐日观察细胞形态和生长情况，达到80-90融合时，用25 mgmL胰酶+04 mgmL EDTA消化培养传代。13 PMSCs超微结构的观

8、察消化第4代PMSCs，用3戊二醛于4同定24 h，常规超薄切片，在JEOLJEM一100SX电镜F观察细胞超微形态。14 PMSCs表面标志的检测将接近融合的第4代PMSCs用胰酶消化，离心洗涤，制备成lxl06细胞悬液，用单克降抗体标记细胞，FACScan流式细胞仪检测其表面标志。15 PMSCs细胞周期分析收集第4代PMSCs，用预冷的无水乙醇固定，调整细胞浓度，每份为5x105细胞，加入溴化阿锭，室温避光染色5 min，ELITE ESP流式细胞仪分析。16生长曲线细胞按2x1&mI接种于96孔培养板，用25 mgmL胰酶+ O4 mgml，EDTA消化后，进行台盼旋拒染色法计数活细胞

9、，每天取12复孔，共7 d；根据汁数结果绘制生长曲线。2结果21 PMSCs的生长情况PMSCs接种48 h内即贴壁；72 h更换培养液时，可见少量CD45-FrrC散在分布的贴壁克隆，呈梭形，有胞浆突起，少数呈多角形；2周后均为成纤维细胞样，胞浆丰富，核大，呈平行排列或旋涡状生长，漩涡中心细胞多层分布(图1)。传代后细胞生长迅速，约4 d即可铺满全层，第15代后，形态变平坦，宽大，分裂相减少，细胞质疏松，可见空泡，细胞老化，增殖明显变慢。22 PMSCs的表面标志取第4代PMSCs进行表面标志检测，结果表明，CDl4CD34CD45阴性，CD29CD44阳性，均一性在98左右。CD34 是造

10、皿干细胞的特异性表【Ii标志，CD29是褴合素家族成员。PMSCs不是造血1：细胞，而是区别于造血细胞的一群处于未分化状态的非定向前体细胞。见图3。23细胞周期分析流式细胞仪测定PMSCs内DNA含量，仅少数细胞处于分裂期(S+G2+M=53)，约95的细胞处于GG1期，见图4。24细胞生长曲线通过7 d连续测定，其生长曲线(图5)显示，传代后潜伏期约为24 h，细胞倍增时间为38 h。附图说明1图l PMSCs原代细胞(x100) A：培养3 d；B：堵养14 d后图3PMSCs表面标志的流式分析PE：藻红蛋白；FITc：异硫氰酸荧光素；PerCP：多甲藻叶绿素蛋白图4细胞周期分析图5细胞生

11、长曲线脐带间充质干细胞的使用近年来,人脐带间充质干细胞治疗是再生医学中再生和机体修复受损组织的的前沿目标。它是一种很有前途的治疗技术，其中的移植的干细胞产生的组织覆盖受损的组织，以达到修复和再生的原始组织的的能力（Strauer BE，et al,2021）。下面是关于脑缺血缺氧后，给予人脐带干细胞移植过后，所看到的结果。1. 静脉注射人脐带间充质干细胞提高脑I/R损伤后的功能恢复在术后24小时和14天，使用Rogers评分对动物进行临床评估。假手术组大鼠术后24小时或14天没有功能缺陷。术后24h，在脑I/R 损伤模型大鼠组给予和不给予HUMSCs后，罗杰斯评分没有差异（P = 0.307；

12、图3A），但术后14 d，脑缺血再灌注损伤大鼠经HUMSCs 治疗有较好的功能恢复比没有给予HUMSC的（P = 0.016）。2.脑I/R损伤静脉给HUMSCs后没有改变细胞梗死面积TTC染色用来评估术后24 h和14 d的梗塞灶。通过染色显示，假手术组大鼠的大脑没有病变。人脐带间充质干细胞治疗与不治疗的两组脑I/R损伤大鼠14 d后的病变比24小时之后的少。在其他时间段，两组之间没有差异（P = 0.801，P = 0.626，分别如图3B）。3.3. 静脉注射人脐带间充质干细胞并不会导致其迁移或植入免疫组织化学与抗人核抗原（HuN）抗体发现，假手术组大鼠和未经治疗的脑缺血再灌注损伤大鼠的

13、脑切片染色不明显。然而，在治疗大鼠脑切片显示既不迁移也不植入在14 d术后（数据未显示）。3.4. 静脉注射HUMSC增加脑I/R损伤后的细胞增殖BrdU免疫组化大鼠脑切片染色检测细胞增殖。假手术组大鼠脑切片只有少量BrdU阳性细胞（图3C）。在大鼠脑缺血再灌注损伤14 d 后，与未经处理的脑缺血再灌注损伤大鼠相比，人脐带间充质干细胞治疗大鼠脑切片中有更大的BrdU阳性细胞存在于脑室下区（SVZ细胞数；P0.001）和纹状体（P = 0.001）。3.5. 静脉注射HUMSCs 使脑I/R损伤后内源性神经再生增加由于在治疗组大鼠间充质干细胞没有迁移和移植，所以在14 d后采用免疫荧光双标记染色

14、神经丝蛋白200（NF200）和BrdU对脑切片中内源性神经再生进行了研究（图4）。在假手术组大鼠脑切片中，细胞双染NF200和BrdU并不明显。在未用HUMSCs治疗组，脑I/R 损伤细胞双染NF200和BrdU在SVZ明显，但在脑切片纹状体不明显。正如预期的那样，当给予HUMSCs后脑损伤细胞双染NF200和BrdU在SVZ和纹状体明显。3.6. 人脐带间充质干细胞静脉注射减弱脑I/R损伤后星形胶质细胞活化GFAP作为大鼠纹状体星形胶质细胞活化的免疫荧光标记（图4）。与假手术组大鼠相比，脑I/R损伤大鼠有更大数量的GFAP阳性细胞；与经HUMSCs 处理的脑损伤大鼠相比，未经处理的脑I/R

15、损伤大鼠GFAP阳性细胞较多。附图说明2图1A静脉注射人脐带间充质干细胞提高脑I/R损伤后的功能恢复图1B脑I/R损伤静脉给HUMSCs后没有改变细胞梗死面积图1C静脉注射HUMSC增加脑I/R损伤后的细胞增殖图2静脉注射HUMSCs 使脑I/R损伤后内源性神经再生增加,并且减弱脑I/R损伤后星形胶质细胞活化说明书附图附图说明1附图说明2ReferenceDing D, Shyu W, Lin S. Mesenchymal stem cells. Cell Transplant.2021;20:514. (Ding D,et al,2021)Strauer BE, Kornowski R. S

16、tem cell therapy in perspective. Circulation. 2021; 107:92934.Roybon L, Christophersen NS, Brundin P, Li JY. Stem cell therapy for Parkinsons disease: where do we stand? Cell Tissue Res. 2021;318(1):26173.McGinley LM, Sims E, Lunn JS, Kashlan ON, Chen KS, Bruno ES, et al. Human cortical neural stem

17、cells expressing insulin-like growth factor-I: a novelcellular therapy for Alzheimers disease. Stem Cells Transl Med. 2021;5(3): 379-91.(McGinley LM,et al,2021)Chatterjee S, Davies MJ. Current management of diabetes mellitus and future directions in care. Postgrad Med J. 2021;91(1081):61221.W?rle H,

18、 Versmold H.Hypoxic-ischemic encephalopathy. Clinical considerations.Padiatr Padol. 1984;19(4):355-64.CAI Qing, XUE xing-dong, FU Jian-hua.The Research Contitios and Progress of Neonatal hypoxic-ischemic Encephalopathy. Chinese Journal of Practical Pediatrics. Dec.2021.(Guillet R,Edwards AD, Thoresen M,et al. Seven-to eight -vear follow-up of the coolcap trial of head cooling forneonatal encephalopathyJ.Pediatric Re.search,2021;71( 2)：205 -209)Zhang ZhThe clinical curative effect and nursin