实验二果蝇唾腺染色体标本的制备与观察

1、目 录前 言1实验一 果蝇的性状观察和性别鉴定2实验二 果蝇唾腺染色体标本的制备与观察3实验三 果蝇的单因子实验5实验四 果蝇的伴性遗传7实验五 果蝇的三点测交实验9实验六 减数分裂的制片与观察11实验七 去壁低渗法制备植物染色体标本15实验八 染色体核型分析18实验九 植物多倍体的人工诱导和鉴定20实验十 小鼠骨髓细胞染色体标本制作与观察22实验十一 染色体的分带实验24实验十二 诱变物质的微核检测试验26实验十三 粗糙链孢霉的杂交27实验十四 太原市污水对大麦根尖遗传损伤的研究30前 言遗传学实验是生物科学专业的一门专业基础课程，是一门独立的实验课程，同时也是为了配合遗传学的教学而开设的一

2、门实验课程,本课程由验证性、综合性、设计性等多层次实验内容构成，目的在于巩固和加深学生对遗传学知识的理解、验证遗传学理论、并初步掌握遗传学研究所必需的基本实验技术。在此基础上，进行一定比例的综合性、设计性实验，将实验理论和实验技能融为一体，从而培养学生的基本实验思想、实验方法、实验技能和综合应用能力。本课程的任务是从个体、细胞、分子三个水平揭示遗传学的基本现象与规律，培养学生牢固掌握经典遗传学研究方法与技术，并初步掌握现代遗传学实验操作技能，熟悉遗传学分析方法，同时要求学生初步具备进行遗传学创新性研究的基本能力与素质。实验一 果蝇的性状观察和性别鉴定一、实验目的了解果蝇的生活史，识别雌雄果蝇，

3、观察常见的几种突变型。二、实验原理 果蝇为完全变态发育的双翅目昆虫，具有生活史短、突变型多、染色体数目少（2n=8）、繁殖率高、饲养简便等特点，是遗传学研究的好材料。果蝇的性染色体属于xy型（雌蝇为xx，雄蝇为xy）。雌雄果蝇的主要形态特征性状雌蝇雄蝇体型较大较小腹部末端宽厚，成卵圆形，末端稍尖窄小，呈柱状，末端钝圆腹背黑色环纹5条宽窄相近3条，上部两条窄，最后一条宽，呈一明显黑斑腹片数64性梳无有（位于前足附节上）形似小梳外生殖器阴道板、肛上板，色浅生殖弧、肛上板及阳具等，色深野生型和几种突变型的鉴别性状野生型白眼残翅三隐眼色红白红白翅型长长残小刚毛直直直焦三、实验用品1、材料：果蝇（野生型

4、 白眼 残翅 三隐）。2、用具：毛笔、麻醉瓶、白纸、乙醚。四、实验步骤1、将果蝇培养瓶与麻醉瓶瓶口对接，培养瓶在下，麻醉瓶在上，双手遮住培养瓶，利用果蝇的趋光性将果蝇引入麻醉瓶；或培养瓶在上，轻拍瓶壁将果蝇震入麻醉瓶。然后在麻醉瓶的小口棉塞滴加12滴乙醚，待麻醉后倒在白纸上观察。如乙醚滴加过量，果蝇翅膀外展死亡。2、观察：将果蝇置于解剖镜下观察，观察过程中若果蝇醒来，用麻醉瓶或培养皿扣住果蝇，塞入滴有乙醚的棉花使其麻醉。五、作业1、简述果蝇的生活史和饲养方法。2、果蝇作为一种遗传学模式动物具有哪些优点。实验二 果蝇唾腺染色体标本的制备与观察一、实验目的1、练习分离果蝇幼虫唾腺的技术，学习唾腺染

5、色体的制片方法。2、观察果蝇唾腺巨大染色体的结构特点。3、了解果蝇唾腺染色体在遗传学研究中的意义。二、实验原理 本世纪初，d. kostoff用压片法首先在d. melanogaster 果蝇幼虫的唾液腺细胞核中发现了特别巨大的染色体唾液腺染色体（salivary gland chromosome）。事实上，双翅目昆虫（如摇蚊、果蝇等）的幼虫期都具有很大的唾腺细胞，其中的染色体就是巨大的唾液腺染色体。这些巨大的唾液腺染色体具有许多重要特征，为遗传学研究的许多方面，如染色体结构、化学组成、基因差别表达等提供了独特的研究材料。 双翅目昆虫的整个消化道细胞发育到一定阶段之后就不再进行有丝分裂，而停止

6、在分裂间期。但随着幼虫整体器官以及这些细胞本身体积的增大，细胞核中的染色体，尤其是唾液腺染色体仍不断地进行自我复制而不分开，经过许多次的复制形成约10004000拷贝的染色体丝，合起来达5mm宽，400mm长，比普通中期相染色体大得多（约100150倍），所以又称为多线染色体（polytene chromosome）和巨大染色体（giant chromosome）。 唾液腺染色体形成的最初，其同源染色体即处于紧密配对状态，这种状态称为“体细胞联会”。在以后不断的复制中仍不分开，由此成千上万条核蛋白纤维丝合在一起，紧密盘绕。所以配对的染色体只呈现单倍数。黑腹果蝇的染色体数为2n=24，其中第ii

7、、第iii染色体为中部着丝粒染色体，第iv和第i（x染色体）染色体为端着丝粒染色体（图1）。而唾液腺染色体形成时，染色体着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚于一起形成一染色中心（chromocenter），所以在光学显微镜下可见从染色体中心处伸出6条配对的染色体臂，其5条为长臂，1条为紧靠染色中心的很短的臂（图2, 图3）。 由于唾腺细胞在果蝇幼虫时期一直处于细胞分裂的间期状态，所以每条核蛋白纤维丝都处于伸展状态，因而不同于一般有丝分裂中期高度螺旋化的染色体。唾腺染色体经染色后，呈现深浅不同，疏密各异的横纹（band）。这些横纹的数目、位置、宽窄及排列顺序都具有种的特异性。研究认为这些横纹与染色体的

8、基因是有一定关系，而一旦染色体上发生了缺失，重复，倒位，易位等，也可较容易地在唾腺染色体上观察识别出来。可见唾腺染色体技术是遗传学研究中一项基本的技术。三、实验用品1、材料：野生型或任何突变性果蝇的三龄幼虫。 2、药品：0.7%生理盐水 1mol/l hcl 改良石炭酸品红染液。 3、用具：显微镜 解剖针 吸水纸 载玻片 盖玻片。 四、实验步骤1、选材：取培养好的充分发育的幼虫，通常取爬到瓶壁上即将化蛹的大幼虫即是三龄幼虫。 2、唾腺剖取：在载玻片上滴一滴 0.7 nacl溶液幼虫放在其中。两手各持一解剖针，左手针压在虫体后段1/3处，不使移动，右手针压住虫体的头部（有一黑色口器），用力右拉，

9、头部扯离，唾腺随之拉出，（可见一对微白，半透明的长形小囊，即为唾腺），其侧面常带有少量泡沫状、颜色稍深的脂肪体，注意区别，并用解剖针将其拨离。如唾腺未被拉出，可用针自虫体前 1/3处轻轻向前挤压，可将其挤出。（图4）3. 解离：用滤纸吸取多余盐水，再唾腺上 滴一滴 1nhcl ，解离2-3分钟，用蒸馏水洗净，然后让唾腺在蒸馏水中吸涨10-15分钟。4、染色：将水吸干后滴上几滴改良苯酚品红于唾腺上，染色10分钟（及时补充液）。5、压片：盖上盖玻片, 左手指按压住, 同时用右手大拇指指肚稍用力摁压盖玻片,然后用铅笔头轻敲盖片，最后用吸水纸吸尽多余染液，使唾腺细胞核破裂,核中的染色体舒展开来。 6、

10、观察：将压好的玻片标本放在低倍镜下观察,找到清楚的染色体物像后,将观察目标移到视野中心,再用高倍镜观察。 五、绘图绘制所观察的分散较好的果蝇唾腺染色体图像。六、思考题1、果蝇唾腺巨大染色体有哪些形态特点？图1 果蝇唾腺染色体核型图 图2 果蝇唾腺染色体模式图图3 果蝇唾腺染色体图图4 果蝇唾腺的分离操作示意图2、果蝇唾腺染色体在遗传学上有哪些应用?实验三 果蝇的单因子实验一、实验目的 理解分离定律的原理，掌握果蝇的杂交技术和记录交配结果和掌握统计处理方法。二、实验原理一对基因在杂合状态中保持相对的独立性，而在配子形成时，又按原样分离到不同的配子中去。理论上配子分离比是1:1，子二代基因型分离比

11、是1:2:1，若显性完全，子二代表型分离比是3:1。这就是分离定律。性状特征：野生型果蝇的双翅是长翅，（+/+）翅长过尾部。残翅果蝇（vg/vg）的双翅几乎没有，只有少量残痕，无飞翔能力。vg的座位是第二染色体67.0。长翅对残翅显性完全。交配方式：用长翅果蝇与残翅果蝇交配，得到子一代都是长翅，子一代雌雄个体间相互交配，子二代产生性状分离，出现两种表型，呈3:1之比。现以长翅雌蝇与残翅雄蝇交配为例。p 长翅 + + 残翅 vg vg f1 长翅 + vg f2 1 + + : 2 + vg : 1 vg vg(长:残=3:1)在这个实验中，子一代基因型为+/vg，可以产生两种配子，+和vg，各

12、占1/2。雌雄都是这样。用棋盘法表示这个杂交实验。因为长翅对残翅显性，+/+、+/vg基因型都表现出长翅性状。只有vg/vg才呈残翅。所以f2代群体中，长翅与残翅比为3:1。其中长翅中有2/3是杂合体+/vg，1/3是纯合体+/+，但在表型上无差别。f2代群体越大，越接近理论比。实得比数符合理论比数的程度如何，需要进行x2测验。三、实验用品 1、材料：黑腹果蝇（drosophilame l anogaster）品系、长翅果蝇（+）、残翅果蝇（vgvg）。2、用具：麻醉瓶，白纸，棉花，毛笔，镊子，培养瓶。四、实验步骤1、收集处女蝇 由于雌蝇生殖器官中有贮精囊，一次交配可保留大量精子，供多次排卵受

13、精用，因此做杂交实验前必须收集未交配过的处女蝇。在杂交前2周将杂交亲本品系在2025恒温条件下分别饲养繁殖，待幼虫化蛹后，将饲养瓶中的全部成虫除去以便选择杂交亲本处女蝇。由于孵化出的幼蝇在12小时内（更可靠是8小时）不交尾，因此必须在这段时间内把 、 蝇分开培养，所得的蝇即为处女蝇。2、麻醉接种 正常羽残翅：把长翅处女蝇麻醉倒出，挑出56只移到杂交瓶中，其次把残翅麻醉倒出，在放大镜下，白瓷板上仔细挑出56只雄蝇，移到上述杂交瓶中。同样方法进行残翅正常羽。贴好标签，标签上注明日期、杂交组合和实验者姓名。3、培养和去亲本 杂交瓶放到25温箱中培养。反交与正交方法一样。78天后，倒去亲本果蝇。4、观

14、察f1代 再过45天，f1成蝇出现，观察f1翅膀，连续检查23天。5、培养f2代 麻醉f1成蝇，移出56对果蝇，放到另一培养瓶内。这里雌蝇无须处女蝇，在25温箱中培养（反交同样做一瓶）。78天后，移去f1亲本。再过45天，f2成蝇出现，开始观察。连续统计78天。被统计过的果蝇放到死蝇盛留器中。6、统计检验：用2检验法对试验结果进行统计检验，验证分离定律。五、作业与思考1、填写下列表格世 代果蝇数比 例2值正常羽残翅总数12实测数理论数2、在哪些情况下，雌性亲本必须为处女蝇，在什么杂交组合中，雌性亲本可以不是处女蝇？实验四 果蝇的伴性遗传一、实验目的了解伴性遗传和常染色体遗传的区别；进一步理解和

15、验证伴性遗传和分离、连锁交换定律。二、实验原理生物某些性状的遗传常与性别联系在一起，这种现象称为伴性遗传（sex-linked inheritance），这是由于支配某些性状的基因位于性染色体上。性染色体是指直接与性别有关的一对或一个染色体。果蝇属xy型生物，共有四对染色体，雌果蝇的性性染色体构型为xx，、雄果蝇为xy。遗传上支配性状的基因位于x染色体上称作x连锁，支配性状的基因位于y染色体上称作y连锁，但y染色体上基因极少，故一般为x连锁。控制果蝇眼色的基因位于x染色体上，在y染色体则没有与之相应的等位基因。将红眼（+）果蝇和白眼（w）果蝇杂交，其后代眼色的表现与性别有关。而且，正反交的结果

16、不同。三、实验用品1、材料：野生型果蝇（x+ x+, x+y）、白眼果蝇(xw x w , xwy) 2、用具：显微镜、麻醉瓶、白纸、毛笔3、试剂：乙醚、培养基。四、实验步骤1、收集处女蝇：在杂交前2周将杂交亲本品系在2025恒温条件下分别饲养繁殖，待幼虫化蛹后，将饲养瓶中的全部成虫除去以便选择杂交亲本处女蝇。由于孵化出的幼蝇在12小时内（更可靠是8小时）不交尾，因此必须在这段时间内把 、 蝇分开培养，所得的蝇即为处女蝇。2、杂交接种：准备好培养基，分别将用于杂交的两亲本果蝇麻醉，按正、反交设计，取所需雌、雄果蝇蝇各56只，一起放入杂交瓶中，置25恒温培养箱中培养。3、弃去亲本蝇：25条件下培

17、养 78天后，放去亲本蝇。 4、观察f1代雌、雄蝇的性状表现：再过45d，f1代成蝇出现，观察f1代雌、雄蝇的性状表现。5、观察f1代雌、雄蝇的性状表现：收集56对f1代果蝇（注意：正反交不能混杂）放入一新培养瓶，在25恒温箱内继续培养，用以观察f2代的性状表现。继续培养78d后，移去f1代亲本。再培养45d，f2代成蝇出现，开始观察并统计f2代的性状表现类型及数目，连续统计78d。五、实验结果与思考1、将实验结果填入下表观察结果日期正交反交红眼白眼红眼白眼红眼白眼红眼白眼合计百分比x22、解释性连锁遗传中，正、反交结果（包括f1和f2）不同的原因。实验五 果蝇的三点测交实验一 、实验目的1、

18、掌握三点测交的原理及方法。2、学习三点测交的数据统计处理及分析方法。3、掌握绘制遗传学图的原理和方法。二、实验原理同一条染色体上的基因是连锁的，而同源染色体上的基因之间会发生一定频率的交换，使子代中出现一定数量的重组型。重组型出现的多少反映出基因间发生交换的频率的高低。而根据基因在染色体上直线排列的原理，基因交换频率的高低与基因间的距离有一定的对应关系。基因图距就是通过基因间重组值的测定而得到的。如果基因座位相距很近，重组率与交换率的值相等，直接将重组值作为基因图距；如果基因间相距较远，两个基因间往往发生两次以上的交换，必须进行校正，来求出基因图距。三点测交：用三杂合体和三隐性个体杂交，获得三

19、因子杂种（f1），再使f1与三隐性基因纯合体测交，通过对测交后代表现型及其数目的分析，分别计算三个连锁基因之间的交换值，从而确定这三个基因在同一染色体上的顺序和距离。通过一次三点测验可以同时确定三个连锁基因的位置，即相当于进行三次两点测验，而且能在试验中检测到所发生的双交换。如果两个基因间的单交换并不影响邻近两个基因的单交换，那么预期的双交换频率应当等于两个单交换频率的乘积，但实际上观察到的双交换值往往低于预期值，因为每一次发生单交换，它邻近也发生一次交换的机会就减少一半，这叫干涉。一般用并发率表示干涉的大小。并发率=观察到的双交换频率/两个单交换频率的乘积。本实验所用三隐性个体为白眼（w）、

20、小翅（m）、焦刚毛（sn3）， 这三个基因都位于x染色体上。先用野生型果蝇与三隐性果蝇（白眼、小翅、卷刚毛）杂交，制成三因子杂种，再把雌性杂种与三隐性个体测交，在测交后代中由于基因间的交换可得到种不同的表型，经过数据处理，一次实验便可测出三个连锁基因在染色体上的距离和顺序，绘制出连锁图。p 三隐性 w m sn3 + + + 野生型 w m sn3 f1 w m sn3 w m sn3 + + + 测交后代：w m sn3 + m sn3 w + sn3 w m + + + + w + + + m + + + sn3三 、实验材料1、材料：黑腹果蝇品系：野生型果蝇（+） 红眼、长翅、直刚毛三隐

21、性果蝇（wmsn3） 白眼、小翅、焦刚毛 2、用具：显微镜、麻醉瓶、白纸、毛笔。3、试剂：乙醚、培养基。四、 实验步骤1、选处女蝇：选三隐性雌蝇为母本，野生型为父本，转移到新的杂交瓶中，贴好标签，于25培养。2、7d后，释放杂交亲本（一定要干净）。3、再过4-5天，f1成蝇出现，在处死亲本7天后，集中观察记录f1表型及性别。4、选取5对f1代果蝇，转入一新培养瓶，于25培养，其余f1代果蝇处死。5、7d后，处死f1亲本。6、再过5d，f2成蝇出现，开始观察记录，连续统计7d，观察眼色，翅形及刚毛形态（至少200只以上）。五、实验结果1、将观察到的f2代各表型个体数填入表中，确定基因间重组发生的

22、情况。测交后代表型观察数重组发生在m- sn3m-ww- sn3w m sn3+ + + m sn3w + +w + sn3+ m +w m + + sn3总计重组值2、计算基因间的重组值及双交换值。3、根据计算结果画出遗传学图，注意用双交换值对位于两端的基因间距离进行校正。4、计算并发系数和干涉值。5、如进行常染色体基因三点测交，在实验设计上与本实验有什么差别？实验六 减数分裂的制片与观察一、实验目的了解动物精母细胞减数分裂各时期的主要特点，掌握动物精母细胞减数分裂染色体标本装片的制作技术。了解高等植物小孢子母细胞减数分裂的过程，观察减数分裂中染色体的动态变化；学习并掌握植物细胞减数分裂染色

23、体标本的制作方法。二、实验原理减数分裂是生物在性母细胞成熟时配子形成过程中发生的一种特殊的细胞分裂，它包括连续两次的细胞分裂阶段：第一次分裂为染色体数目的减数分裂，第二次为染色体数目的等数分裂。两次分裂可根据染色体变化特点分为前期、中期、后期和末期，由于第一次分裂前期较长，而且变化复杂，故其前期又分为五个时期。在减数分裂过程中，同源染色体之间发生联会、交换和分离，非同源染色体之间进行自由组合，最终分裂成为染色体数目减半的四个子细胞。精卵细胞经过受精结合成为受精卵发育为新的个体，这样又恢复了原有染色体的数目。在动物的有性生殖过程中，精巢首先分化为精母细胞（2n），经第一和第二次分裂，形成4个精子

24、（n）。在适当的时间给动物注射秋水仙素，并取动物的精巢，经低渗、固定等处理后，可观察到减数分裂不同时期染色体的变化。 在植物的花粉形成过程中，花药内的一些细胞分化为小孢子母细胞（2n），每个小孢子母细胞经减数分裂产生4个小孢子（n）。在适当的时期采集植物的花药，经固定、染色、压片等操作程序后，就可以在显微镜下看到细胞减数分裂过程中染色体的动态变化。三、实验用品1、材料：水稻蝗虫（oxya intricata stal），其染色体数为：雌虫（2n=2x=24,xx）；雄虫（2n=2x=23，xo）。雌虫比雄虫个体长，腹部末端为产卵器，呈分叉状。雄虫腹部末端为交配器，形似船尾。性成熟的雄性小白鼠（

25、mus musculus，2n=2x=40）。黑麦(secale cereale, 2n=2x=14)、大麦(hordeum sativum, 2n=2x=14)、玉米(zea mays, 2n=2x=20)、普通小麦(triticum aestivum, 2n=6x=42)、大葱(allium fistolosum, 2n=2x=16)的幼嫩(雄)花序；蚕豆(vicia faba, 2n=2x=12)、豌豆(pisum sativum, 2n=2x=14)、萝卜（raphanus sativus,2n=2x=18），韭菜（allium tuberosum, 2n=2x=32），柚（citru

26、s grandis,2n=2x=18,36），梨(pyrus communic,2n=2x=34)，苹果（pyrus malus,2n=2x=34），茶（camellia sinensis,2n=2x=30）等的幼嫩花蕾(或其固定材料)等。2、显微镜、离心机、培养皿、小手术剪、解剖针、小弯镊、离心管、吸管、载玻片、镊子、大培养皿、染缸、酒精灯、吸水纸等。3、甲醇、冰乙酸、0.075n氯化钾、0.1%秋水仙素、giemsa染色液、醋酸洋红、改良品红、二甲苯、加拿大树胶、正丁醇等。卡诺氏固定液（甲醇冰乙酸=3:1）、1mol/l hcl、0.5醋酸洋红或醋酸地衣红、改良苯酚品红、醋酸铁矾苏木精、丙

27、酸水合氯醛铁矾苏木精、丙酸水合氯醛铁矾洋红等染液、无水乙醇、石蜡。四、实验步骤1、空气干燥法制备小白鼠减数分裂装片（1）预处理及取材：选取健康、性成熟的雄性小白鼠，按4ug/g6ug/g体重的剂量注射秋水仙素，约6小时后处死动物，剖开腹腔，可在腰部脊椎两侧看见一对黄白色圆状团块，即精巢。（2）低渗：用镊子取出精巢放在2%柠檬酸三钠溶液中，以小剪刀将其剪碎（越碎越好），200rpm离心3分钟，上清液转入另一离心管，1000rpm离心8分钟；去掉上清液，加入0.075n kci，37低渗2030分钟。（3）固定：预固定：取出离心管，沿管壁加入固定液（甲醇:冰醋酸=3:1）1ml，用吸管吹打均匀后，

28、1000rpm离心8分钟。弃上清液，重新加入固定液5ml，室温下固定20分钟，然后1000rpm离心8分钟。弃上清液，重新加入固定液5ml，固定20分钟，弃上清液，再加入约0.5ml固定液吹打均匀，制成细胞悬液。（4）滴片：用吸管吸取细胞悬液，滴12滴于预冷的载玻片上，并立即用嘴吹气，使细胞分散，空气干燥。（5）染色：用10%giemsa染液（ph7.2）染色510分钟，后用自来水冲洗，空气干燥。（6）镜检。2、涂片法制备小白鼠减数分裂装片（1）前处理及取材 同空气干燥法。（2）低渗：在低渗液（0.075n kcl）中将小白鼠的精巢外层的膜剪开，用镊子将曲细精管拉出，并剪成小段，静置低渗152

29、0min。（3）固定：吸去低渗液，卡诺氏固定液固定二次，每次20min。（4）涂片：取一至二段固定好的材料，置于洁净的载玻片上，在其上滴加一滴60%冰乙酸，待材料透明后，用解剖针撕碎，使细胞流出，并用解剖针引导，使细胞悬液分布均匀，空气干燥。（5）染色：用10%giemsa染液（ph7.2）染色510分钟。3、压片法制备蝗虫精巢减数分裂装片（1）取材：剪去翅膀，在翅基部后方的背端，仔细剪开体壁，可见上方两侧（第47背板之间）各有一团黄色团状块（精巢）。（2）固定：卡诺氏固定液固定24小时，经95%酒精洗23次后，转入70%酒精保存。（3）染色：夹取一小枚管状精巢，放置于载玻片上，滴加适量醋酸洋

30、红（或改良品红液）染色1020min。（4）压片：用解剖针挑取少量材料（一条精小管）到一张新载片上，加1滴新鲜染料或45%醋酸，拔碎，加盖玻片，复吸水纸压片。（5）镜检。4、压片法制备植物减数分裂装片（1）取材：获得处于适当减数分裂期的材料是制片成败的关键因素，而最适的时期又因实验主要目的不同而异。田间取材的主要依据是植物外部形态指标，因此必需掌握各种植物减数分裂不同时期对应的外部形态指标。需要注意的是各种植物具体的外部指标，又依当年的温、水、光、肥等条件及植株的生长状况不同而异。取材时间也不是固定不变的，主要看植物生长发育的最适温度而定。气温过低会影响减数分裂的正常进行，这时取材细胞常常处理

31、前期、末期等时期，而终变期、后期、中期图像少；温度过高(30以上)时植株新陈代谢旺盛，减数分裂周期缩短，核质粘连严重，也不易获得理想的制片和观察效果。所以取材时植物的形态指标和时间必须十分恰当，才能获得理想的减数分裂图像。表21为部分植物观察染色体形态与数目的参考取材时间。(2) 固定：最常用的固定液是卡诺氏固定液。将取得幼嫩花序或花蕾立即投入固定液中，处理1224h。对于果树和茶的花蕾，用95乙醇氯仿饱和氢氧化铁丙酸铵=631固定为好，固定时间柑橘类4872h，其它果树24h为宜。倒去固定液，用梯度乙醇(958070)依次浸泡漂洗530min，直至去除乙酸味。固定后可置70乙醇中保存，于4

32、冰箱内可保存数年。幼小花药或临时检样时亦可不经专门固定处理，直接置于醋酸洋红中可同时达到固定和染色目的；但是先经过固定处理的材料更易于染色、分色和保存。(3) 涂抹：用镊子直接从固定液或保存液中取出材料(花蕾、花序、幼穗等)，置吸水纸上除去固定液(保存液)；可用蒸馏水进行冲洗后再吸干，尤其是采用醋酸地衣红染色法一定要将乙醇洗净。用镊子、解剖针等工具取出一枚小孢子囊或花药置洁净载玻片上；用洁净的刀片或镊子压在小孢子囊或花药上向一端轻轻抹去，将花粉母细胞压挤出来，注意勿使花药太过破碎；将挤出花粉母细胞(呈半透明胶状)小范围内涂成薄层。或将小孢子囊或花药置于载玻片，再于其上呈十字交叉方向盖一载玻片，

33、用拇指紧压载玻片将花粉母细胞挤压出，并进行涂布。(4) 染色：在涂好的载玻片上滴加一滴或半滴染液(视滴管大小而定，由于花粉母细胞在压片过程中特别容易随染液溢出，所以滴加染液宜少不宜多。)，稍后用镊子把所有可见花药壁残渣清除干净，如果清除不彻底，压片过程中细胞和染色体不容易分散压平，片面不清洁，影响观察，而且制作永久片时会引起材料的大量脱落。所用染液一般是醋酸洋红，有时为了促进染色可将载片在酒精灯上微烤轻微加热，但不可使染液煮沸。醋酸地衣红、改良苯酚品红也可以达到良好的染色效果。有些植物花粉母细胞不易被醋酸洋红染色，可改用乙酸铁矾苏木精染色程序进行染色，可使各种植物染色体染上较深的颜色，缺点是细

34、胞质也有一定程度着色，不便于分色。丙酸水合氯醛铁矾苏木精、丙酸水合氯醛铁矾洋红也常被采用，并可取得良好效果。(5) 初检与压片：染色后置于低倍显微镜下初步检查，若花粉母细胞正处于分裂期，即可覆盖盖玻片；然后以吸水纸包覆，用拇指垂直紧压，使细胞平整、染色体散开分布于同一平面，便于观察和记数；同时吸水纸可吸去盖玻片周围多余的染液。应注意勿使盖玻片发生搓动，以免破坏细胞与染色体的完整性。(6) 镜检观察：在低倍镜下寻找适当视野，并正确区分处于减数分裂各个时期的花粉母细胞、二分体、四分体以及花粉粒、花药壁残留组织与细胞。一般花粉母细胞大、呈圆形或椭圆形，细胞核大、着色较浅；药壁组织细胞形状较小，比较整

35、齐一致，着色较深；从四分体脱开后的小孢子或幼小花粉粒则大小中等，略呈扇形；成熟花粉粒形状较大，呈半透明状，并具有明显外壳。找到正在分裂的花粉母细胞，转换至高倍镜下仔细观察，鉴别各分裂时期，观察减数分裂各时期细胞特征与染色体的形态结构、数目及行为变化。五、作业与思考1、比较植物材料和动物材料在制备染色体标本过程中的区别。2、绘出你观察到的减数分裂典型时期的分裂图。3、减数分裂制片通常可以采用哪些方法？实验七 去壁低渗法制备植物染色体标本一、实验目的1、掌握植物染色体标本制备的去壁低渗方法。2、了解中期染色体的形态结构。二、实验原理植物细胞有很坚实的细胞壁，染色体很难像动物染色体那样平整地贴在载玻

36、片上，可通过纤维素酶和果胶酶处理去掉细胞壁；用低渗溶液处理可以提高染色体的分散程度。陈瑞阳等（1979，1982）提出了植物染色体标本制备的酶解去壁低渗法，并在多种植物上得到广泛应用，成为当前植物染色体研究中的重要方法。三、实验用品1、材料：大麦或玉米种子。2、用具：显微镜；温箱；冰箱；重蒸水；眼科镊子；刀片；牙签；载玻片；试剂瓶；三角瓶；量筒；酒精灯；青霉素小瓶。3、.药品：0.2%秋水仙素溶液 ；磷酸缓冲液ph7.6 ；3-5%giemsa染色液；0.075mol/l氯化钾；混合酶液：称取纤维素酶，果胶酶各0.5g,加入20ml蒸馏水即为2.5%混合酶液,冰箱内冰冻保存；卡诺固定液。四、实

37、验步骤1、材料培养：将玉米或大麦的种子充分浸种后，摆在铺有滤纸的培养皿内，在25温箱发芽培养。2、预处理：待根长至0.5-1cm时,切取根尖立即放入盛有1ml0.2%秋水仙素的小瓶中预处理2-3小时。3、前低渗：切取分裂旺盛的部分根尖（1mm），放入0.075mol/l氯化钾低渗液中，在25条件下处理30分钟。以下可分两种方法进行处理。4、第一种方法：（1）酶解去壁：吸去氯化钾溶液，加入混合酶液（2ml滴管5滴左右），在25下处理1-2小时。（2）后低渗：吸去酶液，慢慢加入(250.5) 的双蒸水,轻轻洗一次,然后在双蒸水中浸泡10-30分钟。5、第二种方法：（1）吸去前低渗液，立即加入甲醇：

38、冰醋酸（3：1）固定液固定20-30分钟。（2）水洗：将固定好的材料用蒸馏水洗三次，除去材料中的固定液。（3）酶解去壁：在小瓶内加入混合酶液（酶液量以浸过材料为合适），在25下酶解30-60分钟。（4）后低渗：同4、（2），但是，可适当延长时间至1-1.5小时。6、经过上述两种方法处理的材料,可用两种方法制备染色体标本。1）、第一种方法,涂片法:（1）固定：将后低渗好的材料，直接用甲醇：冰醋酸（3：1）固定液固定30分钟以上。（2）涂片：将材料放在预先用蒸馏水浸泡并冷冻的清洁载玻片上，加1滴固定液，然后用镊子迅速将材料夹碎涂布，并去掉大块组织残渣。（3）火焰干燥：立即将载玻片在酒精灯火焰上微微

39、加热烤干（4）染色：经干燥的玻片标本，用giemsa染色液染色30分钟，然后用自来水细流冲洗，甩干水珠空气干燥。2）、第二种方法，悬液法：（1）制备细胞悬液：倒去双蒸水，用镊子立即将材料夹碎形成细胞悬液。（2）固定：向细胞中加入新配制的甲醇：冰醋酸（3：1）固定液1-2ml，使成细胞悬液。（3）去沉淀：静置片刻使大块组织沉淀，然后取上层细胞悬液于另一个小瓶中。（4）去上清夜：将上层细胞悬液静置30分钟左右，即可见细胞沉淀，用吸管轻轻吸去上清夜，留约0.5ml左右细胞悬液置备标本。（5）标本制备:在一张经过充分洗净脱脂,并预先在蒸馏水中冷冻的清洁载玻片上,用吸管滴2-3滴细胞悬液,立即将载玻片一

40、端抬起,并轻轻吹气，使细胞迅速分散，然后在酒精灯火焰上微微加热烤干。（6）染色：同涂片法（4）。7、在显微镜下寻找典型的中期染色体，注意观察中期染色体的长臂、短臂和着丝粒位置，并尽可能找到具随体染色体。实验步骤流程如下：取材预处理前低渗 固定 冲洗 酶解去壁 酶解去壁后低渗涂片法 悬液法制备细胞悬液 固定 固定 去沉淀 涂片 细胞悬液 去上清 火焰干燥 火焰干燥制片 giemsa染色 giemsa染色 冲洗 冲洗 空气干燥 空气干燥 镜检 镜检五、注意事项预处理是很重要的一个步骤，必要时可将预处理药品直接加到培养皿内进行活体处理34小时，以便获得更多的中期分裂相。六、作业1、中期染色体具有哪些

41、形态特征？2、绘制一完整细胞并带有随体的中期染色体图。 实验八 染色体核型分析一、实验目的1、分析细胞有丝分裂中期染色体数目、大小、着丝粒位置和随体等形态特征。2、学习和掌握染色体组型分析的方法。3、了解染色体组型分析意义，为进行细胞遗传学和遗传育种学的研究奠定基础。二、实验原理各种生物染色体的形态，结构和数目都是相对稳定的，具有中的特异性。一个二倍体生物配子所含有的全套染色体，称为一个染色体组。这组染色体的数目、形态特征、染色体的两臂长度、着丝点的位置及次缢痕、随体的有无）就是该物种的染色体组型，也叫核型。染色体组型分析就是通过对染色体标本和其照片进行测量、对比分析、配对、分组、排列对这些特

42、征进行定量和定性的描述。染色体组型是细胞遗传学、现代分类学和进化论的重要研究手段。染色体组型分析染色体水平上的表型，可确定物种的特征，确定种属亲缘关系，分析生物物种的变异和进化过程。在医学上，人类染色体组型分析对遗传病的临床诊断有重大意义。进行染色体组型分析可以利用体细胞有丝分裂中期的染色体，也可用性母细胞减数分裂期的染色体。核型模式图是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。三、实验用品1、材料：野生二棱皮大麦（2n=14）的中期细胞的显微照片。2、器材：尺子、剪刀、胶水。四、实验步骤1、染色体标本制片利用有丝分裂中期的染色体进行染色体组型分析，

43、获得有丝分裂中期染色体标本玻片的制作方法，参照实验七 选择染色体分散良好，形态清晰的有丝分裂中期分裂相，进行拍照，获得照片。2、测量把放大的照片染色体进行随机编号、用直尺测量染色体总长和两臂长度（着丝粒一分为二算入两臂）。并注意各染色体随体的有无，随体和次缢痕长度一般不计算在染色体长度内（如记入，需要标注）。3、计算根据测量结果计算出相对长度、臂比值和着丝粒指数。根据臂比值确定染色体类型.。相对长度=（某染色体绝对长度/染色体组总长度）100%（取小数点后两位数）。臂比=长臂长度/短臂长度（取小数点后两位数）。着丝粒指数=短臂长度/染色体全长。根据臂比数值，确定着丝粒位置，将染色体分类。 臂比

44、1.01.7为中部着丝粒染色体（m）。 臂比1.713.0为近中部着丝粒染色体（sm）。 臂比3.017.0为近端部着丝粒染色体（st）。 臂比7.01以上为端着丝粒染色体（sat）。4、配对：根据测量和计算数据,以及染色体的形态特征对同源染色体进行配对, 并按由长到短的顺序为每对同源染色体编号。 5、排列：a）长度从长到短。b）特殊的染色体最后。6. 剪贴：将染色体按编号仔细剪下，按顺序从长到短排列，短臂在上，长臂向下，如两条染色体长度相等，短臂较长者排前,着丝粒于一条直线上，贴好。7、测量结果填表染色体测量数据表染色体编号长臂短臂相对长度%相对长度%臂比臂指数类型长臂+短臂=全长(一个染色

45、体组的长度)1234.随体染色体（sat）或用*标出五、 作业1、染色体组型剪贴图。2、染色体组型的模式图。3、染色体形态测量数据。4、核型公式。实验九 植物多倍体的人工诱导和鉴定一、实验目的1、了解人工诱导多倍体的原理、方法及其在植物育种上的意义。2、掌握诱发多倍体的一般方法。3、观察植物染色体数目的变化引起植物其它器官的变异。二、实验原理自然界各种生物的染色体数目一般是相当稳定的，这是物种的重要特征。例如大麦体细胞染色体为14条，配成7对。遗传学上把一个配子的染色体数，称为染色体组，用n表示。如大麦染色体组内包含7个染色体，它的基数x=7。由于各种生物的来源不同，细胞核内可能具有一个或一个

46、以上的染色体组，凡是细胞核中含有一套完整染色体组的就叫做单倍体，亦用n表示。具有两套染色体组的生物体称为二倍体，以2n表示。细胞内多于两套染色体组的生物体则称为多倍体。如三倍体（3n）、四倍体（4n）、六倍体（6n）等。在整倍体中，又可按染色体组的来源，区分为同源多倍体和异源多倍体。凡增加的染色体组来自同一物种或者是原来的染色体组加倍的结果，称为同源多倍体。如果增加的染色体组来自不同的物种，则称为异源多倍体。多倍化是植物新物种形成的重要途径，也是进行物种间遗传转移的重要手段和桥梁。植物多倍体广泛存在于自然界，许多栽培作物和森林植物都是多倍体。对于不以收获种子为目的的植物，通过人工创造同源多倍体

47、的途径，可获得较大的营养器官，花或果实，或获得无籽或少籽的果实，同时利用多倍体生理生化变化可能获得某种生化成分含量高的器官产品，增强植物抗逆性，扩大栽植区域。例如：四倍体番茄的维生素c含量比二倍体提高一倍;三倍体西瓜和黄瓜优质无籽，三倍体和四倍体的西瓜对枯萎病菌抵抗力更强；三倍体甜菜耐寒，含糖量和产量都高，成熟也较早，抗病力强，且根部含有害氮素及灰分少，是世界主要甜菜生产国采用的栽培品种类型。三倍体的杜鹃花因为不育所以花期特长，现今菊花，月季，郁金香，百日草，大丽菊等的著名品种也几乎都是多倍体。人工创造多倍体，还可用于克服远缘杂交不孕，远缘杂种不育或创造远缘杂交育种的中间亲本，育成作物新类型。

48、因此，多倍体是生物变异的源泉之一，对物种进化和新品种的选育都具有重要的意义。除了自然界存在的多倍体物种之外，又可采用高温、低温、x射线照射、嫁接和切断等物理方法人工诱发多倍体植物。在诱发多倍体的方法中，以应用化学药剂更为有效。如秋水仙素、萘嵌戊烷、异生长素、富民农等，都可诱发多倍体。用秋水仙素溶液处理植物的种子或幼苗，是常用的人工诱导多倍体的有效方法。秋水仙素是从百合科秋水仙属的一个种，秋水仙(colchicumautumnale)的种子及器官中提取出来的一种生物碱，其分子式为c22h25no6，因有剧毒，故使用时要特别注意，切勿使药液进入眼内或口中。秋水仙素诱导作用在于阻止有丝分裂细胞的纺锤

49、丝的形成。而对染色体的结构和复制无显著影响。若浓度适合，药剂在细胞中扩散后，不致发生严重的毒害，这样纵列为二的染色体不能向两极分开，因而便产生了染色体加倍的重组核。当药剂的作用消除后，由于多倍体细胞继续分裂，便得到多倍体组织，以后则产生新的多倍体植株。 鉴定多倍体可分直接鉴定和间接鉴定。直接鉴定是将经过秋水仙素溶液处理的根尖、茎尖进行染色体计数，多倍体植株的染色体是加倍的。间接鉴定是根据多倍体植株外部形态变化的主要特征是巨大性这一点提出的。花粉粒和气孔的增大常作为染色体数目加倍的辅助性指标。三 、实验用品1、材料：大麦种子。2、药品：0.050.1%秋水仙素、卡诺固定液、1mol/l盐酸、改良

50、石炭酸品红染色液。 3、器材：镊子、刀片、载玻片、盖玻片、青霉素瓶、吸管、吸水纸、显微镜、恒温水浴锅。 四、实验步骤1、种子萌发：先将种子清水洗净，浸种。待露白后置于培养皿中发芽。2、当根长1cm时，取出洗净吸干，用0.050.1%秋水仙素溶液浸根处理2436小时，根尖明显膨大时用固定液固定。3、酸解：将材料放入青霉素瓶中西净， 1mol/lhcl60oc进行酸解，不同的材料的酸解时间不同.(大麦8-10分钟) 。4、染色：酸解后洗净材料，将根尖部分切下（约1mm），加改良石炭酸品红染色.5、压片 染色后盖上盖片，用大拇指按压有材料的部位，粗滤纸吸干多余染液，再用铅笔头轻敲，使重叠细胞分散，得

51、到理想的分裂相。6、观察：低倍镜找到分散良好的分裂相后换高倍镜或油镜。五、作业 1、分别绘制染色体分散良好的加倍细胞核和未加倍细胞图。2、秋水仙素处理后，根尖为什么会发生膨大？实验十 小鼠骨髓细胞染色体标本制作与观察一、实验目的 掌握动物骨髓染色体标本制备基本过程，了解操作步骤的原理。二、实验原理小鼠骨髓细胞中的造血干细胞是生成各种血细胞和原始细胞，具有高度的分裂能力，本实验采用这一材料，通过前处理，低渗，固定，制片，染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。 制备方法包括以下几个要点：1、用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期,使中期染色体停留在赤道面处。2、用低渗法使将细胞膨胀,以至于在滴片时细胞被胀破,使细胞的染色体铺展到载玻片上。3、空气干燥法可使使细胞的染色体在载片上展平,经染色后便可观察到染色体的显微图象。三、实验用品1、材料：小白鼠。 2、器具：注射器（1ml, 5ml）、剪刀、镊子、玻璃吸管、10ml刻度的离心管、离心机、载玻片、盖玻片、显微镜、滤纸、擦镜纸、纱布、恒温水浴锅。 3、药品：0.01%秋水仙素，0.075mkcl，固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），2%柠檬酸钠，改良石炭酸品红或5%giemsa染液。四、实验步骤1、预处理：实验前2.5-3小时，按每克体重注射0.02ml，给小白鼠