牙周病分子生物学

1、牙周病分子生物学牙周病分子生物学 Molecular Biology of Periodontal Diseases 一、概述一、概述 二、牙周病的分子致病二、牙周病的分子致病 1.1.微生物的毒力因子微生物的毒力因子 2.2.宿主因子宿主因子 三、核酸杂交法检测牙周病有关细菌三、核酸杂交法检测牙周病有关细菌 定义（定义（Definition） 分子生物学技术研究与牙周病密切相关分子生物学技术研究与牙周病密切相关 生物大分子（蛋白、核酸）的一门新兴学科生物大分子（蛋白、核酸）的一门新兴学科 前瞻性、交叉性。前瞻性、交叉性。 研究内容研究内容 4宿主基因水平或分子水平阐明牙周病发病机制和流宿主基

2、因水平或分子水平阐明牙周病发病机制和流 行规律行规律 4牙周病原菌的蛋白和核酸牙周病原菌的蛋白和核酸(DNA、RNA)分子结构分子结构 追踪病原菌传播途径、发现病原体变异。追踪病原菌传播途径、发现病原体变异。 4牙周病的发生发展规律与微观的病原菌或宿主基因牙周病的发生发展规律与微观的病原菌或宿主基因 特征联系起来特征联系起来牙周病临床的分子诊断、分子指征、牙周病临床的分子诊断、分子指征、 分子预后乃至基因治疗分子预后乃至基因治疗 牙周病的分子致病牙周病的分子致病 Molecular Pathogenesis of Periodontal Disease 微生物的毒力因子微生物的毒力因子 研究牙

3、周病原菌的蛋白和核酸分子结构，研究牙周病原菌的蛋白和核酸分子结构， 评价毒力因子的作用。评价毒力因子的作用。 宿主因子宿主因子 研究细胞因子和遗传因子的作用。研究细胞因子和遗传因子的作用。 微生物的毒力因子微生物的毒力因子 Microbial Viralence Factors 内毒素内毒素(lipopolysaccharide, LPS) G-菌胞壁外膜的脂多糖成菌胞壁外膜的脂多糖成 分（磷脂多糖蛋白质）。分（磷脂多糖蛋白质）。 十二烷基磺酸钠聚丙烯凝胶电泳十二烷基磺酸钠聚丙烯凝胶电泳 PAGE-SDS gel 银染色银染色 Silver stain 内毒素免疫印迹内毒素免疫印迹 LPS-i

4、mmuno-blotting 牙龈素牙龈素(gingipains) 最初称为胰酶样蛋白酶最初称为胰酶样蛋白酶(trypsin-like protease, TLP),又称卟啉素又称卟啉素(porphypains) 存在于存在于Pg的外膜、膜泡或胞外的一组蛋白酶的外膜、膜泡或胞外的一组蛋白酶 超速离心超速离心(10000g20min,4)提取胞外膜提取胞外膜 泡泡高凝胶液相色谱法高凝胶液相色谱法(GF-HPLC)分离纯分离纯 化。化。 精氨酸牙龈素精氨酸牙龈素(Arginine-gingipains, Rgps): 特异性切断蛋白质与精氨酸残基结合的肽段，由特异性切断蛋白质与精氨酸残基结合的肽段

5、，由 rgpA(前肽区、蛋白酶区、粘附区前肽区、蛋白酶区、粘附区)和和rgpB(无粘无粘 附区附区)二个基因编码二个基因编码 赖氨酸牙龈素赖氨酸牙龈素(Lysine-gingipain, Kgp): 特异性切断蛋白质与赖氨酸残基结合的肽段，由特异性切断蛋白质与赖氨酸残基结合的肽段，由 kgp(前肽区、蛋白酶区、粘附区前肽区、蛋白酶区、粘附区)单个基因编码单个基因编码 Pg同源突变株的性状改变同源突变株的性状改变 突变株突变株性状改变性状改变 rgpA粘附能力部分丧失粘附能力部分丧失 降解降解I型胶原能力丧失型胶原能力丧失 rgpA、rgpB抑制中性粒细胞功能丧失抑制中性粒细胞功能丧失 菌毛缺失

6、菌毛缺失 kgp菌落无法变黑菌落无法变黑(影响利用血红蛋白影响利用血红蛋白) rgpA、rgpB、kgp胞外蛋白水解活性丧失胞外蛋白水解活性丧失 牙龈素功能牙龈素功能 有助于粘附定植：对纤维蛋白的亲和力。有助于粘附定植：对纤维蛋白的亲和力。 毒性作用：破坏宿主组织细胞的活性成分毒性作用：破坏宿主组织细胞的活性成分(蛋白、多肽蛋白、多肽)、 降解胶原；促进缓激肽释放，提高血管通渗性，增加降解胶原；促进缓激肽释放，提高血管通渗性，增加 龈沟液量，组织水肿。龈沟液量，组织水肿。 帮助细胞生长：将组织蛋白质降解为短肽链，扩大细帮助细胞生长：将组织蛋白质降解为短肽链，扩大细 菌营养摄取范围，为细菌生长和

7、毒力发挥提供养分。菌营养摄取范围，为细菌生长和毒力发挥提供养分。 干扰宿主免疫反应：影响中性白细胞功能，降解宿主干扰宿主免疫反应：影响中性白细胞功能，降解宿主 细胞的细胞的LPS受体受体CD14，降解细胞因子降解细胞因子IL-1、IL-6、 IL-8及及TNF等。等。 菌毛亚单位蛋白结构基因菌毛亚单位蛋白结构基因(fim A) 粘附有关的毒力因子粘附有关的毒力因子 纤毛素纤毛素 (fimbrilin) 粘粘附素附素 (adhesin) 血细胞凝集血细胞凝集 素素(hemagglutinin) 1988年年Dickinson等首先获得含编码等首先获得含编码Pg 纤毛素基因的克隆质粒纤毛素基因的克

8、隆质粒PUC 13Bg12.1，该基，该基 因为染色体上的单拷贝基因，它的氨基酸序列因为染色体上的单拷贝基因，它的氨基酸序列 与其他菌毛无同源性，可利用该特异基因作探与其他菌毛无同源性，可利用该特异基因作探 针鉴定针鉴定Pg，可进一步研究，可进一步研究Pg菌毛的致病作用。菌毛的致病作用。 胶原酶基因胶原酶基因(prtc) Pg的胶原酶能降解的胶原酶能降解I型胶原，破型胶原，破 坏牙周组织附着。坏牙周组织附着。 已测知表达胶原酶活性的已测知表达胶原酶活性的prtc基基 因序列，它存在于因序列，它存在于Pg的三种主要血清型的三种主要血清型 中，编码中，编码1个个37501.38蛋白质。蛋白质。 白

9、细胞毒素基因白细胞毒素基因(lkt A、B、C、D) Aa是口腔中唯一能产生白细胞毒素是口腔中唯一能产生白细胞毒素 (leukotoxin,LKT)的细菌，白细胞毒素仅能杀的细菌，白细胞毒素仅能杀 死人或灵长类的多形核白细胞、单核细胞和死人或灵长类的多形核白细胞、单核细胞和 巨噬细胞，抑制破坏宿主的免疫防御机制。巨噬细胞，抑制破坏宿主的免疫防御机制。 现已克隆和测知现已克隆和测知lkt A的序列，且在的序列，且在 受体菌中得到表达。编码毒素结构，激活白受体菌中得到表达。编码毒素结构，激活白 细胞毒素。细胞毒素。 宿主因子宿主因子 Host Factors 细胞因子细胞因子(cytokines)

10、 细胞生物学细胞生物学 细胞因子细胞因子cytokine(CK) 免疫学免疫学淋巴因子淋巴因子lymphokine interleukincytikine(LI) 血液学血液学集落刺激因子集落刺激因子colony stimulation factor(CSF) 分子生物学分子生物学生长因子生长因子growth factors(GFS) 活化的活化的免疫细胞免疫细胞和某些和某些基质细胞基质细胞分泌的微量分泌的微量 生物活性物质。生物活性物质。 本质是本质是蛋白质蛋白质或或多肽多肽。 在体内发挥广泛的在体内发挥广泛的生物学作用生物学作用，与生长、分，与生长、分 化、免疫、肿瘤、造血和创伤愈合等多种

11、生化、免疫、肿瘤、造血和创伤愈合等多种生 理、病理状态有关。理、病理状态有关。 正常情况下发挥广泛正常情况下发挥广泛生理功能生理功能，一旦失调异，一旦失调异 常分泌，又与常分泌，又与疾病相关疾病相关。 目前发现的细胞因子有目前发现的细胞因子有10余族，余族， 每族又有若干亚族，共每族又有若干亚族，共100多种，功能多种，功能 大多已阐明，部分已克隆成功，其基因大多已阐明，部分已克隆成功，其基因 定位、结构与受体结合机制等均有大量定位、结构与受体结合机制等均有大量 研究。研究。 6 白介素白介素(1-18型糖蛋白型糖蛋白)(interleukin, IL) 6 肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子(tumo

12、r nocrosis factor, TNF) 6 粘附分子粘附分子(adhesion molecule, AM) 6 干扰素干扰素(interferan, IFN) 6 转化生长因子转化生长因子-(transforming growth factor- , TGF- ) 6 成纤维细胞生长因子成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs) 细胞因子作用特点细胞因子作用特点 4特异性特异性(自分泌、旁分泌作用自分泌、旁分泌作用) 对靶细胞存在不同程度特异性。对靶细胞存在不同程度特异性。 4多样性、多功能性多样性、多功能性 对不同靶细胞、不同浓度或不同生理状

13、态靶对不同靶细胞、不同浓度或不同生理状态靶 细胞可有不同作用。细胞可有不同作用。 4整体性整体性 对细胞、组织的调控不是仅靠对细胞、组织的调控不是仅靠1种，而是种，而是多因多因 子参与子参与及及多步骤反应多步骤反应，由几种因子协同或拮由几种因子协同或拮 抗配合形成网络抗配合形成网络(network)发挥作用。发挥作用。 遗传因子遗传因子(genetic factors) 基因水平阐明牙周病发生、基因水平阐明牙周病发生、 发展和流行规律。发展和流行规律。 细菌是引发牙周炎必不可少的因素，但细菌是引发牙周炎必不可少的因素，但 不是唯一因素，宿主也起重要作用。不是唯一因素，宿主也起重要作用。 单纯遗

14、传能为患严重牙周炎提供单纯遗传能为患严重牙周炎提供50%以以 上危险性，如：上危险性，如： 白细胞减少症白细胞减少症 白细胞粘附缺陷病白细胞粘附缺陷病 Down综合征综合征 掌跖角化掌跖角化牙周破坏综合征牙周破坏综合征 牙周病的基因研究牙周病的基因研究 6号染色体号染色体组织相容性位点变异组织相容性位点变异 产生产生IgG2能力降低，能力降低， IgG2是保护性的，能调理识别是保护性的，能调理识别 细菌，以利吞噬杀死细菌，以利吞噬杀死。 染色体染色体1q H131残基多态性残基多态性 组氨酸组氨酸纯合子纯合子 吞噬细胞识别吞噬细胞识别IgG2的的 hFcrRa 受体亲和力受体亲和力高高 (Ig

15、G包裹包裹的致病的致病 菌易被吞噬清除菌易被吞噬清除) 精氨酸精氨酸纯合子纯合子 受体亲和力低受体亲和力低 组组/精氨酸精氨酸杂合子杂合子 亲和力居中亲和力居中 染色体染色体2q 13的的IL-1基因基因多态性多态性 产生的产生的IL-1约为该基因阴性的约为该基因阴性的4倍，倍，40 岁后患重度牙周炎的可能性是阴性个体岁后患重度牙周炎的可能性是阴性个体 的的20倍倍 6号染色体号染色体TNF-基因基因多态性多态性 产生大量产生大量TNF-，增强对感染的反应性增强对感染的反应性 核酸杂交法核酸杂交法 (molecular hybridization) 检测牙周病相关细菌检测牙周病相关细菌 概概

16、述述 细菌分类学四个水平细菌分类学四个水平 w 细菌形态和行为水平：显微结构、运动性、细菌形态和行为水平：显微结构、运动性、 酶、生化及营养需要等酶、生化及营养需要等 w 细菌组分水平：胞壁组分、脂类、细胞色细菌组分水平：胞壁组分、脂类、细胞色 素及噬菌体系分析素及噬菌体系分析 w 蛋白质水平：氨基酸系列、可溶性蛋白凝蛋白质水平：氨基酸系列、可溶性蛋白凝 胶电泳及血清学胶电泳及血清学 w 基因水平：基因水平：GC mol%，DNA-DNA杂交，杂交， 质粒及遗传物质的转导质粒及遗传物质的转导 牙周病有关的特殊细菌牙周病有关的特殊细菌 证据充分的致病菌中等证据的致病菌 伴放线放线杆菌伴放线放线杆

17、菌Aa直肠弯曲菌直肠弯曲菌 (Actinobacillus actinomycetemcomitans) (campylobacter rectus) 牙龈卟啉单胞菌牙龈卟啉单胞菌Pg缠结优杆菌缠结优杆菌 (Porphyromonas gingivalis)(Eubacterium nodatum) 福塞似杆菌福塞似杆菌Bf具核梭杆菌具核梭杆菌Fn (Bacteroides forsythus)(Fusobacteruim nucleatum) 中间普氏菌中间普氏菌Pi (prevotella intermedia) 微小消化链球菌微小消化链球菌Pm (Peptostreptocoscus m

18、icros) 中间链球菌群中间链球菌群 (Intermedius streptococci) 牙密螺旋体牙密螺旋体Td (Treponema denticola) 常规方法不能鉴定牙周大量标本细菌的原因：常规方法不能鉴定牙周大量标本细菌的原因： X大多为厌氧菌大多为厌氧菌 X培养条件要求高培养条件要求高 X鉴定繁杂鉴定繁杂 X每牙周袋至少取每牙周袋至少取2个区样本个区样本 X每样本至少分离每样本至少分离10株以上可疑菌株以上可疑菌 原理原理 所有生物体都以所有生物体都以DNA形式通过形式通过4种碱基种碱基 顺序来贮存遗传信息，同种生物含相同的顺序来贮存遗传信息，同种生物含相同的DNA序序 列，

19、生物种差别越大，列，生物种差别越大，DNA碱基顺序差别越大碱基顺序差别越大。 鸟嘌呤鸟嘌呤 腺嘌呤腺嘌呤 胞嘧啶胞嘧啶 胸腺嘧胸腺嘧 啶啶 G A C T C T 示踪剂标记的特定碱基序列的核酸片段，示踪剂标记的特定碱基序列的核酸片段， 能和互补碱基配对、特异地结合。能和互补碱基配对、特异地结合。 w 4种核苷酸组成种核苷酸组成DNA w 2条互补链绕成双螺旋结构条互补链绕成双螺旋结构(氢键氢键)严严 格配对规律牢固结合，使格配对规律牢固结合，使DNA具遗传具遗传 信息贮存库功能（恒定性、专一性）信息贮存库功能（恒定性、专一性） w DNA上相邻上相邻3个核苷酸编排个核苷酸编排1个密码子，个密

20、码子， 决定决定1个特定氨基酸个特定氨基酸 w DNA核苷酸顺序决定蛋白质的氨基酸核苷酸顺序决定蛋白质的氨基酸 顺序决定细胞结构和功能顺序决定细胞结构和功能 核酸探针核酸探针(probe) 定义定义 能与特定核酸序列发生特异性互补能与特定核酸序列发生特异性互补 的已知核酸片段，用于检测待测样品中是否的已知核酸片段，用于检测待测样品中是否 存在与探针相同或相近的存在与探针相同或相近的DNA序列。序列。 牙周病相关菌的核酸探针是牙周病相牙周病相关菌的核酸探针是牙周病相 关菌染色体关菌染色体DNA上的有种属特异性的一小段上的有种属特异性的一小段 DNA（或（或RNA）分子的碱基序列，为带标记）分子的

21、碱基序列，为带标记 的单股核苷酸，能以互补方式与相应的单股核苷酸，能以互补方式与相应DNA键结键结 合。用已知细菌的合。用已知细菌的DNA探针去探测未知细菌的探针去探测未知细菌的 DNA，若能杂交形成，若能杂交形成DNA双链则认为该菌为双链则认为该菌为 与探针相同的菌。与探针相同的菌。 放射性同位素标记：如放射性同位素标记：如 32P、35S、3H 灵敏度高灵敏度高 理化影响小理化影响小 污染环境污染环境 使用某些半抗原：如使用某些半抗原：如 生物素、地高辛、荧光生物素、地高辛、荧光 素素 特异性较低特异性较低 敏感性较低敏感性较低 合成小段单链合成小段单链DNA方法日臻完善方法日臻完善 寡核

22、苷酸的化学合成可由高度自动化寡核苷酸的化学合成可由高度自动化 的仪器完成的仪器完成 核酸杂交技术得到发展核酸杂交技术得到发展 探针类型探针类型 w全基因探针：属内代表菌株分离出全基因探针：属内代表菌株分离出DNA并进行标记，制并进行标记，制 备简便，特异性较差，有时可与相近属菌种发生杂交备简便，特异性较差，有时可与相近属菌种发生杂交 w克隆克隆DNA片段探针片段探针 随意探针：代表菌随意探针：代表菌DNA用限制性内切酶酶切，随意克隆用限制性内切酶酶切，随意克隆 一些片段，找到仅能与本属内菌株杂交的一些片段，找到仅能与本属内菌株杂交的DNA片段片段 特异性高，但需大量试验方能验证其特异性特异性高

23、，但需大量试验方能验证其特异性 w特定探针：克隆属内代表菌特异性蛋白或毒力因子的基特定探针：克隆属内代表菌特异性蛋白或毒力因子的基 因，从该基因中取一段作为探针，检验致病菌具独特作因，从该基因中取一段作为探针，检验致病菌具独特作 用，但需对其特异性、敏感性验证用，但需对其特异性、敏感性验证 探针的验证探针的验证 w 特异性验证：特异性验证： 必须与必须与50种菌属的种菌属的80300株菌株进行杂交株菌株进行杂交 必须与相近细菌属中的大量菌间排除必须与相近细菌属中的大量菌间排除“交叉杂交交叉杂交” 如伴放线放线杆菌嗜血杆菌属菌株如伴放线放线杆菌嗜血杆菌属菌株 w 敏感性验证：敏感性验证： 必须与

24、同属各地区分离的必须与同属各地区分离的100株以上菌种进行杂株以上菌种进行杂 交交 如核酸杂交结果与生化反应鉴定结果有出入，应如核酸杂交结果与生化反应鉴定结果有出入，应 进一步验证生化结果。进一步验证生化结果。 寡核苷酸寡核苷酸(oligonucleotide)探针序列探针序列 细菌 探针名称 序列 AaAa-2CTTCGGGCACYAGGGCTAAACCCC PgPg-1CAATACTCGTATCGCCCGTTATTC Pg-3CTGTGGAATCTTGACGGTATATCG Pg-4GTATAAAAGAAGTTTAAAYCCTT Pg-5CCGATGCTTATTCTTACGGTACAT P

25、g-6CCTTAGGACAGTCTTCCTTCACGC BfBf-2CGTATCTCATTTTATTCCCCTGTA Bf-4CTGTAGAGCTTACACTATATCGCA PiPi-1GGTCCTTATTCGAAGGGTAAATGC Pi-2CCCTAGGYGCGCTCCTCGCGGTTA 特定特定DNA片段探针序列（基因探针）片段探针序列（基因探针） 细菌 靶基因 序列 长度 AaLkta5-CAGCAAGCTGCACAGTTTGCAAA-3238bp 5-CATTAGTTAATGCCGGGCCGTCT-3 16Sr DNA 5-GCTAATACCGCGTAGAGTCGG-3443bp

26、5-ATTTCACCCTCACTTAAAGGT-3 16Sr DNA 5- CTCAGAGATGGTTTGTGCC-3273bp 5-AGATTCACTCCCCATCGCTG-3 Pg Fim A5-ATAATGGAGAACAGCAGGAA-3131bp 5-TCTTGCCAACCAGTTCCATTGC-3 Prt C5-ACAATCCACGAGACCATC-3584bp 5-TTCAGCCACACCGAGACG-3 16Sr DNA 5-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3404bp 5-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3 续表 细菌 靶基因 序列 长度 Pg16Sr R

27、NA 5-GCGTATGCAACTTGCCTTAC-3518bp 5-GTTTCAACGGCAGGCTGAAC-3 Fn50475-CAAATGCTTGTGTCAATAATACT-30.5Kb 5-TTTAGAAGAAATGGTAGAATAAT-3 505905-ATTGTGGCTAAAATTASTAGTT-31Kb 5-ACCCTCACTTTGAGGATTATAG-3 Pi 18Sr RNA 5-CCTAATACCCGATGTCCACA-3855bp 5-AAGGAGTCAACATCTCTGTATCC-3 TdTdpA5-AAGGCGGTAGAGCCGCTCA-3311bp 5-AGCCGC

28、TGTCGAAAAGCCA-3 PCR扩增扩增16SrRNA 基因病原菌检测遗传学基因病原菌检测遗传学 分类分类 rRNA是细胞中最多的一种是细胞中最多的一种RHA，很多很多 分子组成核蛋白体分子组成核蛋白体(核糖体核糖体)，rRNA分子大小分子大小 一般用超速离心的沉降系数一般用超速离心的沉降系数S表示，表示，S越大，越大， 分子也越大。分子也越大。 16SrRNA基因：细菌染色体上编码基因：细菌染色体上编码rRNA相相 对应的对应的DNA序列序列 4保守区稳定性（细菌共有，称保守区稳定性（细菌共有，称“分子化分子化 石石”） 4可变区特异性（保守区间有可变区特异性（保守区间有V1V10可变可变 区，含种属差异信息，如出现区，含种属差异信息，如出现3个碱基以上个碱基以上 差异，便可判定不同属）差异，便可判定不同属） 4