枯萎病生防菌地衣芽胞杆菌的生物学特性

1、枯萎病生防菌地衣芽胞杆菌的生物学特性摘要：研究了枯萎病生防菌地衣芽胞杆菌fjat-4菌株在不同温度下的菌落生长特性、生长动力学及其对尖孢镰刀菌fjat-135菌株抑制作用的浓度效应和温度效应。结果表明，fjat-4菌株的菌落、菌体的生长都表现为在20以下的环境中生长缓慢、生长曲线为直线型，在25-30时生长较良好、生长曲线为对数型，最佳的生长温度为35-40；不同温度培养的fjat-4菌株培养液对fjat-135菌株都具有较强的抑制作用，且抑菌作用的强弱差异远小于其活菌数之间的差异；温度对fjat-4菌株抑制fjat-135菌株的作用有显著影响，在15条件下，fjat-4菌株对fjat-135

2、菌株的抑制作用最弱，在20-30条件下，fjat-4菌株的抑菌作用相对较强，在35条件下，fjat-4菌株的抑菌作用最强。关键词：地衣芽胞杆菌 尖孢镰刀菌 生物学特性 温度效应 抑菌作用biological characteristics of fusarium-wilt-disease biocontrol bacterium, bacillus licheniformisabstract: the present paper dealt with the growth characteristics of biological control strain bacillus licheni

3、formis fjat-4 at different temperature, the effect of concentration and temperature on inhibitory effect of the strain fjat-4 on fusarium oxysporum fjat-135. the results showed that the strain fjat-4 grew very slowly and the growth curve was liner type when the temperature was under 20, grew well an

4、d the growth curve was logarithmic type when the temperature was over 25. the optimal temperature for the strain fjat-4 was 35-40. the cultured liquid of strain fjat-4 raised at different temperature could effectively inhibit the growth of the fusarium strain fjat-135, and the differences among the

5、inhibitions were far less than the differences among the concentrations of the cultured liquid. there was significant differences among effects of temperatures on the inhibitions of the bacillus strain fjat-4 on the fusarium strain fjat-135, the inhibitory effect was weakest at 15, obvious at 20-30

6、and highest at 35.key words: bacillus licheniformis; fusarium oxysporum; biological characteristics; temperature effect; inhibitory effect作物枯萎病是由尖孢镰刀菌（fusarium oxysporum schl.）侵染引起的一种毁灭性土传性病害，该病害在世界范围内广泛发生，可危害番茄、辣椒、棉花和西瓜、黄瓜等100多种植物1，导致植株枯死，给农作物生产造成严重损失，以瓜类枯萎病为例，发病地块一般减产10-30%，严重地块可达50-60%，甚至绝收2。目前，在

7、枯萎病的防治上，由于病原菌的多样性和变异性，尚缺乏有效的化学药剂和抗病品种，轮作抗病方法也因耕地资源的限制而不易实施。因此，利用微生物及其代谢产物进行的生物防治研究，是枯萎病防治的一个重要研究方向，其中芽胞杆菌便是被广泛利用的一类微生物3-10。地衣芽胞杆菌（bacillus licheniformis）是芽胞杆菌中具有较大应用潜力的菌种之一，在植物病害防治收稿日期：作者简介：葛慈斌（1973），男，副研究员，主要从事作物微生物防治研究（e-mail:benci2000）*通讯作者：刘波(1957)，男，博士，研究员，主要从事微生物生物技术与农业生物药物研究（e-mail: fzliubo）基

8、金项目：国家重点基础研究发展计划资助项目(2011cb111607)，农业部“引进国际先进农业科学技术”重点项目（2011-g25），福建省财政专项-福建省农业科学院科技创新团队建设基金(stif-y03)。11-14、动物饲料15-16和医药17等行业均取得了较好的应用研究成果。fjat-4菌株是本研究室从发生枯萎病的田块分离得到的一株地衣芽胞杆菌18，试验表明该菌株对尖孢镰刀菌具有较强的抑制作用，具备开发成生防菌剂的潜在优势。为了探索fjat-4菌株的生长特性及其抑菌作用的浓度效应和温度效应，以期为生防菌剂的研制和应用提供参考，作者测定了不同温度下fjat-4菌株的生长状况及其对尖孢镰刀菌

9、抑制作用的差异，现将结果报道如下。1 材料与方法1.1 菌株与培养基供试的生防菌地衣芽胞杆菌fjat-4菌株为本研究室分离、鉴定、保存的菌株，平板培养用营养琼脂培养基（即na培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%，nacl 0.5%，琼脂1.8%，ph=7.2），摇瓶培养用bpy培养基（蛋白胨1.0%，牛肉浸膏0.5%，酵母浸出物0.3%，葡萄糖0.5%，nacl 0.5%，ph=7.2）；指示菌西瓜枯萎病尖孢镰刀菌fjat-135是由本实验室从福建省永泰县患病的西瓜植株上分离而得到，培养基为土豆汁-蔗糖琼脂（pda）培养基。1.2地衣芽胞杆菌fjat-4菌株菌落生长特性接种活化后的fjat-

10、4菌株于bpy培养基，30、200rmin-1振荡培养，48h后停止培养，用血球计数板测定培养液的菌体数；取少量的培养液，用无菌水稀释成菌体数约为3.0102cfuml-1的菌悬液，吸取菌悬液0.2ml，涂布于不同的na培养基平板上；另用接种环沾取fjat-4菌株培养液原液，划线接种在na培养基平板上；分别将平板放置在15、20、25、30、35、40的培养箱内培养；各处理设3个重复，在接种后的24、48、72h和96h观察菌落生长情况，并从涂布接种的平板上，随机选取10个单菌落，测量其直径，分析温度对该菌株菌落生长的影响。1.3地衣芽胞杆菌fjat-4菌体生长温度动力学分析从活化fjat-4

11、菌株的na培养基平板上挑取菌落，悬浮于无菌水中，制成菌体数约4.3108cfuml-1的菌悬液；各取菌悬液2.0ml，接入bpy培养基（装瓶量为25ml250ml-1三角瓶），分别放置在15、20、25、30、35的温度条件下，200rmin-1振荡培养；于开始培养后的0、6、12、24、36、48、60、72h取样，用稀释涂布平板法计算培养液中的活菌数；各处理设3个重复，分析fjat-4菌株在不同温度下的菌体生长动力学特性。1.4地衣芽胞杆菌fjat-4对尖孢镰刀菌fjat-135抑制作用的浓度效应分析取1.3所述的在不同温度下培养72h的地衣芽孢杆菌fjat-4培养液，并用无菌水稀释100

12、倍，试验各培养液原液和100倍稀释液对fjat-135菌株的抑制作用；抑菌试验参照郝变青等19的方法，略加修改后进行，即分别将生防菌培养液原液、100倍稀释液与冷却至50熔融态的pda固体培养基以19相混合，摇匀，倒平板，以未接种生防菌的液体培养基与pda混合倒成的平板为ck；待平板凝固后，在平板中央接入一块预先培养7d的直径为0.6cm的病原菌菌片，倒置在28培养箱内培养；于处理后6d用“十”字形测量法测量病原菌的菌落直径，计算抑菌率。每处理及对照均重复3次，用dps统计软件进行统计分析。抑菌率计算公式：抑菌率=（ck菌落直径-处理组菌落直径）/（ck菌落直径-0.6）100%1.5地衣芽胞

13、杆菌fjat-4菌株对尖孢镰刀菌fjat-135菌株抑制作用的温度效应分析取地衣芽胞杆菌fjat-4培养液（菌体数约1.0108 cfuml-1），按照1.4的方法制含生防菌的培养基平板、接入病原菌菌片，分别将培养基平板倒置在15、20、25、30和35的培养箱内培养；于处理后的4、6、8d用“十”字形测量法测量病原菌的菌落直径，计算抑菌率。每处理及对照均重复3次，用dps统计软件进行统计，分析fjat-4菌株对fjat-135菌株抑制作用的温度效应。2 结果与分析1、地衣芽胞杆菌fjat-4菌株的菌落生长特性采用涂布法接种于na培养基平板的fjat-4菌株在不同温度下的菌落直径见表1和图1。

14、菌株fjat-4在不同温度下的菌落直径差异显著（p0.05），15下菌株几乎不生长，培养72h后平板上还未见有菌落长出；20下，培养72h后，菌落直径仅为0.08cm；25下，培养48h时，平板上还看不到有菌落长出，72h后菌落直径只有0.18cm；30以上，菌株生长较为正常，并且随着温度的升高和培养时间的延长，菌落直径逐渐增大，但不同的温度下、或者同一温度下的不同培养时间的菌落直径之间，差异均为显著。表1 fjat-4菌株在不同温度、不同时间培养培养后的菌落直径table 1 colonial diameter of strain fjat-4 at different cultured t

15、ime and temperature时间time（h）菌落直径colonial diameter（cm）152025303540240.00ac0.00bc0.00bc0.07cc0.21cb0.52ca480.00ad0.00bd0.00bd0.33bc0.55bb1.01ba720.00af0.08ae0.18ad0.47ac0.75ab1.20aa同一栏内，带相同的小写字母在duncans新复极差测验的多重比较p0.05时没有差异；同一行内，带相同的大写字母在duncans新复极差测验的多重比较p0.05时没有差异；下同。20253035图1 fjat-4菌株在不同温度下培养72h后的

16、菌落fig. 1 colony of strain fjat-4 at different cultured temperature after 72h划线接种于na培养基平板的fjat-4菌株在不同温度下的生长状况与用涂布法接种的相似，也表现为温度越高、时间越长，菌落越旺盛。用编号0-4表示菌株生长状况的级别，可将该菌株在不同温度、不同时间的生长状况归纳于表2。以菌株生长级别为指标，以温度为样本，构建矩阵，以绝对值距离为尺度，用最短距离法对菌落生长温度范围进行系统聚类。绝对值距离矩阵见表3，聚类结果见表4，聚类图见图2。当=6时，可将菌株的温度适应范围分为3类：第1类，15-20，低温区，在

17、该温区内，fjat-4菌株生长较差或几乎不生长；第2类，25-30，中温区，在该温区内，fjat-4菌株生长较好；第3类，35-40，高温区，在该温区内，fjat-4菌株生长旺盛。地衣芽胞杆菌fjat-4菌株在25以下温度生长缓慢，在25以上，随着温度的升高，生长加速，最适宜的温度为35-40。表2 地衣芽胞杆菌fjat-4菌株在不同温度、不同时间下生长状况table 2 growths of strain fjat-4 at different cultured time and temperature时间time（h）不同温度下菌落生长状况growths of colony at diff

18、erent temperature(n)15202530354024001234480122447202234496123待添加的隐藏文字内容23440-不生长，1-极少量生长，2-生长较差，3-生长较好，4-生长旺盛表3 绝对值距离矩阵(下叁角)table 3 absolute distance matrix (lower triangular)温度temperature（）202530354015420732595230141075351511861表4 聚类结果table 4 clustering resultstij距离distrance=6.001651243232144316551

19、9.5 图2 fjat-4菌株菌落生长温度范围聚类分析fig. 2 clustering analysis of colony growth temperature range of strain fjat-4 2、地衣芽胞杆菌fjat-4菌株生长温度动力学分析不同温度下，地衣芽胞杆菌fjat-4菌株培养过程中培养液活菌数的变化情况见表5。在15，fjat-4菌株几乎不生长，72h后，培养液中的活菌数只有1.0108cfuml-1，为刚接种时的3倍，没有出现对数增长；在20下，菌株生长较差，72h后培养液的活菌数为14.6108cfuml-1；在25和30较适宜于该菌株的生长，培养72h后，培

20、养液中活菌数达到35.4108cfuml-1和37.8108cfuml-1；35最适合于fjat-4菌株的生长，培养36h后，培养液中的活菌数就达到62.2108cfuml-1，之后活菌数呈现波浪式变化，至培养72h时的活菌数为55.2108cfuml-1，显著地比其它温度下的培养液活菌数大（p0.05）。表5 不同时间、不同温度培养地衣芽胞杆菌fjat-4菌株培养液中的活菌数table 5 numbers of viable cell in cultured solution of strain fjat-4 at different cultured time and temperatur

21、e 温度（）temperature活菌数numbers of viable cell（108cfuml-1）0h6h12h24h36h48h60h72h150.320.360.320.420.480.660.801.00d200.320.400.380.982.5011.2017.0014.60c250.320.300.622.1010.4030.4026.8035.40b300.320.462.405.8013.2027.2020.4037.80b350.320.542.6027.4062.2058.6075.2055.20a用最小二乘法，对菌株fjat-4在不同温度下生长曲线进行建模，结果

22、（图3）表明，在15时，该菌生长曲线呈直线型，方程为y = 0.0729x + 7.3721（r2 = 0.9175）；在20时，该菌生长曲线呈直线型，方程为y = 0.2918x + 7.0007（r2 = 0.9164）；在25时，该菌生长曲线呈对数型，方程为y = 7.068e0.0418x（r2 = 0.9235）；在30时，该菌生长曲线呈对数型，方程为y = 7.367e0.0366x（r2 = 0.9091）；在35时，该菌生长曲线呈指数型，方程为y = 1.3357ln(x) + 7.2632（r2 = 0.8949）。1520253035图3 fjat-4菌株在不同温度下的生长

23、曲线fig. 3 growth curve of strain fjat-4 at different cultured temperature为划分菌株fjat-4活菌数生长的温度范围，以时间为指标，以温度为样本，构建矩阵，以绝对值距离为尺度，用最短距离法对菌体数生长温度范围进行系统聚类。绝对值距离矩阵见表6，聚类结果见表7，聚类图见图4。当=81.17时，可将该菌株的温度适应范围分为3类：第1类，15-20，低温区，在该温区内，地衣芽胞杆菌fjat-4菌株菌体生长缓慢；第2类，25-30，中温区，在该温区内，地衣芽胞杆菌fjat-4菌株菌体数生长较良好；第3类，35，高温区，在该温区内，地

24、衣芽胞杆菌fjat-4菌株菌体数生长最佳。表6 绝对值距离矩阵(下叁角)table 6 absolute distance matrix (lower triangular)温度（）202530351543.020020102.100059.160025103.220060.200020.440030277.7000234.6800175.7200174.4800表7 聚类结果table 7 clustering resultstij距离=81.1714320.440022143.020033181.1700451215.6450 图4 fjat-4菌株菌体数生长的温度范围聚类fig. 4 c

25、lustering analysis of viable cell growth temperature range of strain fjat-43、地衣芽胞杆菌fjat-4对尖孢镰刀菌fjat-135抑制作用的浓度效应试验结果见图5。不同温度培养的fjat-4菌株培养液对尖孢镰刀菌fjat-135菌株都具有较强的抑制作用，处理后6d抑制率都大于69.9%；不同的处理之间，抑制率存在差异。25、30、35培养的fjat-4菌液原液对菌株fjat-135的抑制率，均显著大于15和20的培养液原液的抑制率（p0.05）；20、30、35培养的fjat-4菌液100倍稀释液对菌株fjat-135

26、的抑制率之间，不存在差异，但都大于15和25的培养液100倍稀释液的抑制率。15、30、35培养的fjat-4菌株培养液原液与100倍稀释液对菌株fjat-135的抑制作用之间，不存在显著差异；20下的培养液原液的抑制率显著小于100倍稀释液的抑制率，而25下的培养液原液的抑制率则显著大于100倍稀释液的抑制率（p0.05），但抑制率（77.1%和70.6%）之间的差异，远比培养液中活菌数的差异（100倍）小。baababbaaaabbaaaaaaaa图5 不同温度培养的fjat-4培养液对fjat-135菌株的抑制作用fig. 5 inhibitory effect of strain fj

27、at-4 cultured at different temperature on fusarium oxysporum , strain fjat-135同一条柱上，带不同的大写字母表示在相同的浓度下、不同的培养温度之间存在显著差异，带不同的小写字母表示在相同的培养温度下、不同的浓度之间存在显著差异(duncans新复极差测验的多重比较，p0.05)4、地衣芽胞杆菌fjat-4菌株对尖孢镰刀菌fjat-135抑制作用的温度效应试验结果见表8、图6。在15-35的系列温度下，菌株fjat-4对fjat-135菌株都具有较强的抑制作用，但不同温度下的抑制率之间，存在着差异。处理后4d，菌株fja

28、t-4培养液在35下对fjat-135菌株的抑制作用最强，30时的抑制作用最弱；处理后6d和8d，菌株fjat-4培养液在35下的抑制率仍显著大于其它温度下的抑制率，15下的抑制率最小，而20、25和30下的抑制率之间，则不存在显著差异（pf0.05（2，12），pt0.05（12）=2.179，tbx2px2=0.0536，表明温度对抑菌率的影响比处理时间对抑菌率的影响更重要。表9 二元线性回归方差分析表 table 9 variance analysis table of binary linear regression 变异来源dfssmsf值显著水平p回归2214.7773107.38

29、874.47840.03525离回归12287.752023.9793总的14502.529335.8950表10 偏回归方差分析表table 10 variance analysis table of partial regression变量variable回归系数regression coefficient标准系数standard coefficient偏相关partial correlation标准误standard errort值显著水平pby57.33336.56988.72680bx10.53330.65160.65250.17882.98270.0106bx20.19000.05

30、360.07070.77430.24540.80993 讨论微生物的生长易受温度、湿度等环境因素的影响。芽胞杆菌是单细胞型的生物，对温度的变化特别敏感，因此芽胞杆菌的生长具有明显的温度依赖性，有最低、最适宜和最高生长温度范围20。黄曦等对有较强抑制荔枝霜疫霉和荔枝炭疽菌作用的枯草芽孢杆菌on-6菌株的培养条件进行初步研究，结果表明，该菌株的最佳培养温度32-3421；章蕴慧等研究报道地衣芽胞杆菌w10菌株的最适培养温度为27-3022；纪明山和王毅婧发现地衣芽胞杆菌sdyt-79菌株的最佳发酵培养温度为24，20以下及32以上的温度均不利于该菌株的生长23；此外，胶冻样类芽胞杆菌ps04菌株、

31、枯草芽胞杆菌bsw03菌株、地衣芽胞杆菌ts-01菌株的最适生长温度分别为30、28和4024-26。由此可见，不同菌株的最佳培养温度均有不同，且差距较大；但较少见到有关芽胞杆菌的菌落生长与菌体量生长对温度的适应性是否一致方面的报道。芽胞杆菌的菌落形态是分类的依据之一27，菌落生长通常是质量（和/或数量）性状，表现在菌落的有无和大小上，而菌体生长是数量性状，常作为菌株生长速度的计量指标，都具有生物学特性上的研究意义。本研究对地衣芽胞杆菌fjat-4菌株在不同温度下的菌落、菌体生长的测定结果表明，fjat-4菌株的菌落、菌体的生长明显地受温度的影响，但表现出相似的温度适应性，即在20以下的环境中

32、生长缓慢、菌体数呈直线型增长，在25-30时生长较良好、菌体数呈对数型增长，最佳的生长温度为35-40。尽管温度对地衣芽胞杆菌fjat-4菌株的生长有着重要的影响，不同温度下发酵出的培养液菌体数量差异较大，但不同培养液对尖孢镰刀菌fjat-135菌株抑制率之间的差异远小于培养液之间的活菌数差异，而且同一培养液经稀释后，对fjat-135菌株抑制率的下降幅度也远小于活菌数的降低程度。这表明，在不同温度下培养的fjat-4菌株，其包括抑菌能力在内的菌株性状不会发生明显变化，同时也进一步明确了fjat-4菌株具有较强的抑制枯萎病菌作用，只要培养液中存在一定的活菌量，就能起到较好的抑菌效果。环境条件影

33、响生物农药的防治效果28。纪明山等研究发现，温度及湿度对枯草芽胞杆菌b36菌株可湿性粉剂防治番茄灰霉病的效果具有较大影响，当相对湿度在90%，温度在30（日温）/20（夜温）条件下，对番茄灰霉病的保护和防治效果分别为82.48%和63.01%、防效较好，在25/15条件下的保护和防治效果分别仅为45.06%和23.85%29。本研究结果也表明，温度也影响地衣芽胞杆菌fjat-4菌株对尖孢镰刀菌fjat-135菌株的抑制作用，从总体上看，在15条件下，fjat-4菌株对fjat-135菌株的抑制作用相对最弱，抑菌作用还随着处理时间的延长而减弱；在20-30条件下，fjat-4菌株的抑菌作用相对较

34、强，而且在处理期内，抑菌作用还有随着处理时间的延长而增强的趋势；在35条件下，fjat-4菌株的抑菌作用最强。这可能是因为尖孢镰刀菌的适宜生长温度比地衣芽胞杆菌的低，在温度较低（20以下）条件不利于fjat-4菌株的生长、较适宜于fjat-135菌株的生长，而温度较高（30以上）时适宜于fjat-4的生长、但不利于fjat-135菌株的生长。参考文献1 王政逸，李德葆尖孢镰刀菌致病菌营养体亲和群研究j浙江农业学报，2001，13（1）：72-772 郝晓娟，刘波，谢关林植物枯萎病生物防治研究进展j中国农学通报，2005，21（7）：319-322,3373 肖荣凤，刘波，史怀，等生防菌哈茨木霉

35、fjat-9040的gfp标记及土壤定殖示踪j植物保护学报，2011，38(6)：506-5124 余超，肖荣凤，刘波，等生防菌fjat-346-pa的内生定殖特性及对香蕉枯萎病的防治效果j植物保护学报，2010，37(6)：493-4985 郝晓娟，刘波，谢关林，等短短芽孢杆菌jk-2对番茄枯萎病的抑菌作用及其小区防效j中国生物防治，2007，23(3)：233-2366 林营志，刘国红，刘波，等香蕉枯萎病芽胞杆菌生防菌的筛选及其抑菌特性研究j福建农业学报，2011，26(6)：1007-10157 郭景旭，张辉，李子钦，等胡麻枯萎病生防芽孢杆菌筛选及抑菌效果研究j中国油料作物学报，2011

36、，33(6)：598-6028 车建美，刘波，蓝江林短短芽孢杆菌jk-2的gfp标记及其抑菌作用j中国生物防治，2010，26（2）：230-2349 付业勤，张科立，潘羡心，等内生拮抗细菌beb2的分子鉴定及其对香蕉枯萎病菌的抑制作用j热带作物学报，2009，30(1)：80-8510 葛慈斌，刘波，蓝江林，等生防菌jk-2对尖孢镰刀菌抑制特性的研究j福建农业学报，2009，24(1)：29-3411 唐丽娟，纪兆林，徐敬友，等地衣芽孢杆菌w10对灰葡萄孢的抑制作用及其抗菌物质j中国生物防治，2005，21(3)：203-20512 batrakov s g，rodionova t a，esipov s e，et